酸棗種子生物學特性研究

武延生, 滑夢玉, 貢江燕, 董曉霞, 李 歡, 曹 萌, 王僧虎

(邢臺學院生物科學與工程學院， 河北 邢臺 054001)

germination rate

酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)耐旱能力強[1]，在我國北方地區(qū)資源儲量較大，太行山區(qū)約48.1%的地域為酸棗適生區(qū)[2]，據(jù)統(tǒng)計，在河北省域內(nèi)約有36萬hm2野生酸棗。酸棗在我國已有2 000余年的開發(fā)利用歷史，酸棗全株各組織器官皆有巨大的經(jīng)濟開發(fā)價值，果實和種子開發(fā)已轉(zhuǎn)化為可觀的經(jīng)濟效益[3]。可通過培育根蘗苗或?qū)嵣邕M行人工繁殖，但由于根蘗苗材料較少，在生產(chǎn)中已逐步放棄，實生苗培育面臨著成活率低、培育成本高的問題。開展酸棗種子生物學研究可從根本上解決種子繁殖效率低的問題，積極發(fā)揮實生苗培育在酸棗生產(chǎn)中的作用。目前關于酸棗種子生物學特性的研究報道不多，對酸棗種子生物學特性研究不夠系統(tǒng)、深入，對影響酸棗種子發(fā)芽的因素調(diào)查不夠全面。本研究對酸棗種子表型進行了深入細致的觀察，對影響酸棗種子發(fā)芽的因素進行了多方面的考察，初步探明了酸棗種子發(fā)芽機制，為深入探究酸棗種子生理機制提供較為全面的觀察資料，為開發(fā)高效酸棗實生苗培育技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器設備

1.1.1實驗材料

酸棗種子采于邢臺學院酸棗實驗基地及附近野生地區(qū)，選擇表面光滑、無裂痕的當年采收種子用于實驗。

1.1.2儀器、設備

數(shù)碼相機(Olympus tough，TG-5)、電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)、生化培養(yǎng)箱(寧波艾德生儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1種子形態(tài)結構觀測

用數(shù)碼相機拍照，對細小結構采用微距和景深合成功能成像。觀測酸棗果核內(nèi)部房室結構時采用平口鉗固定酸棗果核，用細齒鋸鋸開果核。

1.2.2種子含水量測定

取酸棗種子500粒，隨機分成5組，每組100粒。參照于旭東等[4]的方法，將酸棗種子置于(105±0.1)℃電熱鼓風干燥箱中，間隔一定時間稱重一次，在分析天平上稱重，烘至恒重。

1.2.3種子吸水率測定

將酸棗種子用紗布包裹，浸入蒸餾水中，水溫21～24 ℃，稱重前用吸水紙吸干種子表面水分，浸泡6 h后第一次稱重，之后每隔12 h稱重一次，直至重量不增加。實驗分別考察種皮完整(I)、種皮剝除(S)和種子刺破(P)3種條件下的吸水情況。種皮剝除方法是用解剖刀剝除，保持內(nèi)部結構完整、無機械損傷。種皮刺破方法是用錐子于種體中間垂直刺入，橫穿子葉，使一側有孔，另一側完好，孔徑1 mm。吸水率計算公式為，吸水率(%)=[(吸水后質(zhì)量-吸水前質(zhì)量)/吸水前質(zhì)量]×100%。

1.2.4種子發(fā)芽率測定

在培養(yǎng)皿底部鋪上1～2層濾紙，用蒸餾水浸透，在濾紙上平放酸棗種子，密封保濕，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度25 ℃，每24 h 觀察一次。種子萌發(fā)以胚根突破種皮露白為準。

1.2.5種子老化處理

參考文獻[6]的方法并加以改進，取酸棗種子500粒，隨機分成5組，每組100粒，將酸棗種子表面打濕置于密封袋內(nèi)，不得使種子浸入水中，使?jié)穸缺３?00%，溫度40 ℃，分別處理0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。將老化處理后的種子表面洗凈后，置于20～25 ℃陰涼通風處，陰干。

