奶牛源鼠李糖乳桿菌的12C6+重離子束誘變選育

蔣 威，沈文祥,2，鄭娟善,2，武小虎，楊雅媛，呂亞楠，王勝義，嚴(yán)作廷,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠以碳水化合物為底物，發(fā)酵產(chǎn)生具有抑菌活性的有機(jī)酸、HO及細(xì)菌素等次級(jí)代謝物的細(xì)菌的統(tǒng)稱，此外還能夠產(chǎn)生功能性的胞外多糖，其在食品及醫(yī)藥中具有多種益生功能，菌體通常無(wú)芽孢，屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，廣泛存在于健康動(dòng)物的口腔、胃腸道及生殖道。乳酸菌種類繁多，作用廣泛，它們以其潛在的健康和營(yíng)養(yǎng)益生作用而得名，因此被認(rèn)為是“具有益生性能的微生物”或“當(dāng)攝入足夠量的活的乳酸菌株，可對(duì)宿主健康產(chǎn)生益處”。鼠李糖乳桿菌是乳酸菌中益生性菌株的最重要來(lái)源之一，隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，人們對(duì)其需求也與日俱增，不管是食品發(fā)酵，還是以乳酸菌為主要菌種的益生菌制劑都對(duì)其生長(zhǎng)、產(chǎn)酸及抑菌活性提出了新的要求；此外，利用乳酸菌活菌制劑或其代謝產(chǎn)物來(lái)對(duì)人類及動(dòng)物疾病進(jìn)行預(yù)防和治療，已切實(shí)可行。但從動(dòng)物或自然界分離的乳酸菌株存在代謝物產(chǎn)量低或不穩(wěn)定的問(wèn)題。所以，探索提高應(yīng)用乳酸菌性能的新策略是當(dāng)前重點(diǎn)研究的方向，而誘變選育無(wú)疑是當(dāng)前的最佳選擇之一。

誘變選育是借助各種誘變?cè)椿蛘T變劑的理化因素來(lái)處理細(xì)胞，加速基因突變，再建立適當(dāng)?shù)暮Y選方法以獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)良株的現(xiàn)代育種方式之一。誘變選育的理論是基于基因突變。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐，誘變選育技術(shù)已有了長(zhǎng)足的發(fā)展，出現(xiàn)了傳統(tǒng)輻射誘變（X 射線、射線、紫外線和激光等）、化學(xué)誘變（甲基磺酸乙酯、氮芥、亞硝酸和亞硝基胍等）、紫外線-亞硝基弧復(fù)合誘變、常壓室溫等離子體誘變及太空誘變等。重離子束誘變具有能量沉積、動(dòng)量傳遞和遺傳物質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移和重排、損傷后修復(fù)效應(yīng)小及不易回復(fù)突變等突出特點(diǎn)。重離子的能量通常較高，一般每核子在GeV 量級(jí)甚至更高，地面上通過(guò)加速器獲得的重離子，能量可從keV 量級(jí)到GeV 量級(jí)。相較于常規(guī)X、及紫外線等, 重離子束在穿過(guò)生物介質(zhì)時(shí)，將大量能量沉積在其移動(dòng)的徑跡上，造成細(xì)胞核中DNA 分子的顯著損傷，故而表現(xiàn)出更高的誘變效率，所以通過(guò)重離子束輻照來(lái)改變微生物的生產(chǎn)性能，提高微生物的產(chǎn)出，是一種切實(shí)有效的菌種育種方法。

目前利用C重離子束輻照誘變技術(shù)在阿維鏈霉菌、嗜熱乳桿菌、谷氨酸棒狀桿菌的菌種改良中已經(jīng)取得了很好的效果，但尚未見(jiàn)重離子束誘變鼠李糖乳桿菌的研究，故本研究利用C重離子束對(duì)奶牛源鼠李糖乳桿菌臨床分離株進(jìn)行誘變選育，以期獲得體外益生性更強(qiáng)的鼠李糖乳桿菌菌株，為乳酸菌防治奶牛生殖道疾病的基礎(chǔ)研究提供標(biāo)的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原始野生菌株鼠李糖乳桿菌臨床分離株JF12-1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存；大腸桿菌為ATCC29922 廣東環(huán)凱微生物科技；MRS 肉湯培養(yǎng)基及固體改良培養(yǎng)基 購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技；碳酸鈣AR 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚紫99% 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；葡糖糖AR 天津市大茂化學(xué)試劑廠；細(xì)菌DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Kit D3350）Omega Bio-Tek 公司；16S rDNA 通用引物 西安擎科生物；1.5%瓊脂糖凝膠粉 北京索萊寶生物。

