原生質(zhì)體融合制備三效工程菌HL及其溶藻機(jī)理

黃金杰，毛林強(qiáng)，張文藝

（常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇常州 213164）

由于人類活動(dòng)范圍的不斷擴(kuò)大與工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，導(dǎo)致大量含有氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的污水排入水體，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化程度加深，這會(huì)誘導(dǎo)藍(lán)藻的暴發(fā)頻率加快與持續(xù)周期變長(zhǎng)。近年來，如何有效地治理藍(lán)藻水華問題成為研究熱點(diǎn)。相比于傳統(tǒng)物理、化學(xué)法治理藍(lán)藻，溶藻細(xì)菌因其成本低、安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)更受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但在菌株溶藻過程中往往隨著藻細(xì)胞的破裂，藻細(xì)胞內(nèi)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)二次釋放，使原本的環(huán)境水體富營(yíng)養(yǎng)化程度加重，繼而會(huì)再度成為藻類的“溫床”。通過溶藻菌單一的溶藻作用去處理藍(lán)藻問題難以治本，因此尋找一種兼?zhèn)淙茉?、脫氮、除磷菌株成為解決問題的關(guān)鍵。

目前，在微生物領(lǐng)域原生質(zhì)體融合已有較為成熟的技術(shù)。利用原生質(zhì)體融合將親本優(yōu)勢(shì)基因發(fā)生重組，使獲得兼?zhèn)潆p親優(yōu)良性狀的融合菌株獲得成為可能。這不僅克服了傳統(tǒng)育種方法中的單一特性障礙，還具有傳遞親本優(yōu)勢(shì)遺傳物質(zhì)完整性的優(yōu)點(diǎn)。趙曉燕等通過蘇云金芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌原生質(zhì)體融合使融合菌株具備雙親的防蟲及防病雙優(yōu)勢(shì)；張安妮等等通過原生質(zhì)體融合使融合菌株具備雙親的溶藻及降解藻毒素功效。因此利用原生質(zhì)體融合菌株，既達(dá)到溶藻控藻的目的，又能改善水體富營(yíng)養(yǎng)化，是一種可能實(shí)現(xiàn)的想法。

本文通過溶藻菌R1、脫氮除磷菌B8原生質(zhì)體融合出菌群，經(jīng)一系列條件比較，挑選出其中1株高效溶藻、脫氮除磷的三效工程菌，對(duì)比了其與親本的溶藻、脫氮、除磷7天的效率。通過考察菌株降解銅綠微囊藻過程中葉綠素a（Chlorophyll-a）濃度與菌株生長(zhǎng)速率兩者之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，建立了該菌株降解銅綠微囊藻的Haldane 模型。利用掃描電鏡觀察菌株溶藻過程與三維熒光、紅外紅外光譜分析溶藻產(chǎn)物初步分析菌株溶藻機(jī)理，為微生物措施治理藍(lán)藻問題提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

（1）菌種 菌株HL 篩選自R1 與B8 原生質(zhì)體融合的菌群，于4℃冰箱保存。

（2）藻種 銅綠微囊藻購自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，藻種編號(hào)為FACHB-905。設(shè)定培養(yǎng)條件為光照周期比12h∶12h、光照強(qiáng)度3200 Lux、溫度25℃。

1.1.2 主要培養(yǎng)基與試劑

（1）培養(yǎng)基 BG-11培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：配方詳見文獻(xiàn)[7]，以下簡(jiǎn)稱液培、固培。高滲液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸出汁5g，牛肉膏5g，蔗糖170g，加入1000mL 超純水，調(diào)節(jié)pH為7.2（固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20g/L）。以上培養(yǎng)基均須經(jīng)高溫滅菌（121℃、20min），并冷卻至室溫后使用。

（2）主要試劑 原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM）：依次稱取蔗糖71.5g、氯化鎂4.273g、順丁烯二酸2.336g、加入蒸餾水500mL，調(diào)節(jié)pH至6.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 三效工程菌制備、純化與篩選