2 結果與分析

2.1 酸棗種子基本特性

酸棗種子位于核殼的子房室內(nèi)，核殼為內(nèi)果皮。核殼較厚，幼胚不易撐破核殼，帶核殼發(fā)芽率(41.7±5.8)%。子房一般由2心皮發(fā)育而成，偶見由3心皮發(fā)育而成，分別形成2室和3室。每個子房室內(nèi)最多含有1粒種子。根據(jù)子房內(nèi)種子數(shù)目，分為單仁種子、雙仁種子和三仁種子，單、雙仁種子常見，三仁種子罕見。酸棗種子呈扁心形，高(6.11±0.63)mm、寬(4.85±0.52)mm、厚(2.80±0.29)mm，質(zhì)量為(0.041 3±0.009 9)g。酸棗種子分內(nèi)外兩側，雙仁種子內(nèi)側平坦，有縱棱(臍條)，外側凸出，而單仁種子的內(nèi)外兩側近似，均凸出(圖1 A、B)。根據(jù)酸棗種子在核殼內(nèi)的位置，分為上下兩端，上端平滑，下端形狀不規(guī)則，略尖，種臍和發(fā)芽口集中于種子下端(圖1 D)。鑒于種臍和發(fā)芽口緊密排列，同時又有明顯臍條結構，由此可以判斷酸棗種子由倒生胚珠發(fā)育而來。酸棗種皮光滑，有光澤，革質(zhì)，厚約0.2 mm，種皮表面常見平滑凹坑(圖1 B、C、D)。種皮顏色多樣，深淺不同，顏色各異，由黃色經(jīng)由紫紅色直至褐色，呈過渡性變化(圖1 E)。將酸棗種子按照黃色、紫紅色和褐色分為3類，粒數(shù)比例約為6∶12∶1，質(zhì)量比例與之相同。野生酸棗種子質(zhì)量差異較大，分布在0.015～0.053 g之間。

將酸棗種子解剖后，發(fā)現(xiàn)酸棗種子共有3種結構，除了種皮和胚外，還存在明顯的胚乳。胚乳呈乳白色，片狀，在上部結合，結合部分為圓形、紫褐色，由上而下包裹住大部分子葉，但未掩蓋胚芽(圖1 F、G)。子葉碩大，表面分布葉脈(圖1 H)。胚乳與胚的質(zhì)量比約為1∶2，但此比例不恒定，變異較大。

酸棗種子經(jīng)干燥處理后，種皮變黑，種皮皺褶增加，有種皮脫落現(xiàn)象(圖2 B)。烘干至36 h時，重量不再減少，含水量為(8.26±0.12)%(圖2 A)。萌發(fā)處理后，干燥處理后的種子不能萌發(fā)。

2.2 酸棗種子吸水性測定

為了考察種皮在酸棗種子吸水過程中的作用，將種皮分別進行了刺破(p)和剝除(r)處理，以完整種皮(i)為對照。研究結果顯示，p處理和r處理的吸水率較i處理明顯升高(圖3 A)?？傮w來看，在三種處理條件下，種子吸水率均不是恒定的，可分為快速吸水期、慢速吸水期和飽和期3個階段。在快速吸水期，三者差異明顯，所需時間和吸水率分別是：12 h、(55.47±4.43)%(i)，6 h、(52.00±5.24)%(p)和6 h、(68.18±4.39)%(r)。三者相比，p處理和r處理后，快速吸水期明顯縮短，由12 h 縮短至6 h。在慢速吸水期，三者持續(xù)時間和吸水率分別是：52 h、(82.50±5.21)%(i)，18 h、(77.69±4.91)%(p)，18 h和(88.64±5.13)%(r)。三者相比，p處理和r處理縮短吸水時間，由52 h縮短至18 h，吸水率達到頂峰。表明種皮對種子吸水具有很大的阻礙作用。在飽和期，酸棗種子質(zhì)量略有下降，分別下降了(10.18±2.43)%(i)、(3.72±2.19)%(p)和(5.13±2.51)%(r)。三者相比，完整種子下降幅度最大。實驗數(shù)據(jù)暗示，酸棗種子在浸泡處理中可能發(fā)生了呼吸作用，由此造成種子質(zhì)量下降，完整種皮為種體內(nèi)部結構提供了較好的保護屏障，呼吸效率較高，而p處理和r處理破壞了種皮的保護作用，在一定程度上妨礙了酸棗種子呼吸作用的正常進行。此外，浸泡處理后，種皮顏色加深成為褐色(圖3 B)。

