逆轉(zhuǎn)錄聚合酶螺旋反應快速檢測蜱傳腦炎病毒方法的建立及初步評價*

閆美田，鄭雨桐，萬 楠

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110016

蜱傳腦炎病毒(TBEV)又名森林腦炎病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬中的烈性病毒，其基因組為單股正鏈RNA，長約11 kb，經(jīng)蜱叮咬傳播[1-2]，會引發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)橹饕卣鞯纳值貐^(qū)自然疫源性疾病[3]，感染者可出現(xiàn)發(fā)熱、劇烈頭痛、神經(jīng)功能紊亂、外周性弛緩性麻痹等癥狀，甚至死亡[4-5]，嚴重威脅人類健康。近年來，軍隊森林駐扎頻繁，林業(yè)人員和開發(fā)者采伐活動增多，加之森林游、野外游等旅游業(yè)的發(fā)展，蜱叮咬的概率大大增加，從而增加了TBEV感染的風險。為確保基層和野戰(zhàn)現(xiàn)場對TBEV進行早期防控，掌握最佳救治的良機，本研究擬建立逆轉(zhuǎn)錄聚合酶螺旋反應(RT-PSR)法，以對TBEV進行現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1主要試劑 2×EasyTaq PCR SuperMix、pGM-T克隆試劑盒、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、FlyCut SalⅠ、T7 High Efficiency Transcription Kit、EasyPure RNA Purification Kit、EasyPure Blood RNA Kit購自北京全式金生物技術有限公司，SYBR Green Ⅰ、DNase/RNase-Free Water、石蠟油購自北京索萊寶科學技術有限公司，Bst 3.0 DNA聚合酶購自NEB公司，甜菜堿購自Sigma公司。

1.2模板制備 在GeneBank中下載49種TBEV序列，通過BLAST分析選取保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)NS1基因保守性、同源性較高，因此參考TBEV森張株序列(NO.JQ650523)選取NS1基因上的310 bp序列(第2 892～3 201位核酸序列)由安徽通用公司人工合成基因片段，連接到pGM-T載體上(pGM-T克隆試劑盒，北京全式金生物技術有限公司)，并轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細胞中，以25%甘油進行菌液儲存，提取的質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ單酶切線性化、純化后通過體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)制備RNA標準品。

1.3引物設計 以TBEV森張株序列保守區(qū)NS1基因上的310 bp序列為模板，應用Primer 5.0設計一對螺旋引物(Ft/Bt)，該引物由PCR的正、反向引物(F/B)和植物序列(Nr/N)組成，Nr和N序列順序彼此相反，F(xiàn)和B的Tm值比Nr和N高5 ℃以上，以確保F和B與目的基因結(jié)合早于螺旋[5]，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。RT-PSR 檢測TBEV時所用引物序列和Tm值見表1。

表1 RT-PSR 檢測TBEV時所用引物序列和Tm值

1.4RT-PSR體系的建立及優(yōu)化 由于Bst 3.0 DNA聚合酶不是熱啟動酶，需要在冰上建立反應體系，根據(jù)先前實驗摸索出的成分及用量建立共25 μL的RT-PSR反應體系：8 U Bst 3.0 DNA聚合酶，2.5 μL的10×Isothermal Amplification Buffer Ⅱ，0.8 mol/L甜菜堿，4 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，F(xiàn)t、Bt各1.6 μmol/L，RNA模板1.0 μL，最后加DNase/RNase-Free Water補齊到25.0 μL。以TBEV基因組RNA為模板，根據(jù)已建立的反應體系進行RT-PSR，以DNase/RNase-Free Water為陰性對照。為了防止氣溶膠污染，在反應液上層加入25 μL的石蠟油,接下來在65 ℃恒溫金屬浴中反應55 min。擴增結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。由于瓊脂糖凝膠電泳需要配膠和電泳，操作復雜并且耗時長，為了更滿足基層現(xiàn)場的檢測條件，本研究通過加1.0 μL 1∶20稀釋過的SYBR Green Ⅰ到反應體系中，通過肉眼觀察顏色變化來快速判斷反應結(jié)果。在65 ℃金屬浴中反應55 min，對RT-PSR條件進行優(yōu)化，設置溫度梯度為60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃，Bst 3.0 DNA聚合酶濃度梯度為2、4、6、8、10、12 U，甜菜堿濃度梯度為0.2、0.5、0.8、1.1、1.4 mol/L,MgSO4濃度梯度為4、6、8、10 mmol/L，dNTPs濃度梯度為1.0、1.4、1.8、2.2 mmol/L，以上條件確定后將反應時間設定為30、35、40、45、50、55、60 min，根據(jù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度和清晰度來選出最佳反應條件。

1.5RT-PSR特異性及靈敏性分析 使用實驗室先前合成的融合基因(西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、 墨累谷腦炎病毒)和TBEV的RNA標準品在同等條件下應用RT-PSR進行檢測，驗證該方法的特異性。測定人工合成的TBEV RNA質(zhì)量濃度為107.341 ng/μL，進行10倍梯度稀釋(依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍)，分別取1 μL進行PCR和RT-PSR擴增，應用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證兩種方法的檢測限，并進行靈敏性比較。