（1）原生質(zhì)體融合 分別取10mL 的溶藻細(xì)菌R1 和脫氮聚磷菌B8 發(fā)酵液于離心機(jī)4500r/min 離心10min。棄上清液，收集菌體。用無菌針筒吸取10mL SMM 緩沖液洗滌菌體2 次后，重懸于10mL SMM緩沖液中；酶解、重懸、融合步驟如下。

①酶解 用5mg/L 的溶菌酶對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期R1菌和生長(zhǎng)遲滯期B8菌于30℃下酶解45min，將制備的原生質(zhì)體于45℃熱滅活。

②重懸 經(jīng)離心機(jī)3800r/min 離心10min 后，用無菌針筒吸取高滲生理鹽水洗滌原生質(zhì)體2 次后，重懸于10mL高滲生理鹽水溶液中。

③融合 將處理后的兩個(gè)原生質(zhì)體各取1mL于離心管中，經(jīng)離心機(jī)3800r/min離心10min，棄上清液。加入0.2mL 新生磷酸鈣溶液、1.8mL 30%的PEG 4000。經(jīng)30℃水浴保溫40min 后，3800r/min離心10min，棄上清液。用SMM 溶液定容至2mL，再以SMM 溶液梯度分別稀釋到10、10、10，吸取25μL 涂布于高滲固體培養(yǎng)基，各梯度做3 個(gè)平行，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

（2）純化 用接種環(huán)挑取分離不同單菌落并培養(yǎng)2～3天，5次平板劃線得到純化菌株。

（3）篩選 將純化菌株發(fā)酵培養(yǎng)，以菌藻比1∶10（體積比）接種，溫度為25℃，光照強(qiáng)度為3200Lux，光暗比12h∶12h，光照培養(yǎng)7 天。每天測(cè)1 次葉綠素a、總氮（TN）、總磷（TP）含量并計(jì)算溶藻率、脫氮率、除磷率，設(shè)平行及空白對(duì)照3組，比較各組之間的溶藻、脫氮、除磷率。

1.2.2 菌株HL效能與zeta電位變化

將R1、B8、HL 菌液培培養(yǎng)12h，以菌藻比1∶10（體積比）接種于濃度為(1043.28±12.71)mg/m銅綠微囊藻，并在溫度為28℃、光照強(qiáng)度為3200Lux、光暗比12h∶12h 的條件下培養(yǎng)7 天。利用乙醇法提取葉綠素，以Chlorophyll-a 濃度表現(xiàn)溶藻效果，每天測(cè)1次TN、TP并計(jì)算脫氮除磷率，試驗(yàn)重復(fù)3次，空白對(duì)照組為投加相同比例的滅菌液培。取每天的菌株處理組與對(duì)照組各5mL，用Zetasizer（Nano-ZS90，UK）測(cè)定其藻細(xì)胞表面的zeta電位。

1.2.3 菌株HL降解銅綠微囊藻建模

進(jìn)行菌株HL 處理不同初始濃度銅綠微囊藻試驗(yàn)來研究藻濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，并確定菌株降解各濃度銅綠微囊藻的降解曲線。以滅菌接種環(huán)挑取純化5次的菌株HL于液培中活化12h，以菌藻比例為1∶10接種，在28℃、125r/min的搖床中培養(yǎng)，用橡皮塞密封以防止外界因素對(duì)銅綠微囊藻污染。同等條件下設(shè)平行試驗(yàn)和不接菌空白試驗(yàn)。每天測(cè)1次Chlorophyll-a含量。

1.2.4 菌株HL溶藻機(jī)理初探

（1）菌株作用組分確定 設(shè)置以下5 種處理方式：①培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期菌液（以下皆簡(jiǎn)稱為發(fā)酵液）；②將步驟①中發(fā)酵液經(jīng)12000r/min處理20min 后的上清液過0.22μm 濾膜，即為除菌發(fā)酵液；③將菌液經(jīng)高溫高壓（設(shè)定121℃、1.0×10Pa）滅活處理20min，即為高溫?zé)o菌上清液；④收集步驟②濾膜中的菌體，用超純水洗滌3 遍后，等體積重懸制備菌懸液；⑤液培。將上述5 種菌液按照菌藻體積比1∶10 的比例投加到銅綠微囊藻中，連續(xù)觀察藻樣，并測(cè)定各處理組在7 天的溶藻率。

