黏蛋白4在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

曹順順，汪曉龍，舒?zhèn)骼^，邵劍杰，李紅霞

（1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）口腔科，湖北 黃石 435000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔科，湖北 武漢 430000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）作為口腔癌的主要類型，其發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[1]。該病具有侵襲轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、預(yù)后差的特點(diǎn)[2]。雖然近年來(lái)OSCC的臨床治療手段不斷在進(jìn)步，但患者總體預(yù)后依然不佳[3]。研究發(fā)現(xiàn)，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是影響患者治療效果及預(yù)后的主要危險(xiǎn)因素[4]。因此，積極探討OSCC的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制、尋找敏感基因?qū)χ笇?dǎo)患者早期診療及預(yù)后改善意義重大。黏蛋白（MUCs）作為一類相對(duì)分子質(zhì)量高且具有細(xì)胞保護(hù)及潤(rùn)滑功能的糖蛋白，在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞間黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)活動(dòng)[5]。同時(shí)，MUC4在不同惡性腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵性作用[6]。MUC4作為MUCs的亞型之一，具有癌基因的特性，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程，其在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。但MUC4是否與OSCC相關(guān)，少有報(bào)道。本研究對(duì)OSCC組織中MUC4蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，探討其在不同臨床指標(biāo)間表達(dá)的差異性，以及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2012年7月—2015年7月在我院接受手術(shù)治療的OSCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療前未接受任何其他治療；②經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為OSCC；③臨床資料完整，且能按要求完成隨訪。排除急慢性感染、血液或免疫系統(tǒng)疾病、合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者。共納入病例89例，其中男性49例，女性40例，年齡31～74歲，平均年齡 （59.12±10.35）歲。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期52例；分化程度：低分化33例，中分化25例，高分化31例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例。術(shù)中留取腫瘤組織及瘤周正常癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm以上），均用10%甲醛固定，石蠟包埋保存。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：HBSHSSZXYY2011030 6009），所有患者均知情同意本研究。

1.2 主要試劑和設(shè)備

兔抗人MUC4多克隆抗體（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國(guó)）；SP免疫組織化學(xué)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記二抗、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；二甲苯、3%過(guò)氧化氫（廣州翔博生物科技有限公司，中國(guó)）；蘇木精、中性樹(shù)脂（武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（上海亞晶生物科技有限公司，中國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.3 臨床資料收集

收集OSCC患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史等一般資料，以及腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移情況等指標(biāo)，分析MUC4蛋白與這些資料的相關(guān)性。

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)組織中MUC4蛋白的表達(dá)

取石蠟標(biāo)本，按4μm厚度切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，用磷酸緩沖溶液（phosphate buffer solution,PBS）沖洗3次，高壓高溫下行抗原修復(fù)10 min，浸入3%過(guò)氧化氫10 min使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶滅活，封閉25 min。將一抗兔抗人MUC4多克隆抗體按1∶600的比例稀釋后加入，4℃下過(guò)夜孵育，加入生物素標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)60 min，用PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，用中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。采用半定量法[8]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：MUC4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，以出現(xiàn)淡黃色或黃褐色團(tuán)塊狀物質(zhì)為陽(yáng)性，隨機(jī)選取高倍鏡下5個(gè)視野，分別根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。①染色情況：未染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分；②陽(yáng)性細(xì)胞情況：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；③根據(jù)①和②的乘積判斷結(jié)果：0～2分為陰性表達(dá)，＞2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 隨訪

患者于術(shù)后開(kāi)始隨訪，包括住院期間查房及出院后門(mén)診復(fù)查、電話隨訪等，隨訪截至2020年7月31日，隨訪終止事件為患者死亡或者隨訪滿5年，記錄患者生存時(shí)間和5年生存率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存曲線分析，應(yīng)用logrank檢驗(yàn)對(duì)患者5年生存率進(jìn)行比較，使用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者生存時(shí)間的相關(guān)因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織和癌旁組織中MUC4蛋白的表達(dá)

MUC4蛋白在OSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)65例，陽(yáng)性率為73.03%，在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)18例，陽(yáng)性率為20.22%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=49.867，P＜0.001）。組織學(xué)圖片見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)OSCC組織和癌旁組織中MUC4蛋白的表達(dá)（×200）Figure 1 Detection of MUC4 protein expression in OSCC and adjacent tissues by immunohistochemistry(×200)

