潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘模型小鼠結(jié)腸MUC2、AQP3的影響*

王 煜， 王自立， 王志旺， 李喜香， 李濟(jì)陽(yáng)

(1. 甘肅省中醫(yī)院， 蘭州 730050; 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 730000)

便秘(constipation)是一種臨床常見的胃腸道疾病，主要表現(xiàn)為糞便干結(jié)、排便困難或排便周期長(zhǎng)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量；年老、不良生活習(xí)慣以及其他病理、生理因素均可影響排便，并進(jìn)一步引起便秘，而目前治療便秘首選藥物治療，如瀉藥、促胃腸動(dòng)力藥等[1]。中醫(yī)藥在治療便秘等慢性復(fù)雜性疾病方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合患者體質(zhì)、便秘證型以及其他特殊情況，辨證處方，近年來(lái)已成為民族醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。全國(guó)名中醫(yī)王自立教授從脾虛不運(yùn)、腸道津虧出發(fā)，擬定潤(rùn)腸通便復(fù)方并制成合劑，臨床應(yīng)用取得明顯的療效[3]。結(jié)腸分泌的粘液潤(rùn)滑腸道而促進(jìn)排便，結(jié)腸黏蛋白(mucin, MUC)表達(dá)下調(diào)，水通道蛋白(aquaporin, AQP)增加引起水代謝紊亂，使結(jié)腸粘液分泌減少，從而形成腸燥便秘之癥。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制便秘小鼠模型，研究潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘的治療作用，同時(shí)，從結(jié)腸黏蛋白(mucin2, MUC2)、水通道蛋白(aquaporin3, AQP3)及水代謝等方面探討其潤(rùn)腸通便的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

潤(rùn)腸通便合劑(RunchangTongbianmixture, RTM)，甘肅省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號(hào)：20200611。常通舒顆粒(ChangtongshuGranule, CTS)，貴州威門藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z52020172，批號(hào)：20200203。復(fù)方地芬諾酯片，廣西河豐藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H45020028。Muc2試劑盒(ELISA)，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20200605。

1.2 動(dòng)物

KM小鼠，雌雄各半，18～22 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002，設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

1.3 儀器

美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)的CFX型熒光定量PCR儀，日本Olympus公司生產(chǎn)的CH-212型光學(xué)顯微鏡，澳大利亞Dynamica公司生產(chǎn)的VELOCITY18R型冷凍離心機(jī)，北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)的BS1103型電子分析天平。

1.4 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠小腸推進(jìn)功能及排便的影響

將小鼠按性別體重分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、模型對(duì)照組(Model)、陽(yáng)性對(duì)照組(CTS，7.8 g/kg)以及潤(rùn)腸通便合劑高、中、低劑量組(RTM-H、RTM-M、RTM-L，40、20、10 ml/kg)，每組20只。各組按上述劑量灌胃給藥3 d，其中空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃純凈水20 ml/kg。第3日禁食不禁水8 h后灌胃復(fù)方地芬諾酯30 mg/kg，其中空白對(duì)照組灌胃等量純凈水(10 ml/kg)。30 min后灌胃含相應(yīng)受試藥的墨汁，其中空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃含相同劑量墨汁的純凈水。從上述每組中隨機(jī)取10只小鼠，灌胃給藥25 min后脫頸椎處死，手術(shù)取出幽門至盲腸之間的整段小腸，平鋪于生理鹽水潤(rùn)濕的平面上，輕拉呈直線狀態(tài)后測(cè)量小腸總長(zhǎng)度(L)及幽門至墨汁前沿的長(zhǎng)度(X)，按(X/L)×100%來(lái)計(jì)算小腸推進(jìn)率[4]。各組剩余小鼠分籠飼養(yǎng)，觀測(cè)小鼠首次黑便時(shí)間(首便時(shí)間)以及6 h內(nèi)排便粒數(shù)。

