花青素生物合成途徑及關(guān)鍵酶研究進展

劉淑華，臧丹丹，孫燕,3，李金霞，趙恒田

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150038)

0 引 言

花青素(Anthocyanins)為黃酮類多酚化合物，廣泛分布于植物的果實、葉片、花瓣和種子中，是重要的植物次生代謝產(chǎn)物。花青素最早于1947年發(fā)現(xiàn)，截止目前，已陸續(xù)在藍靛果、黑枸杞、茶葉等7 000多種植物中發(fā)現(xiàn)了700余種不同種類的花青素[1]?；ㄇ嗨厥枪麑嵆墒斓臉酥?，因為大多數(shù)水果只在其成熟階段積累該化合物，對果實的品質(zhì)有重要影響[2]?；ㄇ嗨厥撬苄晕镔|(zhì)，其顏色隨著酸堿度的變化而產(chǎn)生差異?；ㄇ嗨厥怪参锘ê凸麑嵆尸F(xiàn)出多種多樣的色彩，不僅提高了植物的觀賞性，還可促進昆蟲授粉和種子傳播，對于植物的繁殖具有非常重要的意義。除此之外，花青素還能夠增強植物的抗性，提高植物抵抗病毒、細菌等生物脅迫，吸收過量可見光和紫外線照射，清除非生物脅迫下過量的活性氧[3]。對于人類而言，花青素具有豐富的功能活性。研究發(fā)現(xiàn)，花青素作為天然抗氧化劑，可以有效清除自由基，在抗氧化、抗衰老方面效果顯著，同時，對于抗炎癥、預(yù)防肥胖、預(yù)防慢性代謝性疾病、保護心血管及改善視力等也有良好的功效[4]。這些生物學(xué)功能使花青素具有極大的科研價值和經(jīng)濟價值，可廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，花青素逐漸受到科研工作者們的廣泛關(guān)注。目前，關(guān)于花青素生物合成的研究已經(jīng)成為植物次生代謝領(lǐng)域的熱點問題，對于提高植物花青素含量、利用生物技術(shù)培育新品種等具有重大意義。本文綜述了花青素的結(jié)構(gòu)和種類，重點對花青素的生物合成途徑及合成關(guān)鍵酶研究進展進行總結(jié)，旨在為深入研究花青素生物合成機制以及植物的分子改良提供參考。

1 花青素的結(jié)構(gòu)及種類

1.1 花青素的結(jié)構(gòu)

2-苯基苯并吡喃是花青素的基本母核單元，也被稱為花色基元(圖1)，含有一個苯并吡喃環(huán)(C環(huán))，一個融合芳香環(huán)(A環(huán))和一個苯基成分(B環(huán))。在陽離子形式下，花青素的C環(huán)上有兩個雙鍵，因此帶有正電荷，2-苯基苯并吡喃的3-、5-、7-位上通常會發(fā)生羥基取代[5]。與其他黃酮類物質(zhì)不同的是，花青素在游離狀態(tài)下是極不穩(wěn)定的，為了增加其穩(wěn)定性，花青素通常發(fā)生糖基化形成穩(wěn)定的花青素苷[4]。大多數(shù)植物中，花青素只發(fā)生O-糖基化，最近的報道中也發(fā)現(xiàn)了幾種存在C-糖基化的植物，糖基化水平的提高會大大增強花青素的穩(wěn)定性，花青素中糖的酰基化也可以促進其化學(xué)穩(wěn)定性[6]。另外，花色苷的吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)決定抗氧化能力，糖基化B 環(huán)結(jié)構(gòu)也可對抗氧化活性造成影響[7]。

注：圖1-8為A、C環(huán)碳位號；1′-6′為B環(huán)碳位號。Note:1-8 indicate the position number of carbon A and C;1′-6′ indicate the position number of carbon B.圖1 花青素基本結(jié)構(gòu)單元Fig.1 The basic structure of anthocyanins