（2）溶藻過程電子顯微鏡 為觀察菌株HL 溶藻過程中藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，取對(duì)照組與試驗(yàn)組3天、5 天、7 天藻液各10mL，5000r/min 離心5min后，收集藻體，并用2.5%戊二醛固定，經(jīng)4℃冰箱過夜。棄固定液，用磷酸緩沖液漂洗藻體1次，隨后用梯度稀釋的乙醇（體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）依次對(duì)藻體進(jìn)行脫水處理15min，最后冷凍干燥。在掃描電鏡（JSM-IT-100，日本電子株式會(huì)社）下觀察拍照。

（3）溶藻產(chǎn)物的紅外光譜 為探究菌株HL 溶藻原理，離心收集對(duì)照組和投放菌株HL 的銅綠微囊藻液，對(duì)藻體用超純水洗滌3 次后進(jìn)行冷凍干燥，取溴化鉀（Kbr）固定藻樣，傅里葉紅外光譜分析儀（FTIR，IS50，美國(guó)賽默飛世爾科學(xué)公司）上光譜掃描。

（4）溶藻產(chǎn)物三維熒光光譜測(cè)定 以不添加菌株的銅綠微囊藻液為對(duì)照組，輔以菌株HL 處理第7 天的銅綠微囊藻為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后，采用Cary Eclipse 熒光光度計(jì)（為220～400nm，增量5nm；為280～550nm，增量2nm；PMT 電壓800V，掃描速度1200nm/min））測(cè)定溶藻進(jìn)程的三維熒光譜圖，確定菌株HL 溶藻過程中產(chǎn)生溶藻物質(zhì)及溶藻產(chǎn)物。將三維熒光光譜分為5個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域代表一個(gè)類型有機(jī)物，詳見表1。

表1 熒光區(qū)域劃分

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株形態(tài)及其溶藻、脫氮除磷能力

顯微鏡觀察培養(yǎng)3 天的菌株形態(tài)，篩選出5 株性狀明顯的菌株，各菌株特征如表2 所示。5在7天內(nèi)溶藻率、脫氮率、除磷率均高于其他菌株，因此選取5作為研究對(duì)象，并命名為HL。