C重離子束 中科院蘭州物理研究所提供；LAI-3-T 厭氧培養(yǎng)箱 廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；WP-UP 超純水機(jī) 賽默飛有限公司；細(xì)菌濁度儀北京天安聯(lián)合科技有限公司；UV-BlueStarPlus 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；PHSJ-F 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SBA-40D 生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所； LDZX-30KB 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；1108-150 型游標(biāo)卡尺 中巽云科技有限公司；BSA224S 型十萬(wàn)分之一分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DYCP-31DN 瓊脂糖核酸電泳儀 北京六一有限公司；Biometra TOne 96G PCR 儀 德國(guó)耶拿公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 種子及斜面培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取MRS 固體改良培養(yǎng)基成品54 g，溶解于1 L 蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0±0.3，121 ℃，高壓滅菌15 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取MRS 成品固體改良培養(yǎng)基54 g，加入10%葡萄糖，滅菌方法同上；溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱SMBVC）：MRS 固體改良培養(yǎng)基成品中加入0.01%溴甲酚紫和0.25%的碳酸鈣，滅菌方法同上。

1.2.2 原始野生菌株JF12-1 特性測(cè)定

1.2.2.1 生長(zhǎng)曲線繪制 將斜面保存的原始野生菌株JF12-1 用接種環(huán)刮下，接種于種子培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h 以復(fù)壯，4 ℃，4000×g 離心15 min，以獲得菌體，PBS 洗滌2 次，利用細(xì)菌濁度儀重懸調(diào)整濃度至1.0×10CFU/mL，獲得復(fù)壯后初始種子菌懸液。取菌懸液按1%（V/V）的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃、300 r/min 厭氧振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h 取樣，測(cè)定菌液的OD，參照DIANA 等報(bào)道，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD 值為縱坐標(biāo)，繪制原始野生菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.2 生物傳感儀測(cè)定乳酸含量 SBA-40D 型生物傳感儀利用專一性和高效性的固定化酶為分子識(shí)別的原件，具有兩支生物性的探測(cè)電極，并由微電腦控制，可自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)發(fā)酵樣品中乳酸含量。將1.2.2.1 復(fù)壯后初始種子菌懸液按10%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（250 mL 錐形瓶裝入100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基），于37 ℃、300 r/min 振蕩厭氧發(fā)酵24 h，每隔2 h 取樣發(fā)酵上清，參照張金露等報(bào)道，利用生物傳感儀測(cè)定各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)樣品的乳酸含量（g/L），以時(shí)間值為橫坐標(biāo)，產(chǎn)乳酸量為縱坐標(biāo)，繪制原始野生菌株的產(chǎn)乳酸曲線。

1.2.2.3 酸斑值測(cè)定 取1.2.2.1 復(fù)壯后初始種子菌懸液，連續(xù)稀釋10倍之后取100 μL，利用涂布棒均勻涂布于溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養(yǎng)基（SMBVC），于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，由于乳酸菌的產(chǎn)酸特性會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生融鈣圈，測(cè)定融鈣圈和菌落直徑，按（1）式計(jì)算酸斑值（HC）。

式中，HC 為酸斑值，D為菌落周圍產(chǎn)生的融鈣圈直徑（cm），而D為菌落自身直徑（cm）。

1.2.3 鼠李糖乳桿菌的C重離子束輻照 取1.2.2.1 復(fù)壯后初始種子菌懸液2 mL 置輻照皿中，設(shè)置重離子束C的輻射參數(shù)，利用重離子束C，在吸收劑量率為40 Gy/min 的條件下，分別于0、40、80、120、160、200、300、400 Gy 的輻照劑量下對(duì)原始野生菌株懸浮液分別進(jìn)行輻照處理，每個(gè)輻照劑量下設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4 誘變菌株HC 值與產(chǎn)乳酸關(guān)系的建立 參照王雨辰報(bào)道的方法，將重離子束輻照誘變后的各輻照梯度菌懸液，分別稀釋至10倍之后各取100 μL，均勻涂布于溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養(yǎng)基（SMBVC），置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)各梯度存活菌落數(shù)，計(jì)算各菌落的HC 值；同時(shí)將HC 值不同菌落分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)18 h，同1.2.2.2 所述方法測(cè)定各突變菌株的產(chǎn)乳酸量，得到突變菌株HC 值與其產(chǎn)乳酸量之間的關(guān)系，建立利用突變菌株HC 值進(jìn)行初篩的方法。