1.6模擬全血標本檢測 由于TBEV是烈性病毒，不易收集臨床標本，因此選取體檢健康的全血標本為模擬標本的基質(zhì)，加入已知質(zhì)量濃度的TBEV RNA，制備7個濃度的模擬標本，全血中TBEV RNA的終濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6、107.34×10-7ng/μL，以純?nèi)獦吮咀鳛殛幮詫φ?。按照EasyPure Blood RNA Kit說明書進行RNA提取。

2 結(jié) 果

2.1RT-PSR體系的建立及優(yōu)化 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，TBEV基因組出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，陰性對照無條帶，TBEV基因組的SYBR Green Ⅰ由橙色變?yōu)榫G色，陰性組保持橙色不變，并且在紫外燈下TBEV基因組可見綠色熒光，陰性組無熒光。結(jié)果表明，SYBR Green Ⅰ可作為RT-PSR的指示劑(圖1)，驗證了建立的RT-PSR反應體系的可行性。在60～65 ℃條件下，61 ℃條帶最亮、最清晰；在同等溫度條件下分別加入2～12 U Bst 3.0 DNA聚合酶，結(jié)果顯示，6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶條帶最亮、最清晰；分別加入0.2～1.3 mol/L的甜菜堿，結(jié)果顯示0.5 mol/L濃度的甜菜堿結(jié)果最理想；4、6、8、10 mmol/L濃度梯度的MgSO4中，結(jié)果顯示8 mmol/L的結(jié)果最理想；確定dNTPs的濃度為1.8 mmol/L;在不同時間范圍內(nèi)進行反應(30～60 min),最終確定反應時間為55 min時最理想(圖2)。

注：A為 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M為5 000 DNA標記物，1為TBEV的RNA標準品，N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)；B為 SYBR Green Ⅰ在自然光下擴增產(chǎn)物的顯色結(jié)果；C為SYBR Green Ⅰ在紫外光下擴增產(chǎn)物的顯色結(jié)果；B、C中1、2為TBEV的RNA標準品，3、4為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A為優(yōu)化RT-PSR擴增的溫度；B為優(yōu)化Bst 3.0 DNA聚合酶的濃度；C為優(yōu)化甜菜堿的濃度；D為優(yōu)化MgSO4濃度；E為優(yōu)化dNTPs的濃度；F為優(yōu)化RT-PSR的反應時間；M為5 000 DNA標記物；N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

2.2RT-PSR特異性及靈敏性分析 電泳結(jié)果顯示，含有TBEV的RNA標準品才呈現(xiàn)標準的梯形條帶，而西尼羅病毒、乙型腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒的融合基因和陰性對照沒有明顯條帶,有TBEV的RNA標準品在自然光下SYBR Green Ⅰ由橙色變?yōu)榫G色，而融合基因和陰性對照在自然光下SYBR Green Ⅰ仍為橙色，只有TBEV的RNA標準品在紫外光下發(fā)出綠色熒光，結(jié)果表明，RT-PSR可特異檢測出TBEV(圖3)。已稀釋的模板分別進行PCR和RT-PSR，電泳結(jié)果顯示，PCR在107.34 ng/μL稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍時有條帶，當質(zhì)量濃度低于107.34×10-4ng/μL時無明顯條帶，RT-PSR在107.34 ng/μL稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍時有條帶，當質(zhì)量濃度低于107.34×10-6ng/μL時無明顯條帶，指示劑在自然光和紫外光下顯色結(jié)果與電泳結(jié)果相同，可見RT-PSR最低檢測限是PCR的100倍，見圖4。

注：A為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B為自然光下SYBR GreenⅠ的RT-PSR反應結(jié)果；C為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結(jié)果；M為5 000 DNA標記物，1為TBEV RNA，2為融合基因(西尼羅河病毒、日本腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒)；N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

注：A、B為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；C為自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結(jié)果；D為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結(jié)果；M為5 000 DNA標記物，1～8 TBEV RNA質(zhì)量濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 、107.34×10-8 ng/μL，N為陰性對照(DNase/RNase-Free Water)。

2.3模擬全血標本 RT-PSR檢測7種不同濃度的TBEV模擬全血標本，結(jié)果表明符合率為100%，見圖5。最低檢測限為107.341×10-5ng/μL，靈敏性比RNA標準品低10倍。

注:A為1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B為自然光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結(jié)果；C為紫外光下SYBR Green Ⅰ的RT-PSR結(jié)果；M為5 000 DNA標記物；1～7為質(zhì)量濃度分別為107.34×10-1、107.34×10-2、107.34×10-3、107.34×10-4、107.34×10-5、107.34×10-6 、107.34×10-7 ng/μL 的TBEV模擬全血標本；N為陰性對照(體檢健康者的純?nèi)獦吮?。

