石榴皮、金銀花、牡丹復(fù)配物體外抗氧化作用評(píng)價(jià)*

王 榮，秦 蘭,2，王娜娜，張德柱，王曉茹，秦 蓓,2

(1 西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500；3 陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司， 陜西 西安 710025；4 陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安 710065)

自由基別名游離基，是人體正常代謝的中間產(chǎn)物，具有強(qiáng)氧化性。自由基作為具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，會(huì)奪取其他細(xì)胞的電子來(lái)維持自身的穩(wěn)定性，當(dāng)體內(nèi)的自由基團(tuán)過(guò)多時(shí)，人體的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，從而造成一系列細(xì)胞損傷反應(yīng)，進(jìn)而引起多種疾病的產(chǎn)生[1]，因此研究和開(kāi)發(fā)抗氧化物質(zhì)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)研究熱點(diǎn)。對(duì)于抗氧化產(chǎn)物的研究，從天然植物中可以提取出黃酮[2]、多酚[3]、皂苷[4]、生物堿[5]等多種抗氧化活性物質(zhì)，它們具有安全無(wú)毒的特點(diǎn)，可以用來(lái)制備抗氧化劑。據(jù)研究將抗氧化活性成分進(jìn)行復(fù)配之后的活性遠(yuǎn)比單一抗氧化劑的活性效要高[6]，因此本實(shí)驗(yàn)采用石榴皮、金銀花、牡丹作為原材料，提取其中的沒(méi)食子酸、綠原酸、丹皮酚[7]來(lái)進(jìn)行抗氧化產(chǎn)物的復(fù)配研究。

在抗氧化產(chǎn)物配制研究之后，評(píng)價(jià)其具有的活性大小對(duì)于抗氧化的研究具有十分重大的意義。當(dāng)前對(duì)抗氧化物質(zhì)的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法主要有自由基清除法，脂質(zhì)過(guò)氧化抑制法等[8]。本實(shí)驗(yàn)則基于酶標(biāo)儀-微孔板，建立DPPH自由基清除、ABTS 自由基清除和紅細(xì)胞氧化損傷模型三個(gè)方面驗(yàn)證此復(fù)配產(chǎn)物的體外抗氧化活性能力大小。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

沒(méi)食子酸-綠原酸-丹皮酚(1∶1∶1)復(fù)配物，自制；維生素C(Vc)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥99%)；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)，ABTS(純度98%)，ABTS標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，上海源葉生物科技有限公司；MDA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：2021032)，SOD測(cè)定試劑盒(20210325)，GSH測(cè)定試劑盒(20210323)，蛋白定量測(cè)定試劑盒(20210324)，南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射(500 mL∶4.5 g)，辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀 器

SQP QUINTIX24-1CN型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；1510型自動(dòng)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技公司；VM-02U渦旋儀,SilentShake公司；202-1AB型電熱恒溫干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；PR-I-5T型超純水機(jī)，四川優(yōu)普科技有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方 法

2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

避光稱取20 mg DPPH至250 mL容量瓶，無(wú)水乙醇定容稀釋獲0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025 mg/mL的系列溶液。酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示DPPH在0.002～0.04 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=10.328x+0.1544，相關(guān)系數(shù)R2=0.9937。

精密稱取復(fù)配產(chǎn)物4.9 mg至250 mL容量瓶，無(wú)水乙醇定容稀釋使其濃度梯度為0.0196、0.0098、0.0049、0.00245、0.001225 mg/mL。精密吸取上述系列濃度與0.04 mg/mL DPPH溶液各100 μL作為實(shí)驗(yàn)組，精密吸取上述系列濃度與無(wú)水乙醇各100 μL作為對(duì)照組，精密吸取0.04 mg/mL DPPH溶液和無(wú)水乙醇各100 μL為標(biāo)準(zhǔn)組。各組避光靜置反應(yīng)30 min，517 nm測(cè)吸光度，計(jì)算清除率和IC50。同時(shí)設(shè)置Vc陽(yáng)性對(duì)照組。

