miR-92a靶向PTEN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖*

蔣佩佩，蔡徐山,2△，張春利，宦 宇，齊結(jié)華，吳守樂，樂江漫

1.上海市嘉定區(qū)婦幼保健院檢驗科，上海 201821；2.同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計，全球每年新增宮頸癌病例50多萬例，發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢，宮頸癌每年造成約30萬人死亡，其中85%發(fā)生在發(fā)展中國家，已嚴(yán)重影響女性的生存質(zhì)量[2]。因此，研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的預(yù)后和靶向治療指標(biāo)對提高宮頸癌患者的生存率具有重要意義。

微小RNA(miRNA)是在真核細(xì)胞及病毒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性染色體上的非編碼小分子單鏈RNA，長度為14～22個核苷酸[3]。miRNA通過與靶mRNA分子的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補(bǔ)序列結(jié)合誘導(dǎo)mRNA 降解或抑制翻譯[4]，調(diào)控基因表達(dá)。有研究表明，miRNA廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、物質(zhì)與能量代謝、免疫及炎性反應(yīng)等各種生命代謝活動[5-8]。miR-92a屬于miR-17-92基因簇，據(jù)報道，miR-92a參與胃癌、骨肉瘤、鼻咽癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9-13]。有研究表明，在宮頸癌組織、患者血清及細(xì)胞系中miR-92a均高表達(dá)[14-15]。ZHOU等[15]研究顯示，miR-92a可通過靶向抑癌基因FBXW7調(diào)控宮頸癌細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力。動物實驗證實，miR-92a可通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑降低小鼠免疫力，增強(qiáng)宮頸成瘤能力[16]。

據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測和功能分析，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)是miR-92a的可能靶標(biāo)[12]。然而，在宮頸癌中miR-92a經(jīng)該通路靶向PTEN的調(diào)節(jié)作用鮮見報道。本研究通過體外干預(yù)宮頸癌細(xì)胞系miR-92a水平，初步探索其在PTEN/PI3K/AKT通路中對宮頸癌細(xì)胞的影響，并探討相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa(上海攸碧艾細(xì)胞庫)；DMEM-高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美國Gibco公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR定量試劑盒(TaKaRa公司)；抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AKT、PTEN、GAPDH抗體(美國CST)；LipofectamineTM2000(Lip2000，美國Invitrogen公司)。miR-92a-3p inhibitor及其陰性對照、PTEN、內(nèi)參U6和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出HeLa與SiHa細(xì)胞，快速復(fù)蘇后立即重懸于含有10%FBS和1%雙抗(青霉素與鏈霉素各100 U/mL)的DMEM-高糖培養(yǎng)基中。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞隔天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞長至密度80%～90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板并用不含血清與雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度約60%時采用Lip2000進(jìn)行RNA序列轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染miR-92a-3p inhibitor(inhibitor組)及其陰性對照(NC組)，以未處理的宮頸癌細(xì)胞為空白對照組。轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后棄除含轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，加入Trizol 試劑，冰上裂解10 min，用移液槍吹打數(shù)次，充分裂解細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入氯仿，渦旋振蕩后4 ℃離心，取上層水相于離心管中，加入異丙醇后4 ℃離心，棄上清，收集RNA沉淀。沉淀用預(yù)冷75%乙醇洗滌后離心，棄上清，沉淀于冰上晾干，加入DEPC水充分溶解RNA。測定RNA濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄miRNA(條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)和mRNA(條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)，得到cDNA，然后以cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環(huán)。按照2-ΔΔCt公式，分別以GAPDH和U6為內(nèi)參計算PTEN mRNA和miR-92a的相對表達(dá)量?；蚣捌湟镄蛄幸姳?。

表1 引物序列

1.5細(xì)胞活率 采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活率。將細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞過夜貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h向每孔中加10 μL CCK-8試劑，每個時間段設(shè)3個復(fù)孔，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處各組細(xì)胞的吸光度(A)。

1.6細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI雙染法聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。將每組細(xì)胞以2×105個/孔接種于六孔板，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)36～48 h收集細(xì)胞，1×Binding Buffer洗滌3次，重懸細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min加入5 μL PI。實驗重復(fù)3次。

1.7Western blotting檢測PTEN和磷酸化-AKT(p-AKT)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入PIPA裂解液冰上反應(yīng)10 min，以低溫12 000 r/min離心10 min，提取上清蛋白裂解液。采用BCA法測定裂解液中蛋白濃度，調(diào)平蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸蛋白。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)。2%牛血清清蛋白(BSA)封閉1 h，TBST洗膜3次。加入一抗(PTEN、p-AKT和GAPDH抗體的稀釋度均為1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，加入熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后置于紅外激光成像儀顯影。

2 結(jié) 果

2.1RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)染效率 HeLa 細(xì)胞中，inhibitor組miR-92a相對表達(dá)量(0.030±0.001)較NC組(0.980±0.007)明顯下降(P<0.01)；SiHa細(xì)胞中，inhibitor組miR-92a相對表達(dá)量(0.010±0.001)較NC組(0.990±0.006)明顯下降(P<0.01)，說明HeLa 細(xì)胞、SiHa細(xì)胞中miR-92a-3p inhibitor均轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實驗。見圖1。