表2 菌株形態(tài)特征

2.2 三效工程菌效能與zeta電位

三效工程菌與雙親的溶藻率對(duì)比如圖1(a)，由圖1(a)可知，投加B8 菌的7 天內(nèi)最高溶藻率僅為7.99%±0.70%，推測(cè)是液培對(duì)銅綠微囊藻的溶藻效果，而B8菌幾乎沒有溶藻特性；投加R1菌7天的溶藻率總體趨勢(shì)呈波動(dòng)上升，在7天時(shí)溶藻率顯著提升至71.87%±0.45%；投加HL菌的組較雙親每天的溶藻率均顯著提升（0.05），7 天的溶藻率達(dá)81.61%±1.94%，溶藻效果相較于R1 提升9.84%±1.49%。HL菌在經(jīng)原生質(zhì)體融合后，溶藻性能較雙親有著顯著提升，從第1天起溶藻率顯著大于雙親（0.05），加之本身生長(zhǎng)速度極快，故能在相比于雙親更短時(shí)間內(nèi)達(dá)到溶藻閾值。三效工程菌與雙親的脫氮率對(duì)比如圖1(b)，由圖1(b)可知，投加B8 菌第1 天的脫氮率為14.88%±0.86%，隨后呈上升趨勢(shì)，第7 天時(shí)達(dá)75.89%±1.50%，展現(xiàn)出較好的脫氮能力；投加R1 菌7 天的脫氮率總體呈緩慢上升趨勢(shì)，第7 天時(shí)達(dá)到21.14%±0.64%，說明R1有著一定的脫氮能力，推測(cè)R1 是僅為滿足自身生長(zhǎng)吸收BG-11 培養(yǎng)基中NaNO等鹽類作為營(yíng)養(yǎng)源。投加HL 菌的7 天脫氮率僅在42.14%±1.68%與58.64%±1.07%之間波動(dòng)，說明HL菌較雙親具有更為穩(wěn)定的脫氮能力。三效工程菌與雙親的除磷率對(duì)比如圖1(c)，由圖1(c)可知，前兩天時(shí)投加B8菌的除磷率呈現(xiàn)出負(fù)增長(zhǎng)，第2 天時(shí)至-11.25%±2.31%，隨后逐漸上升，第7 天時(shí)達(dá)86.59%±1.26%，說明B8菌適應(yīng)環(huán)境速度較慢，當(dāng)其發(fā)揮除磷作用時(shí)，除磷率顯著上升（0.05）。投加R1菌的7 天的除磷率總體呈下降趨勢(shì)，第1 天達(dá)到45.36%±1.28%，到第7天時(shí)僅為5.50%±0.25%，推測(cè)R1 菌本身并不具備除磷特性，僅可能在試驗(yàn)初期大量吸收BG-11 培養(yǎng)基中所添加的磷酸鹽作為營(yíng)養(yǎng)源為滿足自身生長(zhǎng)需要，故而在試驗(yàn)初期有著較高的除磷率。投加HL 菌的7 天的除磷率相對(duì)穩(wěn)定，最高為第1 天時(shí)的69.52%±0.43%，最低為第2 天時(shí)（53.30±0.84）%，第7 天時(shí)為（61.78±1.32）%，試驗(yàn)說明HL 菌較雙親具有穩(wěn)定除磷特性。

圖1 R1菌、B8菌、HL菌的溶藻、脫氮、除磷效率對(duì)比與zeta電位的變化

由于藻細(xì)胞壁上的羧酸基團(tuán)或附著藻細(xì)胞表面的細(xì)胞外聚合物官能團(tuán)的解離，在天然水體中藻類自帶負(fù)電荷，而藻細(xì)胞團(tuán)聚和細(xì)胞表面的多種胞外聚合物都會(huì)影響藻細(xì)胞表面電荷。由圖1(d)可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的zeta電位隨試驗(yàn)時(shí)間顯著增加（＜0.05），然后在試驗(yàn)后期逐漸趨于平穩(wěn)，在試驗(yàn)第7天時(shí)，試驗(yàn)組zeta電位為-19.87mV?？傮w而言，當(dāng)zeta電位較低時(shí)，藻類系統(tǒng)更傾向于凝聚或聚集。具體而言，吸引力大于排斥力，因此分散受到限制并發(fā)生凝聚。添加三效工程菌HL 導(dǎo)致了藻細(xì)胞表面zeta 電位的降低，在7天時(shí)發(fā)生了藻類的降解與凝聚沉底的現(xiàn)象，這也與蘇俊峰等的研究結(jié)果類似。

2.3 菌株降解過程的建模

在生物降解過程中，銅綠微囊藻中初始Chlorophyll-a 濃度起著重要作用，類似于某些底物，如苯酚等會(huì)對(duì)生物質(zhì)的降解活性產(chǎn)生抑制作用， 故而進(jìn)行試驗(yàn)從(486.69±13.89)mg/m至(3135.43±16.27)mg/m的7 個(gè)不同初始Chlorophyll-a濃度對(duì)菌株降解過程影響的試驗(yàn)。如圖2所示，實(shí)際上Chlorophyll-a 濃度的降解與時(shí)間成線性關(guān)系，因此，對(duì)于所有初始濃度的Chlorophyll-a降解速率都是恒定的。盡管生物降解率不會(huì)隨時(shí)間變化，但會(huì)隨著Chlorophyll-a初始濃度的增加而增加，而在(1525.67±27.22)mg/m時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)初始Chlorophyll-a 濃度增加并超過此值時(shí)都會(huì)降低Chlorophyll-a 的去除速率，這可以歸因于銅綠微囊藻的抑制作用。另一方面，在低Chlorophyll-a濃度下較低的生物降解速率是受底物濃度的影響，其中可用于微生物降解的Chlorophyll-a較少。

