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    系統(tǒng)性硬化病患者血清lncRNA MEG3表達(dá)及其與Th17/Treg平衡的關(guān)系研究

    2022-08-29 02:34:36鈺,李
    關(guān)鍵詞:實(shí)測(cè)值性反應(yīng)調(diào)節(jié)

    郝 鈺,李 波

    濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東濟(jì)南 250012

    系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種結(jié)締組織病變,可累及皮膚、腎臟、心臟、消化道等,損害患者身心健康[1-2]。有研究認(rèn)為,SSc發(fā)病與免疫失調(diào)、環(huán)境、微小RNA(miRNA)、血管纖維化、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)等有關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在SSc中失衡,其可能通過(guò)影響免疫水平影響SSc發(fā)生、發(fā)展[5]。另外,lncRNA人母系表達(dá)基因3(MEG3)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中呈低表達(dá),其可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),進(jìn)而影響RA病變過(guò)程[6];而在SSc患者中,微小RNA-21(miR-21)可促進(jìn)纖維化,lncRNA MEG3可靶向調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)[7-8]。由此推測(cè),SSc患者中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平可能與Th17/Treg平衡有關(guān)。本研究旨在通過(guò)測(cè)定lncRNA MEG3在SSc患者血清中的表達(dá)情況,分析lncRNA MEG3與Th17/Treg平衡的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月本院診治的54例SSc患者作為SSc組。其中男8例,女46例;年齡25~57歲,平均(41.35±12.56)歲;病程3~24個(gè)月,平均(13.78±8.29)個(gè)月。另選取同期54例體檢健康者作為對(duì)照組,其中男10例,女44例;年齡25~57歲,平均(42.63±12.70)歲;無(wú)自身免疫性疾病史。SSc組與對(duì)照組性別、年齡等比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SSc組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合文獻(xiàn)[9]中的SSc診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)病程≤24個(gè)月,臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心血管疾病、急性感染者;(2)合并精神疾病、腫瘤者;(3)合并肝、腎原發(fā)性疾病者;(4)皮膚硬化且處于晚期、皮膚嚴(yán)重萎縮者;(5)哺乳期、妊娠期女性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求,獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且受試者及其家屬簽署知情同意書(shū)。

    1.2方法

    1.2.1標(biāo)本收集 分別收集健康體檢者、SSc患者清晨空腹外周血6~7 mL,分成兩份,一份置于含肝素抗凝劑的抗凝管內(nèi),用于Th17、Treg細(xì)胞百分比檢測(cè);另一份置于5 mL EP管內(nèi),自然凝集25 min后,3 800 r/min離心7 min(離心半徑為8 cm),分離血清,于-80 ℃冰箱中保存。

    1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞水平 取1.2.1中的抗凝血,按密度梯度離心法使用人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(上海雅吉生物科技有限公司)獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),利用RPMI 1640培養(yǎng)液(南京維森特生物技術(shù)有限公司)將PBMCs稀釋為1.5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀(型號(hào):FACSCantoⅡ,美國(guó)BD公司)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞百分比,求Th17/Treg比值。

    1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)血清lncRNA MEG3、miR-21、維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)mRNA、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)mRNA表達(dá)水平 解凍血清,按TRIzol試劑盒(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取總RNA,用超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell公司)按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上??道噬锟萍加邢薰?說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2×SYBR Green QPCR mix試劑盒(美國(guó)AMEKO公司)及RT-qPCR儀(CFX96型,美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清lncRNA MEG3、miR-21及Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平,lncRNA MEG3、RORγt、Foxp3以GAPDH為內(nèi)參,miR-21以U6為內(nèi)參,各引物序列見(jiàn)表1。

    表1 lncRNA MEG3、Foxp3、RORγt、miR-21及GAPDH、U6的引物序列

    2 結(jié) 果

    2.1兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較 與對(duì)照組相比,SSc組患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平、Treg細(xì)胞百分比降低(P<0.05),miR-21表達(dá)水平、Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg升高(P<0.05),見(jiàn)表2。兩組Th17(CD4+IL-17+)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞水平見(jiàn)圖1、2。

    表2 兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較

    注:A為對(duì)照組;B為SSc組;百分率為CD4+IL-17+/CD4+ T細(xì)胞比例。

    注:A為對(duì)照組;B為SSc組;百分率為CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ T細(xì)胞比例。

    2.2兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,SSc組患者血清RORγt mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

    表3 兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

    2.3SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg相關(guān)性 Pearson法分析顯示,SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清miR-21表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA及血清miR-21表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

    表4 SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關(guān)性

    2.4SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21的相關(guān)性 Pearson法分析顯示,SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān)(r=-0.564,P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    圖3 SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21相關(guān)性