注：A為核殼內(nèi)的酸棗種子；B為酸棗種子內(nèi)(i)外(o)兩側；C為酸棗種子上下兩端；D為酸棗種子在核殼內(nèi)的位置；E為酸棗種子表皮顏色類型；F為去除種皮的酸棗種子；G為酸棗種子胚乳；H為酸棗種子胚。圖1 酸棗種子形態(tài)結構Fig.1 Morphological structure of wild jujube seeds

注：A為酸棗種子千粒重隨干燥時間的變化過程；B為干燥處理的酸棗種子(d)與對照(c)的比較。圖2 酸棗種子干燥過程Fig.2 Drying process of wild jujube seeds

為了進一步探究酸棗種子不同部位的吸水速率，分別將酸棗種子按照側面浸水(l)、上端浸水(t)、下端浸水(b)3種方式放置，考察酸棗種子萌發(fā)情況。平放是將酸棗種子平放于培養(yǎng)皿內(nèi)用蒸餾水浸濕的濾紙上，是進行酸棗培養(yǎng)時所采用的通用放置方式。后兩種方式是用手術刀在厚度為0.6 cm的泡沫上扎孔，將酸棗種子豎直置于其中并貫穿泡沫，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)放水，使酸棗種子上端或下端浸入水中0.05～0.10 cm。研究結果顯示，三種處理條件下發(fā)芽率差異顯著，在萌發(fā)第6天時，三者發(fā)芽率分別為(81.30±4.52)%(l)、(27.43±3.35)%(t)、(54.86±4.8)%(b)(圖3 C)。表明酸棗種子下端吸水率高于上端，這可能是由于酸棗種子下端存在種臍、發(fā)芽口，二者的吸水速率高于種皮部位，而對于l處理，由于其與培養(yǎng)皿表面接觸面積大，吸水速率也相對較高所致。

2.3 種皮及其顏色、胚乳和種體大小對酸棗種子發(fā)芽的影響

種胚是發(fā)芽部位，種皮、胚乳發(fā)揮支持作用，為了考察種皮、胚乳在發(fā)芽過程中的作用，對酸棗種子做了兩種處理，分別是剝除種皮(r)和同時剝除種皮、胚乳只剩種胚(e)，以完整種子(i)為對照。發(fā)芽率統(tǒng)計結果顯示，r、e處理使啟動發(fā)芽時間提前，萌發(fā)2 d時，r、e處理的發(fā)芽率分別為(21.0±1.9)%和(10.1±2.3)%，而對照(i)僅為(1.9±0.7)%；發(fā)芽率明顯提高，培養(yǎng)到第5天時，r、e處理的發(fā)芽率分別是(80.9±5.1)%和(91.2±4.3)%，明顯高于對照(73.1±2.7)%(i)(圖4 A)。表明胚乳、種皮對胚根生長均有一定抑制作用，種皮的抑制作用更加明顯。

下胚軸和胚根生長觀察結果顯示，i處理使胚根快速生長，生長速率遠高于對照；e處理使胚根生長啟動萌發(fā)較早，但生長緩慢(圖4 C、D)。表明胚乳通過提供營養(yǎng)使胚根持續(xù)生長，種皮除了阻礙胚獲取水分外，還有可能分泌抑制胚根生長的物質(zhì)。

為了進一步探究酸棗種皮水溶性浸出物對白菜(Brassicapekinensis)種子發(fā)芽率的影響，參考杜會聰?shù)萚5]的方法進行并適當調(diào)整，分別將20粒和50粒酸棗種子的完整種皮磨碎后置于10 mL蒸餾水中，在4 ℃條件下浸泡24 h，濾去不溶物，以浸提液培養(yǎng)白菜種子。研究結果顯示，酸棗種皮浸出物對白菜種子有一定的抑制作用，培養(yǎng)3 d時，20粒和50粒種子種皮浸出液培養(yǎng)的白菜種子發(fā)芽率分別為對照的(90.48±5.32)%和(79.76±4.91)%(圖4 B)。表明酸棗種皮的水溶性物質(zhì)中含有抑制種子萌發(fā)的成分。