1.5 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠的影響

小鼠分組同1.4，每組10只。各組小鼠上午8:00灌胃復(fù)方地芬諾酯20 mg/kg，其中空白對(duì)照組灌胃純凈水10 ml/kg，1次/日，連續(xù)14 d[5]；下午2:00各組小鼠按1.4項(xiàng)下劑量灌胃給藥，其中空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃純凈水20 ml/kg，連續(xù)給藥14 d。實(shí)驗(yàn)第15日麻醉小鼠后處死，手術(shù)取出完整結(jié)腸，將靠近小腸的結(jié)腸依次取3段：第1段結(jié)腸冷凍儲(chǔ)存，供測(cè)定AQP3基因表達(dá)水平；第2段結(jié)腸精密稱重，干燥至恒重后稱重，計(jì)算結(jié)腸含水量；第3段結(jié)腸經(jīng)HE染色后觀測(cè)結(jié)腸病理學(xué)變化。剩余結(jié)腸用PBS緩沖液(28℃)灌洗，離心后取結(jié)腸灌洗液(colonic lavage fluid, CLAF)上清液，采用ELISA法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定Muc2的含量。

1.6 HE染色觀測(cè)結(jié)腸病理學(xué)變化

取0.5 cm小鼠結(jié)腸用福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋、切片后行HE染色，鏡下觀察結(jié)腸病理學(xué)變化，對(duì)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞脫落及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行半定量分析：結(jié)腸絨毛排列規(guī)整、結(jié)構(gòu)清晰記0分，結(jié)腸絨毛排列規(guī)整、但結(jié)構(gòu)模糊記1分，結(jié)腸絨毛排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊記2分；結(jié)腸上皮細(xì)胞未見脫落記0分，結(jié)腸上皮細(xì)胞脫落、但未連接成片記1分，結(jié)腸上皮細(xì)胞脫落并連接成片記2分；可見0～5個(gè)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記0分，可見6～10個(gè)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記1分，可見10個(gè)以上炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記2分。

1.7 PCR法測(cè)定結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法提取RNA，測(cè)定其純度與濃度。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板對(duì)GAPDH及AQP3 mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AQP3上游引物序列為5'-CAAGCTGCCATCTACAC-3’，下游引物序列為5'-AAAGAAGCCATGACCATAT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度183 bp；GAPDH上游引物序列為5'-AGGTCGGTGTGACGGATTTG-3'，下游引物序列為5'-TGTAGACCATGTAGTGAGGTCA-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度122 bp，由上海生工生物工程股份有限公司提供。檢測(cè)AQP1及β-Actin的循環(huán)數(shù)(Ct值)，以β-Actin與模型對(duì)照組為對(duì)照計(jì)算△△Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠排便的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠首便時(shí)間明顯延長(zhǎng)，6 h排便粒數(shù)明顯減少(P<0.01，表1)；與模型對(duì)照組相比，在潤(rùn)腸通便合劑的干預(yù)下，首便時(shí)間明顯縮短，6 h排便粒數(shù)明顯增加(P<0.05, 0.01)。

Tab. 1 Effects of RTM on defecation in mice with acute constipation n=10)

2.2 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠小腸推進(jìn)的影響

小鼠按性別、體重分層隨機(jī)分組后，小腸的總長(zhǎng)度沒有明顯差異。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠小腸墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度以及小腸推進(jìn)率顯著減小(P<0.01，表2)；與模型對(duì)照組相比，經(jīng)潤(rùn)腸通便合劑干預(yù)后，小腸墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度及小腸推進(jìn)率明顯增加(P<0.05, 0.01)。

Tab. 2 Effects of RTM on small intestinal propulsion of mice with acute constipation n=10)

2.3 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響

在光鏡下，空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸絨毛排列規(guī)整，腸腺豐富，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，各層組織無(wú)明顯異常；模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸絨毛排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊，腺體萎縮，部分黏膜上皮脫落，可見炎性滲出。在潤(rùn)腸通便合劑的干預(yù)下，結(jié)腸上述病理學(xué)變化出現(xiàn)不同程度改善。對(duì)結(jié)腸結(jié)構(gòu)、粘膜脫落及炎性滲出進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.01，表3)；與模型對(duì)照組相比，潤(rùn)腸通便合劑各劑量組的結(jié)腸病理學(xué)評(píng)分明顯下降(P<0.01)。

Fig. 1 Effects of RTM on colonic pathological changes in mice with chronic constipation (HE ×100)