    2.5影響SSc發(fā)生的影響因素分析 以是否發(fā)生SSc為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),采用Enter法納入和剔除變量(α剔除=0.10,α入選=0.05),以lncRNA MEG3(實(shí)測(cè)值)、miR-21(實(shí)測(cè)值)、Th17(實(shí)測(cè)值)、Treg(實(shí)測(cè)值)、RORγt mRNA(實(shí)測(cè)值)、Foxp3 mRNA(實(shí)測(cè)值)、Th17/Treg(實(shí)測(cè)值)為自變量,Logistic回歸分析顯示,lncRNA MEG3是影響SSc發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05),miR-21、Th17/Treg是影響SSc發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

    表5 Logistic回歸分析SSc發(fā)生的影響因素

    3 討 論

    SSc是一種多發(fā)于女性的自身免疫系統(tǒng)疾病,以內(nèi)臟纖維化、皮膚增厚為主要特征,病死率高[10-11],尋找與SSc發(fā)病相關(guān)因素并及時(shí)干預(yù)對(duì)改善患者生存情況有積極意義。

    既往研究發(fā)現(xiàn),miR-21在SSc血管病變及纖維增生性改變中起促進(jìn)作用,其可能是SSc的治療靶點(diǎn)[12]。lncRNA可調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫炎性反應(yīng),且lncRNA MEG3作為lncRNA的一員,其可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-21表達(dá),進(jìn)而影響銀屑病發(fā)生、發(fā)展[8,13]。有報(bào)道顯示,lncRNA MEG3在RA中表達(dá)下調(diào),其可能靶向調(diào)節(jié)有關(guān)基因進(jìn)而影響RA病理變化[14]。研究顯示,lncRNA MEG3在強(qiáng)直性脊柱炎中表達(dá)水平降低,其可能調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),進(jìn)而影響強(qiáng)直性脊柱炎病變進(jìn)程,lncRNA MEG3可能是治療強(qiáng)直性脊柱炎的潛在靶標(biāo)[15]。本研究探究了lncRNA MEG3、miR-21與SSc的關(guān)系,結(jié)果顯示,SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平較低,與其在RA患者中的表達(dá)情況一致[14],miR-21表達(dá)水平較高,與HENRY等[12]研究結(jié)果相符,提示lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)失調(diào)可能與SSc發(fā)生有關(guān)。由此推測(cè),lncRNA MEG3可能靶向調(diào)控miR-21,進(jìn)而調(diào)節(jié)血管病理變化,影響免疫炎性反應(yīng),從而在SSc病變過(guò)程中發(fā)揮作用,但相關(guān)機(jī)制仍需深入研究。

    免疫系統(tǒng)維持著機(jī)體對(duì)外界刺激的反應(yīng)與免疫耐受間的平衡,其中Th17/Treg平衡是保證免疫穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié),Th17/Treg在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化患者中較高,其可能在多發(fā)性硬化中起重要免疫調(diào)節(jié)作用[16]。RORγt、Foxp3分別是Th17、Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,RORγt影響Th17細(xì)胞分化及IL-17分泌,調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),而Foxp3可與染色體結(jié)合,調(diào)控多種基因表達(dá),在免疫功能、Treg細(xì)胞發(fā)育中具有重要作用[17-18]。本研究顯示,與體檢健康者相比,SSc患者Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg、血清RORγt mRNA表達(dá)水平較高,Treg細(xì)胞百分比及血清Foxp3 mRNA表達(dá)水平較低較低,與李丹等[16]、LEI等[19]、樂(lè)靜等[20]研究一致,提示Th17、Treg細(xì)胞、RORγt、Foxp3可能參與并影響SSc病理發(fā)展,分析可能原因,Th17細(xì)胞增多會(huì)增強(qiáng)免疫炎性反應(yīng),Treg細(xì)胞減少會(huì)降低免疫炎癥抑制作用強(qiáng)度,Th17、Treg細(xì)胞比例失衡,打破免疫平衡,Th17、Treg細(xì)胞在SSc疾病進(jìn)展中起免疫調(diào)節(jié)作用,而RORγt、Foxp3可能通過(guò)影響Th17、Treg細(xì)胞功能,調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),進(jìn)而在SSc中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

    此外,ZHENG等[21]報(bào)道顯示,miR-21可調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。本研究探討了lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、Th17/Treg的相關(guān)性,結(jié)果顯示SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt、Foxp3 mRNA均相關(guān),提示lncRNA MEG3、miR-21可能與RORγt、Foxp3、Th17、Treg、Th17/Treg共同影響SSc發(fā)病進(jìn)程。本研究還發(fā)現(xiàn),SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān),分析可能原因,lncRNA MEG3可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡,從而影響SSc病理進(jìn)展。Logistic回歸分析顯示,lncRNA MEG3表達(dá)降低,miR-21、Th17/Treg升高均會(huì)增加SSc發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),及時(shí)檢測(cè)上述指標(biāo)水平可能有助于及早診治SSc。

    綜上所述,lncRNA MEG3在SSc患者中表達(dá)下調(diào),與miR-21、Th17/Treg平衡密切相關(guān),為臨床診治SSc提供了新思路。但本研究樣本量較小,后期需增加樣本量,從多中心、多角度探討lncRNA MEG3與SSc的關(guān)系,以提高研究的可靠性。

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