Synaptotagmin 1基因敲除對(duì)小鼠行為的影響*

武南南， 封芮芮， 張 宇， 李 光， 曹濟(jì)民， 殷麗天△

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系， 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 細(xì)胞生理學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030001； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所， 醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 瀘州 646000)

焦慮障礙在世界范圍內(nèi)的患病率逐年升高，其相關(guān)臨床和基礎(chǔ)研究也受到廣泛關(guān)注[1]。焦慮的特征是持續(xù)的覺醒、警惕和恐懼，由多個(gè)腦區(qū)介導(dǎo)，如杏仁核、終紋床核、前額葉皮層和海馬等[2]，其中杏仁核被認(rèn)為是調(diào)節(jié)焦慮的關(guān)鍵腦區(qū)。同時(shí)，大量證據(jù)支持多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)參與焦慮發(fā)生-焦慮緩解過程[3]，以往對(duì)于焦慮及情感障礙發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)等遞質(zhì)通路。盡管目前對(duì)焦慮障礙的研究已受到重視，但苯二氮卓類、5-HT抑制劑等仍是目前主要的治療方式，存在治療效果差或復(fù)發(fā)等問題。所以，有必要深入地闡明焦慮及情感障礙發(fā)病機(jī)制，從分子角度尋找安全有效的藥物和治療方法[4]。

突觸結(jié)合蛋白1(Synaptotagmin 1，Syt1)是synaptotagmin蛋白家族的成員，在前腦、中腦以及大多數(shù)腦干和脊髓神經(jīng)元中表達(dá)[5]。Syt1在突觸胞吐和其他類型的Ca2+誘導(dǎo)的分泌過程中充當(dāng)Ca2+感受器[5]，使神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與動(dòng)作電位(APs)同步，既是鈣離子快速釋放的感受器，又是自發(fā)和延遲異步釋放的抑制劑[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在許多突觸中Syt1的基因缺失可以取消快速同步釋放成分，并且導(dǎo)致自發(fā)和異步釋放的幾倍增強(qiáng)[6]。Syt1、Synaptophysin和SNAP-25等突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與學(xué)習(xí)和記憶呈正相關(guān)，但與焦慮和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)[7]。在人類和嚙齒動(dòng)物的相關(guān)研究顯示，杏仁核是焦慮環(huán)路中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)杏仁核的體積與焦慮水平正相關(guān)[8]，并且社交焦慮癥患者杏仁核的激活會(huì)增加[9]。此外，焦慮性刺激后Fos蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)將嚙齒動(dòng)物暴露于產(chǎn)生焦慮的環(huán)境中杏仁核被激活[10]，并且使用藥物失活杏仁核有抗焦慮作用[11]。谷氨酸(glutamate，Glu)是人腦內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由突觸前膜釋放，經(jīng)突觸間隙與突觸后膜上的受體結(jié)合產(chǎn)生活化作用。Glu在大腦中的分布很廣泛，約85%的突觸是Glu能的[12]。杏仁核Glu含量升高可以導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，進(jìn)而引起焦慮水平的增加。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過阻斷NMDA受體能夠有效降低應(yīng)激引起的焦慮程度。并且，應(yīng)激所導(dǎo)致的Glu能神經(jīng)系統(tǒng)功能增強(qiáng)可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高和神經(jīng)毒性，進(jìn)而影響相關(guān)腦區(qū)的正常功能，這也可能與某些焦慮障礙的發(fā)病有關(guān)[13]。

基因敲除(gene knockout)是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，達(dá)到阻止基因表達(dá)的作用。本研究擬采用Syt1基因敲除的雜合子(Syt1+/-)和野生型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過曠場(chǎng)、高架十字迷宮和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)來初步探究Syt1+/-小鼠的焦慮樣行為改變，分析Syt1在多個(gè)焦慮相關(guān)腦區(qū)的表達(dá)情況，并研究其杏仁核區(qū)谷氨酸的含量變化，旨在為Syt1導(dǎo)致焦慮樣行為及其發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備、強(qiáng)迫游泳設(shè)備和視頻采集與存儲(chǔ)系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司；冰凍切片機(jī)購自德國Leica公司；超高效液相色譜儀購自美國Thermo Scientific公司；質(zhì)譜儀購自美國AB SciexTM公司。Syt1抗體購自中國Proteintech公司；Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗兔抗體購自美國Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

以基因型Synaptotagmin 1敲除(Syt1+/-)及同窩野生型(wild type，WT)雄性小鼠為研究對(duì)象。Syt1+/-小鼠由本實(shí)驗(yàn)室曹濟(jì)民課題組提供，該鼠種原由賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司協(xié)助建立。新生小鼠PCR基因型鑒定后使用。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。溫度為(22±1)℃，保持12 h的照明/黑暗晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用8周齡小鼠，分為2組：WT組(n=10)和Syt1+/-組(n=9)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)由8周齡WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只，取前額葉皮層、海馬、杏仁核、伏隔核、紋狀體和腹側(cè)被蓋區(qū)等腦組織檢測(cè)Syt1蛋白的表達(dá)情況。神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)選取8周齡WT小鼠和Syt1+/-小鼠各5只取前額葉皮層、海馬和杏仁核組織檢測(cè)谷氨酸含量。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用嚴(yán)格遵守相關(guān)條例。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照山西省動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)指導(dǎo)原則操作。