1.2.5C重離子束誘變致死率及突變率測(cè)定 重離子束輻照結(jié)束后，將輻照后的菌懸液進(jìn)行連續(xù)稀釋后，吸取0.1 mL 均勻涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上（3 個(gè)重復(fù)），于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)存活菌落數(shù)并確定致死率，繪制圖得到致死率隨輻照劑量變化曲線。同上將突變后的菌懸液均勻涂布于SMBVC 上，形成的單菌落在SMBVC上可以形成透明的溶鈣圈，統(tǒng)計(jì)溶鈣圈直徑及菌落直徑，計(jì)算HC 值，按式（2）計(jì)算致死率，按式（3）和式（4）計(jì)算正負(fù)突變率，繪制致死率和正、負(fù)突變率曲線。最后根據(jù)致死率及突變率確定最佳輻照誘變劑量。

式中，N是輻照后生長(zhǎng)的菌落數(shù)，N是輻照對(duì)照組（0 Gy）生長(zhǎng)菌落數(shù)。N是HC 值比原始野生菌株提高20%及以上菌落數(shù)，N是HC 值比原始野生菌株降低20%及以上菌落數(shù)，N是該輻照劑量下的菌落總數(shù)。

1.2.6 突變菌株的酸斑法初篩 將最佳輻照劑量下的各突變菌株接種于SMBVC 上，計(jì)算各突變菌株的HC 值，篩選出HC 值較原始野生菌株提高25%以上的突變菌株作為初篩后突變菌株。

1.2.7 突變菌株的抑菌圈法復(fù)篩 將初篩后的突變菌株在接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，以大腸桿菌為致病指示菌，對(duì)其體外抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，篩選出抑菌圈直徑較原始野生菌株提高15%以上的菌株，作為復(fù)篩后突變菌株。

1.2.8 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將復(fù)篩后突變菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)傳代9 次，每隔2 代利用1.2.2.2 所述方法測(cè)定其產(chǎn)乳酸量，依據(jù)其產(chǎn)乳酸變化檢測(cè)突變菌株遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9 穩(wěn)定突變株16S rDNA 鑒定 按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取原始野生菌株和穩(wěn)定突變菌株基因組DNA，利用PCR 儀特異性擴(kuò)增各菌株的16S rDNA 片段，引物序列：27F 5′-GAGCGGATAA CAATTTCACACAGG-3′，1492R 5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′，50 μL 的反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)Seq-man軟件拼接后與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，MEGA-X 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)除HC 增加值用百分比表示外，其余結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；利用Excel 2019 和SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。本試驗(yàn)組間比較選用單因素ANOVA 檢驗(yàn)。若假定等方差則用LSD 檢驗(yàn)，若不假定等方差則用鄧尼特T檢驗(yàn)，＜0.05，則差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始野生菌株的生長(zhǎng)特性

對(duì)原始野生菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究，為后期誘變菌株的選育提供依據(jù)。鼠李糖乳桿菌JF12-1 菌體隨時(shí)間生長(zhǎng)規(guī)律如圖1-a，可知0～4 h 階段，菌體生長(zhǎng)緩慢，與培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)；4～12 h，呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此階段乳酸菌株代謝最旺盛、活力最好，適合菌株性狀研究；12～20 h 階段為穩(wěn)定期，其階段菌株代謝穩(wěn)定，適合菌株代謝物研究；20 h 之后開(kāi)始逐漸步入衰亡期，菌體死亡數(shù)開(kāi)始增多。此乳酸菌株的生長(zhǎng)曲線與徐穎等研究中報(bào)道的鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 相同，均于12 h 達(dá)對(duì)數(shù)末期；而與羅素賢等關(guān)于鼠李糖乳桿菌JX-1 的生長(zhǎng)曲線研究結(jié)果不同，該菌株于10 h 末便開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，這可能與菌株來(lái)源及特異性有關(guān)。