DPPH清除率=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A對(duì)照組)/A標(biāo)準(zhǔn)組]×100%

2.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

避光稱取ABTS自由基粉末32.4 mg，以雙蒸水為溶劑配制3.24 mg/mL的ABTS備用液。稱取K2S208粉末10.5 mg，雙蒸水溶解，得到0.7 mg/mL的K2S208備用液，將以上二種儲(chǔ)備液按體積比1∶1等量混合，得ABTS自由基母液，4 ℃ 冰箱保存10～12 h備用。

精密稱取復(fù)配產(chǎn)物1.4 mg至10 mL容量瓶，無(wú)水乙醇定容稀釋成濃度梯度為0.14、0.035、0.00875、0.0021875、00054688 mg/mL的溶液。精密吸取梯度復(fù)配產(chǎn)物溶液100 μL和稀釋后的ABTS自由基溶液100 μL為實(shí)驗(yàn)組；精密吸取梯度復(fù)配產(chǎn)物100 μL和無(wú)水乙醇100 μL為對(duì)照組；精密吸取無(wú)水乙醇100 μL和稀釋后的ABTS自由基溶液100 μL為標(biāo)準(zhǔn)組，避光反應(yīng)6 min，734 nm處測(cè)吸光度。Vc作為陽(yáng)性對(duì)照，按上述公式計(jì)算清除率和IC50值。

2.3 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.1 紅細(xì)胞懸浮液的制備

大鼠抗凝血液，2500 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀加生理鹽水洗滌三次，按體積比(1:99)向紅細(xì)胞中加入生理鹽水制成10%紅細(xì)胞懸浮液，4 ℃保存。

2.3.2 溶血率的測(cè)定

精密吸取10%紅細(xì)胞懸浮液100 μL和50 μL濃度梯度復(fù)配產(chǎn)物，37 ℃恒溫預(yù)培養(yǎng)30 min，加入 0.2 mg/mL的AAPH溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)立正常組(紅細(xì)胞懸液+生理鹽水)和模型組(紅細(xì)胞懸液+生理鹽水+AAPH溶液)。上述紅細(xì)胞反應(yīng)液分別加入1 mL 生理鹽水和1 mL預(yù)冷雙蒸水，3500 r/min下離心5 min，取上清液，在540 nm處測(cè)吸光度分別記為A、B。按公式計(jì)算溶血率。

溶血率=A/B×100%

2.3.3 紅細(xì)胞MDA含量及SOD和GSH-Px酶活測(cè)定

按2.3.1項(xiàng)下制備紅細(xì)胞懸浮液，按說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量、GSH-Px和SOD酶活力的改變。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS軟件分析進(jìn)行誤差處理，結(jié)果標(biāo)記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，顯著性差異的處理采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，其中P<0.05表明差異顯著，P>0.05表明無(wú)顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

由表1和表2可知，Vc和復(fù)配產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率與其濃度之間存在依賴性的關(guān)系。復(fù)配產(chǎn)物的IC50值約為0.065 mg/mL；Vc濃度為0.022 mg/mL時(shí)清除率便高達(dá)95.22%，其IC50值為0.064 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)中復(fù)配產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力與Vc無(wú)明顯性的差異(P>0.05)，說(shuō)明復(fù)配產(chǎn)物有較好的自由基清除能力。

表1 復(fù)配產(chǎn)物濃度對(duì)DPPH自由基的清除率

表2 Vc對(duì)DPPH自由基的清除率

3.2 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基清除率測(cè)定

由表3可知，Vc在濃度為0.20 mg/mL時(shí)清除率就達(dá)99.77%，清除能力較強(qiáng)。由表4可知，復(fù)配產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的清除率有濃度依賴性。復(fù)配產(chǎn)物IC50值為0.13 mg/mL；Vc的IC50值為0.19 mg/mL。