野生酸棗種子種皮顏色差異較大，選擇差異較為明顯的黃色、紫色和褐色3類種子進行了發(fā)芽實驗。研究結果顯示，三種顏色種子的發(fā)芽現(xiàn)象差異較為明顯，黃色與紫色種子的發(fā)芽率和胚根生長較為接近，而二者與褐色種子相差較遠，黃、紫兩色種子的發(fā)芽率明顯高于褐色種子，其下胚軸和胚根生長長度也明顯高于褐色種子(圖5)。表明三種種皮顏色的種子其生活力存在明顯差異。

野生酸棗種子質(zhì)量差異較大，為了探究種體質(zhì)量與發(fā)芽率之間的關系，將種子分為大(0.05～0.06 g)、中(0.03～0.04 g)和小(0.02～0.03 g)3類種子進行發(fā)芽實驗。結果顯示，3類種子的發(fā)芽情況差異較為明顯，表現(xiàn)在3個方面：啟動發(fā)芽時間不同，小種子培養(yǎng)1～2 d即有發(fā)芽現(xiàn)象，中種子培養(yǎng)2～3 d有發(fā)芽現(xiàn)象，大種子則在培養(yǎng)3～4 d后，才能觀察到明顯的萌發(fā)現(xiàn)象；發(fā)芽率不同，在培養(yǎng)第9天時，大中小3類種子的發(fā)芽率分別為(68±4.6)%、(91±5.9)%和(81±5.2)%(圖6 A)；胚根生長長度不同，在培養(yǎng)第11天時，大中小3類種子的胚根長度分別為(87.1±6.3)mm、(113.6±8.9)mm和(107.1±7.7)mm(圖6 B)。表明大中小3類種子生活力存在明顯差異，中小種子生活力明顯高于大種子。

2.4 老化處理對酸棗種子發(fā)芽的影響

酸棗種子老化處理后，出現(xiàn)不同程度的發(fā)霉現(xiàn)象，隨著老化時間延長，霉變程度相應加深(圖7 B)，在老化8 d時，霉變程度陡然升高，達到69%(圖7 A)。老化處理對發(fā)芽率影響明顯，表現(xiàn)在2個方面：隨著老化處理時間延長，發(fā)芽率逐步降低，老化0 d、1 d、2 d、3 d、4 d的發(fā)芽率依次為(88.4±3.4)%、(71.5±3.1)%、(70.2±2.7)%、(60.0±3.1)%和(6.5±1.1)%；老化處理使酸棗種子發(fā)芽時間提前，老化處理2 d、3 d的種子在萌發(fā)第3天時，發(fā)芽率達到(37±3.8)%和(44±4.7)%，遠高于對照的(22±3.3)%(圖7 C)。表明老化處理加速了酸棗種子成熟，同時也對酸棗種子的生活力造成了負面影響。

2.5 不同培養(yǎng)條件對酸棗種子發(fā)芽的影響

以含有不同濃度聚乙二醇(PEG)的溶液模擬不同的干旱條件，分別設置了0%、5%、10%、15%和20%的PEG溶液培養(yǎng)酸棗種子，培養(yǎng)12 d后，發(fā)芽率達到最高，分別為(72.5±6.3)%、(40.8±5.9)%、(34.5±4.7)%和(11.5±4.1)%(圖8 A)。表明隨著PEG濃度升高，發(fā)芽率逐步下降。

注：A、C為酸棗種子分別在i、r和e 3種狀態(tài)下的發(fā)芽率(A)和下胚軸、胚根生長長度(C)；B為分別用不同濃度酸棗種皮浸出物培養(yǎng)的白菜種子的發(fā)芽率；D為酸棗種子分別在i、r和e 3種狀態(tài)下的下胚軸和胚根生長情況。圖4 種皮、胚乳對酸棗種子發(fā)芽的影響Fig.4 Effects of seed coat and endosperm on wild jujube seed germination