圖2 不同初始Chlorophyll-a濃度對(duì)菌株降解過程的影響

在任何生物降解過程中都涉及將生物質(zhì)（菌株）的特定生長(zhǎng)速率與底物（Chlorophyll-a）的消耗速率的相互關(guān)系。微生物的生長(zhǎng)可以解釋為活細(xì)胞數(shù)量的增加或生物量的增加，微生物生長(zhǎng)與Chlorophyll-a 濃度之間的關(guān)系可被認(rèn)為是決定微生物處理各種濃度的銅綠微囊藻中降解效率的關(guān)鍵因素。在銅綠微囊藻微生物降解試驗(yàn)中，以藻液中Chlorophyll-a 作為底物，因此推測(cè)Chlorophyll-a 濃度與微生物生長(zhǎng)速率存在關(guān)聯(lián)性。而根據(jù)Chlorophyll-a 濃度范圍，可以使用非抑制性或抑制性動(dòng)力學(xué)模型來估算這種非線性關(guān)系。Monod模型和Haldane 模型是兩種生物降解模型。Monod 模型認(rèn)為銅綠微囊藻是非抑制性化合物，忽略其對(duì)菌株的抑制作用，對(duì)底物生物降解，一般采用Monod動(dòng)力學(xué)模型描述微生物的比降解速率，但有的底物本身在被降解的同時(shí)會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生一定的毒性，當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)會(huì)抑制底物的降解。故用Haldane 模型（圖3），因其考慮了銅綠微囊藻的抑制作用，見式(1)。

圖3 菌株生長(zhǎng)速率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Haldane模型擬合

式中，為微生物比增長(zhǎng)速率，d；為微生物最大比生長(zhǎng)速率，d；為底物濃度，mg/m；為半飽和速率常數(shù)，mg/m；為微生物生長(zhǎng)抑制常數(shù)，mg/m。

利用式(1)中關(guān)系，Haldane 模型可預(yù)測(cè)隨著銅綠微囊藻的濃度變化的菌株生物降解率（），其中菌株比生長(zhǎng)速率（）是由菌體細(xì)胞干質(zhì)量和時(shí)間半對(duì)數(shù)圖繪制最小二乘擬合而得。使用Origin非線性回歸將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合到Haldane 模型，該模型使用Levenberg-Marquardt算法查找在數(shù)據(jù)與模型方程之間具有最佳擬合的參數(shù)。將模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，Haldane 抑制模型具有很好的擬合度，其中最大比生長(zhǎng)速率（）為(1.046±0.12)d，半飽和常數(shù)（）為(896.92±49.16)mg/m，抑制常數(shù)（）為(1568.95±123.14)mg/m。觀察到的比生長(zhǎng)速率隨著底物濃度增加到一定濃度而線性增加，這與裴海燕等的研究結(jié)果類似，當(dāng)銅綠微囊藻中Chlorophyll-a 濃度在0～1568.95mg/m時(shí)，菌株HL對(duì)藻類降解速度與藻類濃度呈線性關(guān)系。然而在該臨界濃度之后，在Haldane 模型中觀察到急劇下降，尤其當(dāng)濃度高于1568.95mg/m時(shí)，對(duì)銅綠微囊藻的生物降解能力具有相當(dāng)大的抑制作用。