1.2 花青素的種類

由于取代基團和取代位置的不同，花青素分為不同種類。1947年，法國科學(xué)家Jack博士首先在花生仁的包衣中發(fā)現(xiàn)花青素。目前，已在27個科、73個屬的7 000多種植物發(fā)現(xiàn)了700余種不同花青素。其中，最常見的花青素為矢車菊素(Cyanidin)，天竺葵素(Pelargonidin)、飛燕草素(Delphindin)、芍藥素(Peonidin)、矮牽牛素(Petunidin)和錦葵素(Malvidin)(表1)[6]。其中，矢車菊素在植物中分布最為廣泛，因此，在測量花青素含量時，通常以矢車菊色素作為標準。不同植物中，花青素種類和含量不盡相同，幾種常見植物中含量最高的花青素如表2所示[8]。

表1 六種常見花青素Table 1 Six kinds of common anthocyanins

表2 幾種常見植物中含量最高的花青素種類Table 2 Anthocyanins with the highest content in several common plants

2 花青素的合成途徑

花青素的生物合成是植物次生代謝中的重要分支，雖然不同物種中花青素的種類和積累模式不同，但其合成過程基本相同。關(guān)于花青素合成過程的研究在20世紀下葉就已進入相對成熟階段[9]，目前，在擬南芥、矮牽牛、紫甘藍等植物中已被基本揭示。一般來說，花青素的合成主要分為五個階段(圖2)：

圖2 花青素合成途徑Fig 2 Anthocyanin synthesis pathway

第1階段：類黃酮代謝的初始反應(yīng)。苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)、肉桂酸羥化酶(Cinnamate4-hydroxylase,C4H)、香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarateCoAligase,4CL)的作用下生成香豆酰輔酶A(4-coumarateCoA)。這一階段為類黃酮代謝共有[10]。

第2階段：類黃酮代謝的重要反應(yīng)。查爾酮在植物中含量很少，但其在類黃酮代謝過程中發(fā)揮重要作用，可為黃酮類化合物的合成提供碳骨架。查爾酮由查爾酮合成酶(Chalconesynthase,CHS)催化丙二酰輔酶A和香豆酰輔酶A生成，隨后，查爾酮異構(gòu)酶Chalconeisomerase,CHI)將查爾酮異構(gòu)成三羥基黃烷酮，黃烷酮-3-羥化酶(Flavanone-3-hydroxylase,F3H)將三羥基黃烷酮進一步羥基化形成二氫黃酮醇。二氫黃酮醇在不同酶的催化作用下生成不同的物質(zhì)，其中一部分通過類黃酮-3′-羥化酶(Flavonoid-3′-hydroxylase,F3′H)將B環(huán)3′位羥基化生成矢車菊素的前體物質(zhì)二氫槲皮素，還有一部分通過類黃酮-3′,5′-羥化酶(Flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)將B環(huán)3′，5′位置羥基化，生成飛燕草素的前體物質(zhì)二氫楊梅黃酮[11]。

第3階段：花青素的合成。二氫黃酮醇、二氫槲皮素和二氫楊梅黃酮在二氫黃酮醇還原酶(Dihydroflavonol-4-reductase,DFR)和花青素合成酶(Anthocyanidinsynthase,ANS)作用下形成有色花青素，這一過程通常需要亞鐵離子的存在[6]。在植物細胞中花青素通常不能以單體的形式存在，因此他們往往會與糖苷結(jié)合，在類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(Uridinediphosphateglucose-flavonoidglucosyltransferase,UFGT)的催化下轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的花青素苷[10]。

第4階段：花青素的骨架修飾。花青素在被植物正式利用之前通常需要經(jīng)過結(jié)構(gòu)上的修飾。絕大部分花青素的3位都會被UFGT糖基化，除此之外，某些植物花青素的5位或7位，也會在類黃酮5-葡糖基轉(zhuǎn)移酶或類黃酮7-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下發(fā)生糖基化?；ㄇ嗨仵；D(zhuǎn)移酶在花青素的?；揎椫邪l(fā)揮重要作用，它可以催化芳香酸或脂肪酸與花青素結(jié)合，從而使花青素更穩(wěn)定且更易溶于水，還可以改變其吸收波長。經(jīng)糖基化修飾的花青素繼續(xù)被?；髸?dǎo)致花的顏色變?yōu)樗{色或紅色[12-13]。