表3 Vc對(duì)ABTS自由基的清除率

表4 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基的除率

3.3 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)紅細(xì)胞溶血抑制作用

表4顯示，正常組、模型組、藥物組水浴加熱反應(yīng)4 h后，對(duì)照組溶血率高達(dá)78.89%。與模型組相比，隨著復(fù)配產(chǎn)物濃度的逐漸升高，紅細(xì)胞溶血作用被抑制的程度也逐漸增大。在0.00125～0.1 mg/mL濃度之間復(fù)配產(chǎn)物對(duì)AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血有極顯著抑制作用(P<0.01)。而當(dāng)濃度稀釋為 0.00625 mg/mL時(shí)加入的復(fù)配產(chǎn)物對(duì)溶血的抑制作用十分微弱，紅細(xì)胞產(chǎn)生的溶血現(xiàn)象與模型組相比并無(wú)顯著差異 (P>0.05)。以上結(jié)果表明在0.1 mg/mL濃度時(shí)復(fù)配產(chǎn)物對(duì)溶血率的抑制保護(hù)作用最為有效。

表5 不同濃度復(fù)配產(chǎn)物復(fù)對(duì)紅細(xì)胞溶血抑制作用

3.4 復(fù)配產(chǎn)物對(duì)紅細(xì)胞MDA含量和抗氧化酶活力大小影響

由表6可得，正常組、模型組、藥物組水浴反應(yīng)4 h后，模型組紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量約為15.67 mg/mL，相比于正常組MDA含量大約增加了15倍；與模型組相比，高、中濃度復(fù)配產(chǎn)物顯著降低MDA含量(P<0.01或P<0.05)。經(jīng)AAPH損傷后的GSH-Px酶活力大小與正常組差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，隨著復(fù)配產(chǎn)物濃度的升高，GSH-Px酶活力也隨之增高，高濃度組可顯著提高紅細(xì)胞GSH-Px酶活力(P<0.01)。經(jīng)AAPH損傷后的SOD酶活力強(qiáng)度大小與正常組相比具有差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，高濃度復(fù)配產(chǎn)物可顯著提高SOD酶活力(P<0.05)。

表6 不同濃度復(fù)配產(chǎn)物對(duì)AAPH損傷紅細(xì)胞內(nèi)MDA含量

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取天然植物石榴皮、金銀花、牡丹為原材料，分別提取其中的沒(méi)食子酸、綠原酸、丹皮酚，利用協(xié)同藥理作用將三種抗氧化活性成分進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配具有可重復(fù)性，低成本，低毒等優(yōu)點(diǎn)。

抗氧化產(chǎn)物的制備與其活性的評(píng)價(jià)是緊緊聯(lián)系的。目前抗氧化活性方法有很多，但要全面的評(píng)價(jià)抗氧化產(chǎn)物的活性必須采用兩種以上的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)[8-9]，本實(shí)驗(yàn)則是建立微量 DPPH 自由基清除模型、ABTS 自由基清除模型和紅細(xì)胞氧化損傷模型研究復(fù)配產(chǎn)物的體外抗氧化活性能力大小。結(jié)果顯示此復(fù)配產(chǎn)物具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，可以有效的清除DPPH自由，ABTS自由基，并通過(guò)保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。

綜上，本次實(shí)驗(yàn)合成的復(fù)配產(chǎn)物具有較強(qiáng)體外抗氧化能力，在進(jìn)行天然抗氧化劑的研究中我們?nèi)〉昧诵碌倪M(jìn)展，可以進(jìn)一步研究體內(nèi)抗氧化活性大小最終進(jìn)行抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，本次實(shí)驗(yàn)我們選取的是操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，反應(yīng)終點(diǎn)明顯的三種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，在未來(lái)研究中我們可以進(jìn)一步研究出更多的方法對(duì)抗氧化劑進(jìn)行更加全面的科學(xué)評(píng)價(jià)。