2.4 溶藻效果的電鏡觀察

采用掃描電鏡對(duì)菌株作用于銅綠微囊藻細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，如圖4所示，其中圖4(a)為對(duì)照組藻細(xì)胞，直徑為2～3μm，藻細(xì)胞形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整，呈現(xiàn)出規(guī)則的球形且藻細(xì)胞表面完好。圖4(b)～(d)為溶藻階段3天、5天、7天的藻細(xì)胞形態(tài)。試驗(yàn)中前期（3天、5天）藻細(xì)胞經(jīng)過菌株HL的作用后，形態(tài)發(fā)生變化，藻細(xì)胞細(xì)胞壁被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較圖4(a)而言變得松垮干癟，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空化，藻細(xì)胞之間緊密地堆疊在一起，可能是藻細(xì)胞表面的黏質(zhì)膠被破壞，使得細(xì)胞周圍黏性物質(zhì)增加，說明菌株HL 能夠釋放某種或某些物質(zhì)致使藻細(xì)胞破裂死亡。至試驗(yàn)后期（7天）時(shí)，圖4(d)中藻細(xì)胞幾乎均破裂，這也印證三效工程菌HL 在7天時(shí)的高溶藻率。

圖4 菌株HL的溶藻效果電鏡圖

2.5 菌株的溶藻作用組分

不同菌液處理銅綠微囊藻可能會(huì)造成溶藻細(xì)菌HL的溶藻效果有所差異，試驗(yàn)結(jié)果如圖5，由圖5可見，發(fā)酵液溶藻能力高于其他試驗(yàn)樣本，7天溶藻率為80.83%%±0.42%；經(jīng)0.22μm 針式濾除器除去菌體后的發(fā)酵液仍有溶藻效應(yīng)，7 天溶藻率為76.17%±2.31%，說明HL菌并未因菌體的去除而失去溶藻效應(yīng)，推測(cè)HL 菌主要溶藻方式為間接溶藻，而溶藻細(xì)菌發(fā)酵液溶藻率比無菌發(fā)酵液溶藻率高，可能是發(fā)酵液的菌體仍在繼續(xù)分泌某種活性物質(zhì)；菌懸液在7天溶藻過程中沒有產(chǎn)生明顯溶藻效應(yīng)，7 天溶藻率為6.78%±0.40%，推測(cè)菌體在遇到新環(huán)境時(shí)，能夠再次分泌溶藻活性產(chǎn)物，同時(shí)也驗(yàn)證了發(fā)酵液溶藻率高于無菌發(fā)酵液溶藻率的原因；經(jīng)高溫處理的菌體發(fā)酵液依舊具有溶藻能力，7天溶藻率為65.9%±0.36%，相較于發(fā)酵液的溶藻率有一定的下降，推測(cè)有多種溶藻物質(zhì)，有溶藻物質(zhì)具有耐高溫特性；液培本身具有一定的溶藻能力，7天溶藻率為13.75%±0.21%。

圖5 不同處理方式對(duì)銅綠微囊藻的效果

2.6 溶藻產(chǎn)物的三維熒光分析

三維熒光光譜可以對(duì)熒光化合物進(jìn)行定性定量分析，菌株HL 溶藻產(chǎn)物的熒光特性如圖6 所示。試驗(yàn)主要產(chǎn)生2個(gè)明顯的熒光基團(tuán)，主要涉及的是含有類色氨酸的微生物溶解性降解產(chǎn)物、生物來源的類蛋白質(zhì)物質(zhì)與類腐殖質(zhì)熒光峰。從圖6中可以看出，在對(duì)照組中，峰D 與峰E 清晰可見，而峰A、B、C強(qiáng)度低而不清楚。峰A屬于Ⅰ區(qū)，主要代表包括酪氨酸等芳香族蛋白。峰B屬于Ⅱ區(qū)，主要代表包括色氨酸等芳香族蛋白。峰C屬于Ⅲ區(qū)，主要代表包括富里酸類物質(zhì)。峰D屬于Ⅳ區(qū)，主要代表包括微生物溶解性降解產(chǎn)物樣品（SMP）。峰E屬于Ⅴ區(qū)，主要代表包括腐殖酸有機(jī)物，該部分物質(zhì)主要是由藻細(xì)胞死亡后所產(chǎn)生的，較低的響應(yīng)值說明此時(shí)藻類活性好。暴露于菌株HL 7 天后，與對(duì)照組相比，峰D 的熒光強(qiáng)度減少，而A、B、C、E 的熒光強(qiáng)度增加。該結(jié)果表明，在菌株作用下，釋放出芳香族氨基酸等活性物質(zhì)造成銅綠微囊藻藻細(xì)胞破裂，繼而導(dǎo)致腐殖酸物質(zhì)的大量釋放。