第5階段：花青素的運輸和積累。花青素的合成過程和修飾作用在細胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行，然后運輸?shù)揭号葜袃Υ妗Ｄ壳?，對花青素運輸和積累的機制還沒有深入的研究。據(jù)報道，谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-Transferase,GST)可催化谷胱甘肽與花青素苷結(jié)合或GST作為載體將花青素苷運輸至液泡膜，位于液泡膜上的多藥耐藥抗性相關(guān)蛋白識別花青素苷并將其跨膜轉(zhuǎn)運至液泡。除此之外，基質(zhì)金屬蛋白酶及液泡的產(chǎn)生過程也與花青苷的運輸和積累密切相關(guān)。植物細胞還可以利用膜包被囊泡將花青素分子傳送到液泡中，該過程不需要GST和多藥耐藥抗性相關(guān)蛋白參與。目前我們對花青素苷轉(zhuǎn)運的了解僅僅關(guān)于花青素苷被轉(zhuǎn)運至液泡的過程，對花青素苷如何流出液泡，進出細胞，被轉(zhuǎn)運至細胞核、葉綠體、亞細胞區(qū)室卻了解較少，有待進一步深入研究[14-15]。

3 花青素合成關(guān)鍵酶

苯丙氨酸在酶的催化下最終合成花青素。在其合成過程中存在一些關(guān)鍵酶，包括PAL、CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT等。

3.1 苯丙氨酸裂解酶(PAL)

PAL能催化苯丙氨酸生成肉桂酸，是花青素合成的起始酶?；ㄇ嗨厣锖铣尚枰狿AL的參與早在1960年就已被發(fā)現(xiàn)[16]，1961年，Connl和Kouko[17]首先從植物中將其分離并純化了出來。PAL在不同種類植物中的氨基酸組成和分子量存在差異，PAL通常包含4個亞基且呈酸性，分子量大約為220～330 kD。目前，科學(xué)家們已在核桃、芒果、桉樹及山葡萄等植物中克隆得到了該基因[18-21]。宋慕波[22]克隆了荸薺的PAL基因，其cDNA序列長度為2 485 bp，開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)為2 142 bp，編碼713個氨基酸。潘文等[23]發(fā)現(xiàn)尾葉桉PAL基因組全長4 507 bp，其中，氨基酸編碼序列為2 172 bp，內(nèi)含子為1 759 bp。研究發(fā)現(xiàn)，PAL活性受外界環(huán)境因素影響，董春娟等[24]以黃瓜幼苗為研究對象，發(fā)現(xiàn)在低溫條件下，葉片PAL基因的表達顯著升高，且產(chǎn)物活性也有所提高。程春振等[25]也發(fā)現(xiàn)，利用少量紫外線對梁平柚果皮進行照射處理，可誘導(dǎo)PAL活性的增強。

3.2 查爾酮合成酶(CHS)

CHS是類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它可以催化查爾酮的生成，其作用底物是香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A，生成產(chǎn)物為查爾酮。1983年，Reimold等[26]在荷蘭芹中克隆到了第1個CHS基因，隨后，蘭花、矮牽牛、玉米、擬南芥及高粱中的CHS基因也被克隆[7]。黃瓊林等[27]發(fā)現(xiàn)青天葵葉的CHS基因編碼區(qū)為1 173 bp，編碼391個氨基酸。王毅等[28]從泡核桃中克隆了一個由冷凍損傷誘導(dǎo)的CHS基因,基因全長為1 490 bp，ORF長1 170 bp，編碼389個氨基酸。研究表明，CHS基因與植物顏色變化之間存著顯著的相關(guān)性，van der Krol等[29]向紫色矮牽牛中導(dǎo)入CHS的反義基因后花色變白。

3.3 查爾酮異構(gòu)酶(CHI)

CHI可將查爾酮催化成三羥基黃烷酮。1987年，Mehdy等[30]首先從豌豆中分離出CHI基因，此后，科學(xué)工作者們又陸續(xù)在菜豆、翠菊、玉米及矮牽牛等植物中獲得該基因[7]。楊哲等[31]克隆了紅掌栽培品種CHI基因，測序結(jié)果顯示，該基因全長1 117 bp，包含777 bp的ORF，編碼258個氨基酸。根據(jù)催化底物的不同，CHI基因可被劃分為兩種完全不同的類型，Ⅰ型編碼的酶蛋白只能作用于1種底物；Ⅱ型編碼的酶蛋白則可作用于兩種底物[32]。據(jù)報道，CHI基因發(fā)生變異或下調(diào)表達，都會導(dǎo)致查爾酮含量顯著升高，使類黃酮合成途徑受阻。Nishihara等研究發(fā)現(xiàn)抑制煙草CHI基因的表達后，花瓣因無法積累類黃酮而使顏色變黃[33]。