1.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將小鼠放置在一個(gè)正方體黑色塑料箱(50 cm×50 cm)中，使其自由探索5 min。使用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄并進(jìn)行分析小鼠總運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)停留的時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離、中心區(qū)停留時(shí)間所占比例和外周區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間。每只小鼠測(cè)試完成后清理設(shè)備，待完全干燥后進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)。

1.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放在中央正方形區(qū)同一位置，面朝閉合臂，允許其自由探索迷宮5 min。采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)分析記錄測(cè)試過程中的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)(開臂與閉臂中移動(dòng)的距離)，以及進(jìn)入開臂與閉臂的次數(shù)和在其中停留的時(shí)間。每只小鼠測(cè)試完成后清理設(shè)備，待完全干燥后進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)。

1.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

被試小鼠放置在一個(gè)玻璃透明圓柱體(直徑10 cm，高35 cm)中，裝水(25 cm，25℃)5 min，軟件視頻記錄不動(dòng)時(shí)間(immobility)。結(jié)束后將小鼠放回到干凈的籠子里，擦干并烘干小鼠毛發(fā)。換水清理，再進(jìn)行下一只實(shí)驗(yàn)。

1.6 免疫熒光染色

采用8周齡WT和Syt1+/-雄性小鼠各5只，取前額葉皮層、海馬、杏仁核、伏隔核、紋狀體和腹側(cè)被蓋區(qū)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。小鼠麻醉后經(jīng)心內(nèi)灌注0.9%生理鹽水，然后灌注4%多聚甲醛，取腦。用冰凍切片機(jī)切成30 μm厚度的切片。選取腦片，冰PBS洗滌3次，用0.3% Triton X-100在37℃滲透10 min，然后與10%驢血清在37℃孵育30 min，使用Syt1抗體(1∶200)孵育過夜。PBS洗滌3次后，Alexa Fluor 594二抗(1∶1 000)在37℃孵育90 min。顯微照片是用熒光顯微鏡分析獲得(每組5只，每只動(dòng)物取3幅圖像)。使用Image J軟件計(jì)數(shù)，Graphpad Prism 8軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

8周齡WT和Syt1+/-小鼠各5只，用于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)。小鼠頸椎脫臼處死后，迅速取出腦組織，冰上快速分離前額葉皮層、海馬和杏仁核，用冰PBS沖洗隨后保存于-80℃冰箱待檢測(cè)。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)方法檢測(cè)小鼠前額葉皮層、海馬及杏仁核的Glu含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色

熒光顯微鏡下，在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側(cè)被蓋區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見紅色熒光免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為Syt1蛋白。與WT組相比，各腦區(qū)Syt1+/-組Syt1陽性細(xì)胞數(shù)存在不同程度的顯著減少(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前額葉皮層(P<0.01)、海馬(P< 0.01)、杏仁核(P<0.01)，伏隔核(P<0.01)，紋狀體(P<0.01)和腹側(cè)被蓋區(qū)(P<0.01)Syt1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(表1)。

Fig. 1 The expressions of Syt1 in prelimbic cortex (PL), hippocampus (HIP), amygdala (AMY), accumbens nucleus (ACB), caudoputamen (CP) and ventral tegmental area (VTA) detected by immunofluorescence assay in WT mice (n=5) and Syt1+/- mice (n=5， Bars=20 μm, immunofluorescence ×40)

Tab. 1 Syt1 positive cells in different brain regions of WT and Syt1+/- mice n=5)

2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field, OF)中，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠在暴露于新環(huán)境時(shí)表現(xiàn)出更少的總運(yùn)動(dòng)距離(P<0.01，表2)。Syt1+/-小鼠在新環(huán)境中心停留的時(shí)間、中心區(qū)運(yùn)動(dòng)距離均明顯低于WT小鼠(P<0.01)，并且在中心區(qū)停留時(shí)間的百分比也明顯降低(P<0.01)。然而在曠場(chǎng)周邊，Syt1+/-小鼠比WT小鼠停留的時(shí)間更長(zhǎng)(P<0.01)。這些數(shù)據(jù)表明，缺乏Syt1的小鼠具有高焦慮的特征。

Tab. 2 Open field test of WT mice and Syt1+/- mice

2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze，EPM)中，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的“開臂進(jìn)入次數(shù)”較WT小鼠顯著降低(P<0.05)，進(jìn)入中心區(qū)的次數(shù)也顯著降低(P<0.05，圖2A)；開臂移動(dòng)距離顯著降低(P<0.01，圖2B)；“開臂滯留時(shí)間”較WT小鼠顯著降低(P<0.01)，而“閉臂滯留時(shí)間”較WT小鼠顯著升高(P<0.01，圖2C)。圖2D，E顯示W(wǎng)T和Syt1+/-小鼠在實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)軌跡?？偠灾?，EPM測(cè)試表明Syt1+/-小鼠的焦慮水平有所升高。