圖6 溶藻進(jìn)程中三維熒光圖

2.7 溶藻產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜分析

應(yīng)用FTIR對(duì)對(duì)照組和菌株HL發(fā)酵液處理后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。由圖7 可見，對(duì)照組和處理組的紅外光譜主要吸收峰位置大致一致，峰形非常相似，但各吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度有所差異，用菌株處理銅綠微囊藻的吸收峰強(qiáng)度比空白組弱。溶藻前后的樣品光譜圖均主要產(chǎn)生3個(gè)峰，由于吸收峰強(qiáng)度與化學(xué)鍵之間的極性呈正相關(guān)關(guān)系而出現(xiàn)不同強(qiáng)度的峰，峰的位置說明溶藻前后的銅綠微囊藻液中存在相同的官能團(tuán)。從峰的歸屬看，A 處在3134.24cm吸收峰相對(duì)較弱，尖銳峰形，屬于—NH 鍵伸縮振動(dòng)所在位置，推測(cè)是酰胺類化合物存在，可能為類腐殖酸等物質(zhì)；B 處在1637.27cm為酰胺類Ⅰ帶，是C==O 鍵伸縮振動(dòng)區(qū)，說明對(duì)照組與試驗(yàn)組均含有酰胺類物質(zhì)且銅綠微囊藻的細(xì)胞蛋白質(zhì)被破壞；C 處在1400.58cm處有最強(qiáng)特征峰，強(qiáng)度大，峰尖銳，屬于COO鍵對(duì)稱伸縮，表明藻液中可能有芳香族氨基酸存在，可能是由于藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，溢出的細(xì)胞質(zhì)被吸收。在1083.72cm處的吸收峰是伯醇C—O伸縮振動(dòng)區(qū)。此外，在2935cm附近還存在來自于蛋白質(zhì)和脂類的—CH、—CH對(duì)稱、反對(duì)稱運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的峰。結(jié)合上述峰分析、SEM圖及三維熒光圖來看，對(duì)照組中藻細(xì)胞內(nèi)含有酰胺類物質(zhì)，通過菌株HL 間接溶藻的作用，藻液中酰胺類物質(zhì)濃度發(fā)生變化，可能是菌株HL 釋放分泌芳香族氨基酸等活性物質(zhì)破壞藻細(xì)胞壁、藻蛋白質(zhì)，藻細(xì)胞破碎死亡，產(chǎn)生類腐殖酸類物質(zhì)。

圖7 菌株HL溶藻產(chǎn)物紅外光譜圖

3 結(jié)論

（1）經(jīng)原生質(zhì)融合出的融合菌株HL 表現(xiàn)出高效溶藻和穩(wěn)定脫氮除磷能力，在7天的溶藻率、脫氮、除磷率分別為(81.61±1.94)%、(58.64±1.07)%和(61.78±1.32)%。

（2） 菌株HL 降解銅綠微囊藻的過程符合Haldane 模型，其中最大比生長(zhǎng)速率（） 為(1.046±0.12)d，半飽和常數(shù)（）為(896.92±49.16)mg/m，抑制常數(shù)（）為(1568.95±123.14)mg/m。當(dāng)濃度大于(1568.95±123.14)mg/m時(shí)，銅綠微囊藻會(huì)對(duì)菌株HL降解Chlorophyll-a產(chǎn)生抑制作用。

（3）通過對(duì)菌株作用組分判定及掃描電鏡可以得出，菌株HL 的溶藻手段為間接溶藻，對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞壁進(jìn)行破壞，導(dǎo)致藻細(xì)胞失活，藻細(xì)胞物質(zhì)流失而死亡。由三維熒光與紅外光譜分析可以初步判斷：通過釋放芳香族氨基酸等活性物質(zhì)破壞藻細(xì)胞，藻細(xì)胞死亡后釋放大量腐殖酸物質(zhì)。