圖5 不同種皮顏色對酸棗種子發(fā)芽率(A)和下胚軸、胚根生長長度(B)的影響Fig.5 Effect of different colors of seed coat on germination rate (A) and length of hypocotyl and radical (B) of wild jujube seeds

在低溫(10 ℃)和高溫(40 ℃)條件下，酸棗種子無萌發(fā)跡象。在15～35 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，發(fā)芽率表現(xiàn)為“低-高-低”的變化趨勢，25 ℃發(fā)芽率最高，為(83±7.4)%。在25 ℃隨著培養(yǎng)溫度逐步降低，最高發(fā)芽率逐步降低，達到最高發(fā)芽率所需時間也逐步延長；在25 ℃隨著培養(yǎng)溫度逐步升高，最高發(fā)芽率逐步降低，達到最高發(fā)芽率所需時間逐步縮短(圖8 B)。

分別以含0%、12.5%、50%和100%的MS溶液為培養(yǎng)基培養(yǎng)酸棗種子，培養(yǎng)到第8天時，在各培養(yǎng)基中發(fā)芽率均達到最高，分別為(83.6±5.1)%、(82.5±4.3)%、(74.8±4.7)%、(22.0±3.2)%(圖8 C)。結果顯示，在培養(yǎng)基中，隨著MS鹽濃度的升高，酸棗種子發(fā)芽率逐步下降，這表明酸棗種子在發(fā)芽過程中不需要施加營養(yǎng)鹽。

圖6 酸棗種子種體大小對發(fā)芽率(A)和下胚軸、胚根生長(B)的影響Fig.6 Effects of seed body size on germination rate (A) and growth of hypocotyl and radicle (B) of wild jujube seeds.

注：A、B為不同老化處理時間對酸棗種子霉變率及霉變情況的影響；C為不同老化處理時間對酸棗種子發(fā)芽率的影響。圖7 不同老化處理時間對酸棗種子狀態(tài)和發(fā)芽的影響Fig.7 Effects of different aging treatment time on wild jujube seed state and germination

分別以含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L葡萄糖的溶液為培養(yǎng)基培養(yǎng)酸棗種子，培養(yǎng)到第8天時發(fā)芽率達到最高，分別為(83.9±6.1)%、(65.3±5.1)%、(57.68±4.9)%和(13.11±4.3)%(圖8 D)。結果顯示，隨著葡萄糖濃度升高，發(fā)芽率逐步下降，這表明酸棗種子在發(fā)芽過程中不需要施加葡萄糖。

將培養(yǎng)酸棗種子的培養(yǎng)皿用黑色攝影布包裹3層，嚴禁外界光線進入，以未用攝影布遮蓋培養(yǎng)的酸棗種子為對照。結果顯示，光照條件下的最高發(fā)芽率[(92.1±4.7)%]顯著高于黑暗條件下的發(fā)芽率[(78.2±4.4)%](圖8 E)，差異顯著(t檢驗，p<0.05)。表明光照對酸棗種子發(fā)芽有一定的促進作用。

分別以Tris和MES配制pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11不同酸度溶液培養(yǎng)酸棗種子。結果顯示，在pH值為8時，發(fā)芽率最高，達(92.3±5.6)%，其次為pH 7時的發(fā)芽率，為(86.1±4.8)%。隨著酸度向兩側延伸，發(fā)芽率逐步下降，在pH 3時，發(fā)芽率為(4.2±1.6)%，pH 11時的發(fā)芽率為0(圖8 F)。表明酸度對酸棗種子發(fā)芽有明顯的影響，在中性及偏堿性條件下較適宜酸棗種子發(fā)芽。