3.4 類黃酮3-羥化酶(F3H)

F3H可將三羥基黃烷酮催化成二氫黃酮醇，是花青素合成通路的中樞位點。李鵬等[34]對來自山竹、銀杏及龍眼等12種植物F3H的基因序列及相應(yīng)的氨基酸序列進行數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，它們的ORF大約為1 100 bp，大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量在41.10 kD左右，理論等電點都在7以下，顯示F3H是酸性蛋白。外界因素可影響F3H表達,Castellarin等[35]研究證明，植物缺水可誘導(dǎo)F3H基因表達，從而增加花青素的積累；Zheng等[36]發(fā)現(xiàn)被己糖激酶磷酸化的糖類可以誘導(dǎo)F3H的表達以及花青素的積累，而己糖激酶的特異性抑制劑葡萄糖胺和甘露七糖可以阻斷這一誘導(dǎo)過程。EL-Kereamy等[37]發(fā)現(xiàn)葡萄果實在經(jīng)過乙烯處理后，F(xiàn)3H基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高。

3.5 類黃酮3′羥化酶(F3′H)

F3′H屬于細胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)亞家族[38]，在類黃酮合成途徑中，F(xiàn)3′H催化二氫黃烷酮生成二氫懈皮素。1999年Brugliera等[39]從矮牽牛中首次分離出F3′H基因后，越來越多的科研工作者在不同的植物中也克隆到了F3′H基因。劉海峰等[40]從山葡萄中克隆得到了F3′H基因，其cDNA序列長度達到1 844 bp，ORF長1 530 bp，編碼509個氨基酸。Zou等[41]從杭菊中克隆了F3′H，測序結(jié)果顯示，cDNA全長1 562 bp，ORF長1 527 bp，編碼508個氨基酸。景宗慧等[42]獲得了芡葉F3′H的cDNA序列，其ORF長1 566 bp，編碼521個氨基酸，是親水性蛋白，預(yù)測定位于細胞質(zhì)膜。研究表明，F(xiàn)3′H基因影響花瓣顏色形成，若使菊花中F3′H基因沉默可使花瓣由紅色或粉色變?yōu)樗{色[43]。

3.6 類黃酮3′,5′-羥化酶(F3′5′H)

F3′5′H也屬于CYP450家族[38]，可將二氫黃烷酮催化成二氫楊梅黃酮。F3′5′H基因是第一個克隆到的植物CYP基因[44]，馬璐琳等[45]從藤烏中克隆到了一個全長1 563 bp的F3′5′H基因，其ORF編碼的蛋白質(zhì)含有506個氨基酸。方穎等[46]以華麗龍膽5個不同開放階段的藍色花冠為試材，克隆到了F3′5′H基因，其ORF為1 560 bp。研究表明，F(xiàn)3′5′H基因與藍色花色形成密切相關(guān)，因此被稱為藍色基因[47]。研究人員以白色香石竹為研究對象，利用基因工程技術(shù)將F3′5′H基因和DFR基因?qū)肫渲?得到了紫色植株[6]，這是最早的F3′5′H轉(zhuǎn)基因花卉。Whang等[48]發(fā)現(xiàn)石斛蘭念珠花被顏色的缺失與F3′5′H基因有關(guān)。Mori研究團隊向矮牽牛中導(dǎo)入F3′5′H基因,發(fā)現(xiàn)部分植株的花瓣顏色變成深紅色,并出現(xiàn)了深紫色的區(qū)域[49]。

3.7 二氫黃酮醇還原酶(DFR)