Fig. 2 Syt1+/- mice showed decreased open arm entries and spent less time in open arm of EPM

2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swim test，F(xiàn)ST)中，WT小鼠的不動(dòng)時(shí)間為(269.0±4.3)s，Syt1+/-小鼠的不動(dòng)時(shí)間為(291.3±1.6)s。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著增加(P<0.01)。

2.5 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠前額葉皮層和海馬中Glu的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Syt1+/-小鼠杏仁核Glu的含量較WT小鼠顯著增加(P< 0.01，表3)。

Tab. 3 The concentrations of glutamate in the prelimbic cortex (PL)，hippocampus (HIP) and amygdala (AMY) of WT mice and Syt1+/- mice (μg/g, n=5)

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)Syt1在阿爾茨海默癥和癲癇疾病中的潛在功能[14,15]，而在焦慮、抑郁等情感障礙類疾病中未見研究。我們的研究利用多個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探討Syt1對(duì)小鼠焦慮樣行為的影響。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)利用小鼠對(duì)新奇環(huán)境的探索心理和空曠環(huán)境的厭惡恐懼間的平衡來評(píng)價(jià)小鼠的焦慮狀態(tài)[16]，可以用于廣泛性焦慮測(cè)試[17]。Syt1+/-小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出在中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離與時(shí)間的明顯降低，總運(yùn)動(dòng)距離有所降低，可見其自發(fā)活動(dòng)有所降低，提示缺乏Syt1的小鼠對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度和自主性降低，探究性活動(dòng)能力下降，焦慮情緒增強(qiáng)，其趨避性的結(jié)果可以提示進(jìn)一步深入研究焦慮，抑郁相關(guān)實(shí)驗(yàn)[18]。在EPM實(shí)驗(yàn)中，Syt1+/-小鼠表現(xiàn)出進(jìn)入開臂次數(shù)減少，在開臂運(yùn)動(dòng)時(shí)間與運(yùn)動(dòng)距離降低。Syt1+/-小鼠對(duì)開臂的厭惡情緒會(huì)強(qiáng)于對(duì)新環(huán)境的好奇，提示小鼠處于焦慮狀態(tài)[19]。而在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，Syt1+/-小鼠較WT小鼠不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，表明其求生欲望下降，易出現(xiàn)抑郁情緒。以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)提示，Syt1+/-小鼠的焦慮水平，抑郁程度有所增加。

通過免疫熒光染色觀察到，Syt1在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側(cè)被蓋區(qū)均有較高的表達(dá)量。與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠的Syt1陽性細(xì)胞數(shù)在前額葉皮層，海馬，杏仁核，伏隔核，紋狀體和腹側(cè)被蓋區(qū)均有不同程度的降低，平均敲除率為67.2%。表明實(shí)驗(yàn)所采用Syt1+/-小鼠可以穩(wěn)定的降低Syt1蛋白表達(dá)，符合本研究的前提和需求。杏仁核作為邊緣系統(tǒng)的一部分，是產(chǎn)生情緒，識(shí)別情緒和調(diào)節(jié)情緒，控制學(xué)習(xí)和記憶的腦部組織。我們的結(jié)果顯示，被測(cè)腦區(qū)中杏仁核Syt1表達(dá)量較高，而在敲除鼠中其敲除比例也呈較高水平(81.3%)。這從側(cè)面證實(shí)，Syt1缺失對(duì)于小鼠焦慮行為的影響與杏仁核密切相關(guān)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Glu是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，Glu能系統(tǒng)與焦慮密切相關(guān)。而中央杏仁核Glu的增加介導(dǎo)焦慮樣行為，杏仁核Glu含量的增加可能與焦慮發(fā)生有關(guān)，這可能是杏仁核的高度激活促進(jìn)了焦慮樣行為[20]。我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩組小鼠多個(gè)腦區(qū)Glu的含量，與WT小鼠相比，Syt1+/-小鼠Glu的含量在杏仁核顯著增加，而在前額葉皮層和海馬無顯著差異。因此推測(cè)，杏仁核中Syt1缺失導(dǎo)致神經(jīng)元自發(fā)和異步釋放的增加，促進(jìn)Glu水平的升高，而這可能是小鼠呈現(xiàn)出多種焦慮樣行為的潛在原因。

綜上所述，Syt1部分缺失小鼠存在較明顯的焦慮、抑郁、自主性和探索性下降等行為，其可能機(jī)制為杏仁核中Glu自發(fā)和異步釋放的增加，這對(duì)焦慮障礙的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和研究思路。而進(jìn)一步揭示Syt1在焦慮等情緒調(diào)控中的作用及其具體機(jī)制，將為相關(guān)精神類疾病的治療提供新途徑。