發(fā)酵生長(zhǎng)過(guò)程中乳酸產(chǎn)量變化如圖1-b，可知，此鼠李糖乳桿菌菌株在2 h 內(nèi)，代謝緩慢，產(chǎn)乳酸變化不明顯，2～10 h 產(chǎn)乳酸量急劇升高，10～16 h 產(chǎn)乳酸量較前一階段有所放緩，但仍然在升高，16～24 h 產(chǎn)乳酸量基本保持恒定，產(chǎn)乳酸量最高峰值為7.12 g/L。

圖1 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 生長(zhǎng)曲線（a）和產(chǎn)乳酸曲線（b）Fig.1 Growth curve (a) and lactic acid production curve (b) of primitive wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1

乳酸菌在特定的篩選培養(yǎng)基上，菌落會(huì)在代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸作用下于其周圍產(chǎn)生黃色的融鈣圈，其HC 值已作為與突變株比較的優(yōu)良株篩選標(biāo)準(zhǔn)之一。本實(shí)驗(yàn)中鼠李糖乳桿菌JF12-1 在溴甲酚紫-碳酸鈣篩選培養(yǎng)基中產(chǎn)生了明顯的融鈣圈，如圖2。對(duì)篩選培養(yǎng)基上同一菌株的5 個(gè)不同菌落的HC 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，作為原始野生菌株的HC 值，作為后續(xù)突變株篩選的依據(jù)，結(jié)果如表1，結(jié)果顯示原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 平均HC 值為3.23。

圖2 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 融鈣圈效果圖Fig.2 Effect diagram of the original wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1 melting calcium ring

表1 原始野生菌株鼠李糖乳桿菌JF12-1 的菌落HC 值Table 1 HC values of the original wild strain Lactobacillus rhamnosus JF12-1

2.2 誘變后菌株HC 值與其產(chǎn)乳酸關(guān)系

將輻照誘變后的所有突變菌株分別接種到溴甲酚紫-碳酸鈣固體篩選培養(yǎng)基（SMBVC），測(cè)定融鈣圈，計(jì)算菌株HC 值和其對(duì)應(yīng)產(chǎn)乳酸量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照誘變之后的菌株HC 值與其產(chǎn)乳酸量之間存在顯著的正相關(guān)性，以300 Gy 輻照梯度下的誘變后10 株菌株的HC-產(chǎn)乳酸關(guān)系為例（如圖3），由此可見(jiàn)誘變后菌株HC-產(chǎn)乳酸關(guān)系能夠作為高產(chǎn)乳酸突變菌株的篩選方法。

圖3 突變菌株HC 值與其產(chǎn)乳酸量之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation between HC value and lactic acid production of mutant strains

2.3 誘變的最佳輻照劑量

建立致死率曲線和正負(fù)突變率曲線，確定最佳誘變吸收劑量。致死率反映了菌落的存活情況，C重離子束誘變鼠李糖乳桿菌JF12-1 后，各輻照劑量下的致死率變化如圖4-a。致死率隨輻照劑量的增大呈現(xiàn)出先升高后下降，之后又急劇升高的變化規(guī)律。當(dāng)輻照劑量為0～80 Gy 時(shí)，致死率隨輻照劑量的增加而急劇上升；80～120 Gy 時(shí)，致死率隨輻照劑量的增加而出現(xiàn)降低；120～400 Gy 時(shí)，致死率隨輻照劑量的增加而再度急劇升高；菌落半致死輻照劑量約為160 Gy，300 Gy 時(shí)致死率79.86%，400 Gy 時(shí)致死率接近95.39%。本研究中致死率變化呈馬鞍形，與王雨辰等關(guān)于植物乳酸菌JTL 在經(jīng)過(guò)不同輻照劑量的C重離子束輻照后的研究結(jié)果相一致，其致死率雖然隨著輻照吸收劑量的增大而增大，但關(guān)系并非呈線性而呈馬鞍形。但與都雯玥在重離子輻照選育截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌株研究中報(bào)道的致死率曲線呈線性的報(bào)道相反，這可能與菌株特異性有關(guān)。起初在低輻照劑量下，重離子束產(chǎn)生自由基對(duì)細(xì)胞生物膜和DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子直接造成損傷，使輻照菌株致死率急劇增大；隨著重離子累積注入量的增加，細(xì)胞表面損傷嚴(yán)重，能量沉積及動(dòng)量傳遞繼續(xù)對(duì)菌株產(chǎn)生損傷，使其致死率仍呈上升趨勢(shì)，這種作用的持續(xù)會(huì)短暫激活細(xì)胞的某種損傷修復(fù)機(jī)制，使得致死率出現(xiàn)短暫下降；但當(dāng)輻照累積量增加到一定值時(shí)，多種物理效應(yīng)產(chǎn)生的漸變性損傷累積，勢(shì)必會(huì)對(duì)菌株造成不可逆的物化損傷。