注：ns表示與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)；與NC組比較，aP<0.01。

2.2PTEN mRNA相對表達(dá)量 HeLa細(xì)胞中，inhibitor組PTEN mRNA相對表達(dá)量(1.830±0.050)較NC組(1.090±0.050)升高(P<0.01)。SiHa 細(xì)胞中，inhibitor組PTEN mRNA的相對表達(dá)量(1.670±0.040)較NC組(1.040±0.030)升高(P<0.01)。見圖2。

2.3抑制miR-92a表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞活率的影響 CCK-8試驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，inhibitor組在轉(zhuǎn)染48、72 h細(xì)胞活率均降低(P<0.05)，而NC組和空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：ns表示與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)；與NC組比較，aP<0.01。

注：與NC組轉(zhuǎn)染48 h時比較，aP<0.05;與NC組轉(zhuǎn)染72 h時比較，aP<0.01。

2.4抑制miR-92a表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 HeLa 細(xì)胞中，inhibitor組的細(xì)胞凋亡率[(16.54±0.78)%]高于空白對照組[(4.56±0.64)%]和NC組[(5.97±0.34)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SiHa細(xì)胞中，inhibitor組的細(xì)胞凋亡率[(15.69±0.64)%]高于空白對照組[(4.37±0.74)%]和NC組[(5.32±0.41)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 抑制miR-92a表達(dá)后SiHa和HeLa 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

2.5抑制miR-92a表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞PTEN、p-AKT表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，相比空白對照組，inhibitor組 PTEN蛋白表達(dá)升高，p-AKT的表達(dá)下降，NC組蛋白表達(dá)無明顯變化。見圖5。

圖5 抑制miR-92a表達(dá)后SiHa和HeLa細(xì)胞PTEN和p-AKT蛋白表達(dá)情況

3 討 論

miRNA是一類調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA，僅占蛋白編碼基因的1%，而調(diào)節(jié)約1/3基因的表達(dá)[17]。生物信息學(xué)分析表明，一個miRNA有數(shù)百個靶基因，同時涉及多個信號通路，miRNA可能參與幾乎所有生命代謝活動[18]。有研究表明，位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域的miRNA可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與、多階段的過程，人乳頭瘤病毒(HPV)感染是其最重要的發(fā)病因素，miRNA在此過程中也發(fā)揮了重要作用。HPV-DNA整合到宿主染色體引起染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及病毒致瘤蛋白的作用可能使miRNA的表達(dá)模式發(fā)生改變。miRNA的基因多態(tài)性和甲基化修飾也可增加癌癥的易感性[19]。此外，任何參與miRNA 加工的蛋白質(zhì)的改變都可能干擾前體miRNA的有效成熟和(或)影響miRNA變體(isomiR)的生物發(fā)生，并可能徹底改變miRNA的功能。miRNA加工蛋白的失調(diào)已在HPV誘導(dǎo)的早期癌癥中被觀察到，如Drosha、AGO2和TENT2等[20]，這表明miRNA可能參與了早期宮頸癌的發(fā)展。

有研究證實，miRNA在宮頸癌中表達(dá)失調(diào)，一些miRNA可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，如miR-17、miR-21、miR-135、miR-150、miR-155、miR-196、miR-378、miR-425[21]。作為miR-17-92基因簇家族中的一員，miR-92a在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力上扮演了不可或缺的角色。宮頸癌的體外實驗和動物實驗表明，miR-92a可經(jīng)由相關(guān)信號通路和靶向基因促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)侵襲力，發(fā)揮致癌作用[15-16]，但相關(guān)機(jī)制報道甚少。

為探討miR-92a在宮頸癌細(xì)胞中的作用，本研究向?qū)m頸腺癌HeLa和鱗癌SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor，RT-qPCR結(jié)果表明，miR-92a受到有效抑制。本研究中，CCK-8試驗和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，抑制miR-92a表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的活率下降，凋亡率升高，提示miR-92a對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展具有潛在的促進(jìn)作用。SU等[22]研究進(jìn)一步說明，miR-92a可通過抑制p21的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，突出了miR-92a在宮頸癌中的臨床意義。

PI3K/AKT通路是重要的細(xì)胞增殖信號通路，PTEN蛋白可使PI3K的產(chǎn)物三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)脫磷酸，從而下調(diào)該通路來維持生物體內(nèi)細(xì)胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡。PTEN/PI3K/AKT通路的失調(diào)已被證實參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-13]。生物信息學(xué)預(yù)測PTEN是miR-92a的可能靶標(biāo)，為了進(jìn)一步探討miR-92a是否通過PTEN/PI3K/AKT通路對宮頸癌細(xì)胞增殖與凋亡發(fā)揮作用，本研究通過抑制miR-92a表達(dá)后觀察PTEN mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN mRNA相對表達(dá)量升高，此結(jié)果與LI等[16]研究宮頸荷瘤小鼠的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果一致。另外，本研究通過Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-92a表達(dá)后PTEN蛋白表達(dá)量增加，p-AKT蛋白表達(dá)量降低。本研究結(jié)果表明，miR-92a可能靶向PTEN調(diào)控PI3K/AKT信號通路，miR-92a在宮頸癌中有類似癌基因的作用。隨后，本課題組嘗試在宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-92a以期進(jìn)一步驗證其作用，但由于miR-92a過表達(dá)效果不理想，尚未得出有效的研究結(jié)果。

綜上所述，抑制miR-92a的表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。miR-92a可能通過負(fù)向調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)類似癌基因的作用。miR-92a有可能成為宮頸癌治療的潛在靶點。