2.2 MUC4蛋白表達(dá)與OSCC患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

MUC4蛋白在不同性別、年齡、腫瘤部位、吸煙史、飲酒史、腫瘤直徑的OSCC患者中陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MUC4蛋白在TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期，低、中分化及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC患者中的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化及未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 MUC4蛋白表達(dá)與OSCC患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性[n（%）]Table 1 Correlation between MUC4 protein expression and clinical indicators in OSCC patients[n(%)]

2.3 MUC4蛋白表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的相關(guān)性

89例患者隨訪時(shí)間為1～60個(gè)月，MUC4蛋白陰性表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為（47.00±3.35）個(gè)月、5年生存率為58.33%，陽(yáng)性表達(dá)組分別為（24.94±2.40）個(gè)月和20.00%，log-rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.358，P＜0.001）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 Kaplan-Meier法分析MUC4蛋白表達(dá)對(duì)OSCC患者預(yù)后的影響Figure 2 Analysis of MUC4 protein expression on the prognosis of OSCC patients by Kaplan-Meier method

2.4 OSCC患者生存時(shí)間的影響因素

將臨床指標(biāo)性別、年齡、腫瘤部位、吸煙、飲酒、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MUC4表達(dá)作為自變量納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MUC4蛋白表達(dá)是影響OSCC患者生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（表2，P＜0.05）。排除其他指標(biāo)，單獨(dú)將MUC4表達(dá)納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示，MUC4蛋白表達(dá)是影響OSCC患者生存時(shí)間的的風(fēng)險(xiǎn)因素[HR=3.487（95%CI：1.762～6.899），P＜0.05]。

3 討論

OSCC作為最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多因素、多基因、多步驟、多機(jī)制共同參與的結(jié)果，易向周圍組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)，且早期便可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，外科手術(shù)、放化療、靶向生物治療等治療手段不斷在進(jìn)步，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移依然是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[9]。MUC4是跨膜型膜結(jié)合MUCs家族的重要成員，可表達(dá)于多種上皮組織，對(duì)上皮具有保護(hù)和潤(rùn)滑的作用[10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，MUC4的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切[11]；MUC4在子宮內(nèi)膜癌[12]、宮頸鱗癌[13]、腦膜瘤[14]等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，且參與了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程[15]。有研究指出，MUC4通過(guò)整合素-β1/FAK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌（prostate cancer，PC）的發(fā)生[16]。周轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等[17]指出，MUC4通過(guò)抗黏附、逃避免疫識(shí)別和影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及增殖，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，MUC4蛋白在OSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其在癌旁組織中，說(shuō)明OSCC組織中出現(xiàn)了MUC4蛋白的異常表達(dá)，提示MUC4可能參與了OSCC的發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，MUC4蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，低、中分化和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者中的陽(yáng)性表達(dá)率高于其在Ⅰ～Ⅱ期、高分化和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，說(shuō)明MUC4蛋白的高表達(dá)與患者較差的臨床指標(biāo)相關(guān)，MUC4可能通過(guò)發(fā)揮癌基因的功能參與了OSCC的進(jìn)程。

有研究指出，MUC4表達(dá)與肺腺癌不良預(yù)后相關(guān)[18]。Yu等[19]指出，MUC4高表達(dá)是黑色素瘤患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。劉鑫宇等[20]則指出，MUC4蛋白陽(yáng)性的結(jié)石相關(guān)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者術(shù)后生存率明顯降低。本研究結(jié)果顯示，MUC4蛋白陰性表達(dá)組患者平均生存時(shí)間和5年生存率均高于陽(yáng)性表達(dá)組，說(shuō)明MUC4蛋白與OSCC患者預(yù)后明顯相關(guān)，MUC4蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率更低。本研究多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和MUC4蛋白表達(dá)是影響OSCC患者生存時(shí)間的的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明MUC4蛋白表達(dá)是影響患者預(yù)后的因素，可能是評(píng)估患者預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，MUC4蛋白在OSCC患者組織中呈高表達(dá)，且與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是評(píng)估患者預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，但其具體的促癌機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。