2.4 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠近端結(jié)腸AQP3基因表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠近端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，表3)；與模型對(duì)照組相比，潤(rùn)腸通便合劑各劑量組近端結(jié)腸AQP3 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of RTM on colonic pathology and AQP3 mRNA in proximal colon of mice with chronic constipation n=10)

2.5 潤(rùn)腸通便合劑對(duì)便秘小鼠結(jié)腸含水量及CLAF中Muc2的影響

與空白對(duì)照組相比，反復(fù)灌胃15 mg/kg復(fù)方地芬諾酯后，模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸濕干重比值以及CLAF中Muc2明顯下降(P<0.01，表4)；與模型對(duì)照組相比，在潤(rùn)腸通便合劑的干預(yù)下，結(jié)腸濕干重比值以及Muc2明顯回升(P<0.05, 0.01)。

Tab. 4 Effects of RTM on Fecal water content and Muc2 in CLAF of mice with chronic constipation n=10)

3 討論

便秘(constipation)是一種常見的胃腸道疾病，中醫(yī)藥在治療便秘等慢性復(fù)雜性疾病方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合患者體質(zhì)、便秘證型以及其他特殊情況，辨證處方，近年來(lái)已成為民族醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[7,8]。全國(guó)名中醫(yī)王自立教授在多年臨床的基礎(chǔ)上，從脾虛不運(yùn)、腸道津虧立論擬定潤(rùn)腸通便復(fù)方(現(xiàn)已制成合劑)。潤(rùn)腸通便合劑由肉蓯蓉、枳殼、郁李仁等中藥組成，方中肉蓯蓉益腎助陽(yáng)、潤(rùn)腸通便，枳殼善能理氣寬中、行滯消脹，郁李仁功擅潤(rùn)燥滑腸，諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，寓攻于守，使補(bǔ)無(wú)滯氣礙脾、攻無(wú)耗氣傷津之弊，共奏健脾助運(yùn)、潤(rùn)腸通便之效，臨床應(yīng)用取得明顯的療效[9]。本次實(shí)驗(yàn)采用復(fù)方地芬諾酯復(fù)制便秘小鼠模型，研究結(jié)果顯示，潤(rùn)腸通便合劑可加速小腸蠕動(dòng)而增加小腸內(nèi)容物的推進(jìn)長(zhǎng)度，提高推進(jìn)率；縮短首次排便時(shí)間，增加6 h內(nèi)排便粒數(shù)。潤(rùn)腸通便合劑可改善便秘結(jié)腸的病理學(xué)變化，使結(jié)腸絨毛排列趨于規(guī)整，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞脫落，緩解炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

結(jié)腸動(dòng)力減弱、內(nèi)容物傳輸功能減慢，腸道內(nèi)容物長(zhǎng)時(shí)間滯留在結(jié)腸，內(nèi)容物中細(xì)菌、毒素等進(jìn)入腸腔上皮組織，改變腸道黏膜內(nèi)環(huán)境，腸道上皮中杯狀細(xì)胞等分泌細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)化的速度減慢，黏蛋白(MUC)合成、分泌不足，保護(hù)腸黏膜、潤(rùn)滑糞便的功能降低。目前發(fā)現(xiàn)腸道有20余種黏蛋白，其中MUC2是腸道重要的分泌型黏蛋白，MUC2水化后形成水凝膠黏液屏障來(lái)保護(hù)腸道上皮組織，同時(shí)覆蓋于糞便表面而發(fā)揮潤(rùn)腸通便的作用[10]。另一方面，隨著結(jié)腸腸道、腸粘膜及腸壁生理環(huán)境的改變，刺激腸道上皮水通道蛋白(如AQPs)的表達(dá)與遷移，尤其是隨著近端結(jié)腸AQP3表達(dá)的增加，結(jié)腸對(duì)水分的吸收速度加快，這也是遠(yuǎn)端結(jié)腸中糞便含水量下降、糞便干燥的主要原因之一[11,12]。本次研究通過(guò)受試藥干預(yù)便秘動(dòng)物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)潤(rùn)腸通便合劑能抑制結(jié)腸AQP3的表達(dá)，改善結(jié)腸水代謝而提高組織的水含量，同時(shí)潤(rùn)腸通便合劑可促進(jìn)結(jié)腸黏膜分泌MUC2，保護(hù)腸黏膜、潤(rùn)滑糞便而利于排出。