3 討 論

聚合酶螺旋反應(PSR)是2015年LIU等[6]團隊發(fā)明的一種新的等溫核酸擴增方法，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換功能、熱穩(wěn)定性及DNA聚合酶活性，以及甜菜堿解開DNA雙鏈的作用進行檢測，該方法只需要一對引物(Ft/Bt)，即在PCR的正、反向引物的5′端加上植物序列Nr/N，并且Nr和N序列彼此相反，從而實現(xiàn)反復的引物延伸(①→②、③→④)、解鏈(②→③、④→⑤)、置換(⑤)、卷曲(⑥)，接下來卷曲結(jié)構(gòu)的3′端繼續(xù)向前延伸(⑦)，最終通過自螺旋方式(⑧)大量擴增(圖6)，從而實現(xiàn)簡單快速、高靈敏性和特異性檢測。

目前,已有研究人員應用PSR方法進行細菌、真菌及病毒的檢測[7-11]，而先前適當研究對RNA病毒檢測時需要在反應前進行逆轉(zhuǎn)錄或者是在反應體系內(nèi)加入逆轉(zhuǎn)錄酶等才能實現(xiàn)PSR擴增，本研究建立的RT-PSR僅需一種酶，即Bst 3.0 DNA聚合酶，它不僅具有鏈置換活性，還具有耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶活性，在等溫條件下一種酶可同時實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴增。此外，PSR反應體系中加入顏色指示劑，可以通過陰陽性反應的顏色差異現(xiàn)場快速判斷實驗結(jié)果。

注：①→②、③→④為引物延伸，②→③、④→⑤為解鏈，⑤為置換，⑥為卷曲，⑦為延伸，⑧為通過自螺旋方式擴增。

TBEV分為3個亞型，歐洲型TBEV(TBEV-Eu)、西伯利亞型TBEV(TBEV-Sib)和遠東型TBEV(TBEV-FE)[4,12]，我國流行的主要是TBEV-FE，流行主要地區(qū)有吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古地區(qū)，新疆和云南也有病例出現(xiàn)[13]。目前TBEV感染的檢測方法有血清學方法及核酸檢測方法，但是血清學方法要求待檢驗品的抗原、抗體含量高，而且檢測靈敏度較低，易出現(xiàn)“窗口期”導致漏檢；核酸檢測方法主要是PCR，需要反復變溫循環(huán)和元件精密的復雜儀器，時間成本和經(jīng)濟成本較高，核酸檢測領域還有分子雜交等技術，但成本高昂、操作煩瑣。本研究建立RT-PSR在恒溫條件下只需一對特異性引物就可實現(xiàn)核酸大量擴增，具有高特異性、高靈敏性、節(jié)約時間和成本等優(yōu)點，可實現(xiàn)基層現(xiàn)場對TBEV的精準檢測，能夠?qū)BEV進行早期防控，對感染者進行早期治療，避免后遺癥,甚至死亡的發(fā)生。

本研究根據(jù)RT-PSR方法的原理，以TBEV NS1基因序列設計一對引物Ft/Bt,對反應條件及主要成分采用單因素變化法進行優(yōu)化，最終確定的反應條件為在25.0 μL的反應體系中：6 U的Bst 3.0 DNA聚合酶，0.5 mol/L的甜菜堿，8 mmol/L的MgSO4，1.8 mmol/L的dNTPs，1.0 μL的RNA模板，F(xiàn)t、Bt各1.0 μL，加入無菌無酶水補齊25.0 μL，61 ℃恒溫金屬浴中反應55 min。SYBR Green Ⅰ 能與雙鏈DNA結(jié)合，由橙色變?yōu)榫G色，紫外光下會發(fā)出熒光，但SYBR Green Ⅰ 會抑制PSR反應，因此需要反應結(jié)束后開蓋加入[14]。

當前的核酸擴增方法對于RNA需要事先進行逆轉(zhuǎn)錄,而RT-PSR檢測方法最佳反應溫度61 ℃，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性為30～68 ℃，正好包括了RT-PSR的最佳反應溫度,因此可以逆轉(zhuǎn)錄和擴增同時進行；當前的核酸擴增方法要么需要95 ℃初始變性，要么需要加入DNA解旋酶，而RT-PSR檢測方法只需加入甜菜堿，當達到反應溫度時，便可以使DNA雙鏈解開，達到單雙鏈的動態(tài)平衡。

由于TBEV是烈性病毒，不易收集標本，因此本研究制備了7種不同濃度模擬全血標本，用RT-PSR進行檢測，將檢測結(jié)果與加入RNA標準品進行對比，評價該方法檢測實際全血感染標本的能力。本研究結(jié)果表明，用該RT-PSR檢測模擬標本的符合率可達到100%，最低檢出濃度為107.341×10-7ng/μL，提示RT-PSR檢測方法可以對全血標本中微量的TBEV進行準確檢測。

綜上所述，RT-PSR檢測方法對TBEV具有良好的特異性和靈敏性，檢測限是PCR的100倍。此外，該方法所用儀器簡單、成本低(水浴鍋或者恒溫金屬浴)，只需要一種酶，通過觀察指示劑的顏色變化即可判斷結(jié)果，操作簡便，反應穩(wěn)定性高，實現(xiàn)了現(xiàn)場快速檢測，有助于基層對TBEV的早期診斷。