圖4 致死率（a）、正負(fù)突變率（b）隨輻照劑量變化曲線Fig.4 Fatality rate （a）, positive and negative mutation rate （b）curve with radiation dose

正、負(fù)突變率反映了誘變過(guò)程中正、負(fù)突變菌株數(shù)占全部被誘變菌株數(shù)的比率，隨輻照劑量的變化而變化，C重離子束各輻照劑量下的正、負(fù)突變率變化如圖4-b。一定輻照劑量范圍內(nèi)，雖然提高輻照劑量能提高致死率，亦可提高正突變率，但負(fù)突變率也會(huì)相應(yīng)增加，為此在最大限度的提高致死率（提高正向突變率）情況下，還要保證負(fù)突變率不會(huì)明顯的增大，才能誘變成功（即找到一個(gè)最佳輻照劑量），而多數(shù)研究所報(bào)道的當(dāng)致死率處于80%時(shí)，會(huì)得到一個(gè)理想的輻照結(jié)果。蔡聰?shù)仍诋a(chǎn)左旋乳酸的乳酸菌誘變研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)被誘變菌株的致死率在70%～80%范圍內(nèi)，誘變后菌株才會(huì)出現(xiàn)較多的正向突變株，對(duì)應(yīng)的誘變劑量才是最佳劑量。楊佩斯對(duì)菌株進(jìn)行ARTP 誘變，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在約80%致死率時(shí)，菌株誘變較理想，若致死率更高，正突變率雖然可能也有所增加，但在此情況下，負(fù)突變率都會(huì)較高，不宜優(yōu)良突變菌株的篩選。本研究中輻照吸收劑量為300 Gy時(shí)，致死率較高接近80%；而400 Gy 時(shí)致死率雖然更高，但負(fù)突變率相較于300 Gy 時(shí)有了明顯的升高，達(dá)到了11.49%，不利于理想突變株的篩選，故選擇300 Gy 為最佳輻照劑量較為合適。

2.4 突變?nèi)樗峋甑某鹾Y

對(duì)最佳輻照誘變劑量300 Gy 下的正向突變菌株采用1.2.6 所述的方法進(jìn)行篩選，以原始野生菌株JF12-1 的平均HC 值3.26 作為初篩對(duì)照，篩選出20株HC 值相較于原始野生菌株HC 值增加25%以上的突變菌株，篩選結(jié)果見(jiàn)表2，其中突變株JF11和JF16的HC 值增加最高，分別較原始野生菌株增加了49.69%和49.97%，但多數(shù)突變后菌株的HC 值增加百分比介于30%～50%之間。突變后菌株融鈣圈如圖5，較原始野生菌株有明顯變大，說(shuō)明誘變后菌株產(chǎn)有機(jī)酸量有明顯提升。

圖5 初篩突變菌株融鈣圈Fig.5 Preliminary screening of calcium melting circle of mutant strain

表2 最佳誘變劑量下的正向突變株Table 2 Positive mutants at optimum mutagenic dose

2.5 突變?nèi)樗峋甑膹?fù)篩

對(duì)初篩后的突變菌株參照1.2.7 所述方法進(jìn)行大腸桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)，以原始野生菌株JF12-1 對(duì)大腸桿菌平均抑菌圈直徑19.95 mm 為參照，發(fā)現(xiàn)20 株初篩菌株中，只有8 株菌株的抑菌圈直徑較原始野生菌株JF12-1 差異地提高（＜0.05），分別為JF3、 JF4、 JF5、 JF9、 JF10、 JF11、 JF14及JF16，其抑菌圈直徑分別為23.89、23.94、24.54、23.67、24.34、24.60、25.25 及24.33 mm，較原始野生菌株JF12-1 提高了18.65%～26.57%，結(jié)果見(jiàn)圖6。最后確定這8 株突變菌株為復(fù)篩后突變菌株。