3 討 論

3.1 酸棗種子表型特征研究

本研究對酸棗種子形態(tài)特征進行系統(tǒng)觀察，酸棗種子由倒生胚珠發(fā)育而來，種臍與發(fā)芽口集中于種體下端，種子整體形狀呈扁心形，由外而內(nèi)依次含有種皮、胚乳和胚3部分結構(圖1 F、G、H)，胚乳所占比例較大，約為果體總重的1/3，子葉碩大，符合鼠李科棗屬的一般特征[7]。種體含水量為(8.26±0.12)%(圖2 A、B)，含水量偏小，屬于油料作物種子[8]。野生酸棗種皮顏色差異較大，可分為黃、紫紅和褐色3種基本顏色，其中紫色種子所占比例最高，約占63%。野生酸棗種子質(zhì)量差異較大，分布在0.015～0.053 g之間，平均(0.041 3±0.009 9)g。

3.2 酸棗種子發(fā)芽的影響因素

酸棗種子發(fā)芽能力與種體自身狀況(種皮以及種皮顏色、胚乳、種體大小和老化狀態(tài))和外界條件(水分、溫度、光照和酸度)關系密切。

注：A、B、E和F分別表示不同水分(A)、溫度(B)、MS鹽濃度(C)、葡萄糖濃度(D)、光照(E)和酸度(F)培養(yǎng)條件對酸棗種子發(fā)芽率的影響。圖8 不同培養(yǎng)條件對酸棗種子發(fā)芽的作用效果Fig.8 Effects of different culture conditions on germination of wild jujube seeds

在本研究中發(fā)現(xiàn)，種皮本身以及種皮顏色均影響酸棗種子發(fā)芽。首先，酸棗種皮作為一種機械結構，對種子吸水有一定的阻礙作用(圖3 A)，但這種阻礙作用不是完全消極的，本研究表明，種皮有助于酸棗種子在吸水過程中促進種子成熟。酸棗種皮各部位的吸水能力不是完全均一的，在種臍與發(fā)芽口集中分布下端區(qū)域吸水能力最強(圖3 B)。其次，酸棗種皮中的水溶性物質(zhì)對酸棗種子發(fā)芽有抑制作用(圖4 A、B)。種子內(nèi)普遍含有發(fā)芽抑制性物質(zhì)，報道顯示多數(shù)種子的抑制性物質(zhì)位于種仁[5,9]，本研究的酸棗種子的抑制性物質(zhì)在種皮中以水溶性形式存在。第三，酸棗種皮顏色與種子發(fā)芽率關系密切，表現(xiàn)為“種皮顏色越深，發(fā)芽率越低”的趨勢(圖5 A)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，酸棗種皮顏色與干燥脫水處理(圖2 B)、水中浸泡處理(圖3 B)、老化處理(圖7 B)正相關，這些數(shù)據(jù)暗示，種皮顏色變深可能與種皮老化存在密切的正相關關系。酸棗胚乳在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這可從兩方面證據(jù)進行佐證：酸棗胚乳體積碩大；去除胚乳，胚胎發(fā)育受到抑制(圖4 A、C、D)。種子大小與種子發(fā)芽率之間存在著微妙的關系，種子質(zhì)量顯著高于平均質(zhì)量的種子，其活力低于質(zhì)量中等或偏小型的種子。

本研究結果表明，酸棗種子發(fā)芽喜水(圖8 A)，但不喜無機鹽、葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)(圖8 C、D)，適宜發(fā)芽溫度為25 ℃(圖8 B)，喜中性偏堿條件(pH值7～8)(圖8 F)，光照對種子發(fā)芽有一定的促進作用(圖8 E)。酸棗種子發(fā)芽所需條件與酸棗種子結構特點和酸棗所生活的自然環(huán)境有著密切的內(nèi)在聯(lián)系。酸棗在我國主要分布在中部地區(qū)，屬于溫帶氣候，土壤酸度為中性偏堿性，春季干燥少雨，光照充分，春季溫度與酸棗種子適宜萌發(fā)溫度接近。酸棗種子發(fā)芽所需的溫度、酸度、光照等條件顯示，酸棗在多年的進化中，已經(jīng)較好地適應了當?shù)氐沫h(huán)境條件。酸棗種子碩大的胚乳與幼苗突破厚密的核殼障礙(圖1 A)需要巨大的能量存在著密切的內(nèi)在聯(lián)系，胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的分解與酸棗種子對水的強烈需求，以及酸棗種子對無機鹽和葡萄糖等營養(yǎng)成分的拒絕具有密不可分的關系。