DFR是一種短鏈還原酶[50]，該酶可以催化二氫黃烷酮、二氫楊梅黃酮、二氫槲皮素生成無色花青素。1985年，DFR基因首先由O′Reilly等人從玉米和藤草中得到[51]，隨后，從水稻、葡萄和紫蘇等植物中也克隆出來[52]。張波等[53]采用同源克隆的方法從‘貴妃’芒果的果實中分離到了一個長1 260 bp的DFR基因，該基因包含一個編碼328個氨基酸長987 bp的ORF。Meyer等[54]將DFR基因?qū)氚谆ò珷颗：?，花色變?yōu)榈u紅色。這是使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對花色進行改造的第1個實驗，Tanaka等[55]向矮牽牛中導(dǎo)入玫瑰DFR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物花瓣和花藥呈橙紅色，含有天竺葵素，這種花青素在矮牽牛中很不常見。

3.8 花青素合成酶(ANS)

ANS可將無色花青素催化為有色花青素。ANS基因首先在紫蘇中被克隆[56]，隨后在蕪菁、山藥、桑樹等中也克隆到了該基因[57]。Shi等[58]從玉蘭中克隆了一個ANS基因，該基因長1 171 bp，其ORF編碼的蛋白含有360個氨基酸，長為1 080 bp。ANS基因在植物組織中的表達具有特異性，Rosati等[59]對金鐘連翹的ANS基因進行表達分析，結(jié)果顯示該基因的表達只發(fā)生在萼片中，并不發(fā)生在花瓣和花藥中，使花瓣不能積累花青素。研究證明，抑制或促進ANS基因的表達,可以使花色發(fā)生改變，Nakamura等[60]通過沉默ANS基因，獲得了白色的蝴蝶草。由此可見，通過ANS基因?qū)ɑ茴伾M行改造已成為研究熱點。

3.9 類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)

UFGT是花青素合成通路的最后1個酶,作用是催化花青素形成穩(wěn)定的花青素苷。王迪等[61]獲得了歐李葉片的UFGT基因，發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框為1 425 bp，編碼475個氨基酸，其對應(yīng)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為51.63 kD，是穩(wěn)定的疏水性蛋白，帶正電荷。研究發(fā)現(xiàn),光照、溫度、水分、介質(zhì)酸堿度及外源物質(zhì)，對UFGT基因表達有很大影響[62]。張圣美等[63]利用人工氣候室對紫色茄子進行高溫處理，發(fā)現(xiàn)高溫環(huán)境可降低茄子果皮UFGT基因的表達量，同時，類黃酮和花青素的含量都有所降低。Peppi等[64]研究發(fā)現(xiàn)，用脫落酸處理無核葡萄，能有效促進UFGT基因的表達。

利用基因工程技術(shù)對這些酶進行調(diào)控，可以有效影響花青素的合成過程，實現(xiàn)植物花色的改變，從而達到品種改良的目的。如向植物中導(dǎo)入一個或多個外源花青素合成關(guān)鍵酶基因，或抑制植物中原有的花青素合成關(guān)鍵酶基因，使其產(chǎn)生不同的花色。目前，主要通過F3′H、F3′5′H這兩種酶對花色進行改良，除此之外，通過DFR、ANS改良花色也是未來的重要研究方向之一。

4 展 望

花青素使植物具有豐富的色彩，同時，有助于植物防御病毒及細菌等生物脅迫，吸收過量可見光和紫外線照射，清除非生物脅迫下過量的活性氧，這對植物本身至關(guān)重要。目前，花青素合成途徑已基本清楚，也已從大量植物中克隆出了花青素合成關(guān)鍵酶基因，已知激活或抑制這些基因或誘導(dǎo)其突變可改變植物顏色，提高植物的觀賞價值，但仍存在很多問題，如花青素的修飾及運輸、積累等機制還不清楚，植物的再生體系和轉(zhuǎn)基因體系難以建立，這些問題也是接下來研究的熱點問題。

花青素具有強大的醫(yī)藥、保健和營養(yǎng)價值，對人體健康有很大的幫助，但由于我國對于花青素的研究起步較晚，依然有許多生物學(xué)功能未得到開發(fā)利用，因此，加快提取和鑒定技術(shù)的發(fā)展，在更多植物中發(fā)現(xiàn)新種類的花青素，以及加大花青素在抗炎癥、抗腫瘤及保護心腦血管疾病等方面的利用是十分有必要的。