圖6 原始野生菌株及復(fù)篩突變菌株抑菌性Fig.6 Bacteriostasis of original wild strain and double screening mutant strain

2.6 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)篩選出的8 株產(chǎn)酸及抑菌性良好的突變菌株連續(xù)傳代，隔代接種發(fā)酵對(duì)其產(chǎn)乳酸量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。發(fā)菌株JF12-1 及各正向突變菌株隔代乳酸含量相比于第1 代變化不顯著（＞0.05），說(shuō)明遺傳穩(wěn)定性良好。以原始野生菌株12-1 的平均產(chǎn)乳酸量7.92 g/L 為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)各正向突變株的產(chǎn)乳酸量較原始野生菌株有明顯提升，其中突變菌株JF16的平均產(chǎn)乳酸量為12.57 g/L，較原始野生菌株提高了58.74%。突變后菌株的產(chǎn)乳酸量及抑菌性除取決于相關(guān)基因所控制的代謝產(chǎn)物的表達(dá)量外，在很大程度上與菌株的培養(yǎng)條件密不可分。因此后續(xù)還需要研究培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)配比來(lái)篩選最佳發(fā)酵條件，以使突變后的基因得以充分的表達(dá)，以進(jìn)一步研究突變后菌株優(yōu)良特性的表達(dá)。

表3 突變株傳代產(chǎn)乳酸量的穩(wěn)定性（g/L）Table 3 Stability of lactate production in subculture of mutant strains(g/L)

2.7 突變菌株的16S rDNA 測(cè)序結(jié)果

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳拍照，原始野生菌株和穩(wěn)定突變菌株的16S rDNA 序列擴(kuò)增成功，如圖7 所示，分子量均為1500 bp，與原始野生型菌株JF12-1 的分子量相同。測(cè)序比對(duì)結(jié)果與同源相似序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖8，很好地顯示了誘變前后各菌株與鼠李糖乳桿菌的親緣關(guān)系。本研究誘變選育后菌株的16S rRNA 基因片段未發(fā)現(xiàn)堿基突變，這與WANG 等對(duì)植物乳桿菌太空誘變菌株的序列研究相似，說(shuō)明乳酸菌株16s rRNA 基因片段普遍具有保守性，這與其物種的親緣關(guān)系有關(guān)。而促使其產(chǎn)酸、抑菌功能增強(qiáng)的突變位點(diǎn)可能存在于其他基因區(qū)段，這需要進(jìn)一步對(duì)誘變選育后菌株的全基因組序列進(jìn)行研究才能確定。

圖7 原始野生菌株及復(fù)篩突變菌株的16S rDNA 電泳圖Fig.7 16S rDNA electrophoresis of the original wild strain and the double-screened mutant strain

圖8 原始野生菌株JF12-1 及誘變后菌株的發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.8 The phylogenetic tree of primitive wild strain JF12-1 and the mutated strain

3 結(jié)論

本研究成功利用C重離子束對(duì)奶牛源鼠李糖乳桿菌JF12-1 進(jìn)行了輻照誘變及選育。誘變確定300 Gy 為最佳輻照劑量，該劑量下致死率為79.86%，正突變率為30.33%，負(fù)突變率為5.38%，正向突變株最多；對(duì)最佳輻照劑量下的突變菌株初篩，得到20 株HC 值較原始野生菌株提高25%突變株，復(fù)篩得到JF3、JF4、JF5、JF9、JF10、JF11、JF14及JF16為體外對(duì)大腸桿菌抑菌性較原始野生菌株提高18.65%～26.57%的菌株；連續(xù)傳代后接種發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)這8 株突變?nèi)樗峋戤a(chǎn)乳酸較原始野生菌株提高了43.92%～58.74%且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。說(shuō)明C重離子束在優(yōu)良穩(wěn)定鼠李糖乳桿菌菌株選育中的使用是切實(shí)可行的。