基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的半夏厚樸湯化學(xué)成分分析*

沈 璐, 馮 芳,2

(1 中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

半夏厚樸湯，出自《金匱要略》：“婦人咽中有如炙臠，半夏厚樸湯主之”，主治慢性咽炎、失眠、抑郁等。半夏厚樸湯全方由半夏、茯苓、厚樸、生姜、紫蘇組成。目前關(guān)于單味藥材的化學(xué)成分已有許多研究，但關(guān)于半夏厚樸湯全方化學(xué)成分鮮有報道，而中藥的起效是一個多成分、多靶點的協(xié)同作用過程，因此有必要明確半夏厚樸湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用UPLC Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)，對半夏厚樸湯進(jìn)行全面分析，為進(jìn)一步研究其藥理活性和投入臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Vanquish Flex超高效液相色譜儀，美國Thermo公司；Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜，美國Thermo公司；Xcalibur工作站，美國Thermo公司；AB135-S 型電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司；高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；RE-52CS 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠；FD-1-SD 型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；AnkeTGL-16B型臺式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

姜半夏(批號190901)，山東豪泰中藥飲片有限公司；厚樸(批號294200502)，河北睿達(dá)藥業(yè)有限公司；茯苓(批號201224001)，河北金草藥業(yè)有限公司；紫蘇葉(批號112201201)，河北睿達(dá)藥業(yè)有限公司；生姜購買自當(dāng)?shù)夭耸袌?。符合《中國藥典?020版一部有關(guān)規(guī)定。姜半夏、厚樸、茯苓粉碎，生姜切為小塊，待用。

對照品6-姜辣素、厚樸酚、和厚樸酚、琥珀酸、腺苷、芹菜素、茯苓酸、阿魏酸均購自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；水，哇哈哈純凈水。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱XBridge BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)，流動相0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.5 min,2%B;1.5～23 min,2～30%B;23～34 min,30～98%B;34～41 min, 98%B;41～41.1 min,98～2%B;41.1～45 min,2%B)，柱溫40 ℃，流速0.3 mL / min，進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用HESI離子源，正、負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓正極3.5 kV，負(fù)極2.8 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣和輔助氣均為N2，鞘氣流速45 Arb，輔助氣流速10 Arb；掃描模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率60000，dd-MS2分辨率15000；碰撞能量20、40、60 eV；質(zhì)譜采集范圍m/z 100 ～1200 Da。

2.3 樣品制備

2.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品加甲醇超聲溶解配制成質(zhì)量濃度約為 1 mg/mL的儲備液，分別取儲備液適量，配制成各質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 凍干粉的制備

參照《金匱要略》記載，換算成現(xiàn)代劑量：姜半夏15 g，厚樸9 g，茯苓12 g，生姜15 g，紫蘇葉6 g，加入相當(dāng)于全方量10倍的水(570 mL)，浸泡0.5 h，然后煮沸1 h過濾，經(jīng)過 6層紗布過濾；殘留物第二次再加入相當(dāng)于全方量8倍的水重新煮沸，合并兩次提取物，凍干稱重。按照相同的制備方法分別制備單味藥材姜半夏凍干粉、厚樸凍干粉、茯苓凍干粉、生姜凍干粉和紫蘇葉凍干粉。

2.3.3 供試品溶液的制備

稱取適量的半夏厚樸湯和各單味藥材凍干粉適量，分別加水配成生藥濃度約為0.5 g/mL的半夏厚樸湯水溶液，0.1 g/mL的半夏水溶液，0.1 g/mL 的茯苓水溶液，0.1 g/mL的生姜水溶液，0.1 g/mL厚樸水溶液以及0.1 g/mL紫蘇水溶液，分別加入一定量甲醇，使甲醇體積占比達(dá)到70%，4 ℃下靜置 24 h，在16000 rpm離心機(jī)上離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液待用。

2.4 數(shù)據(jù)分析

查詢國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，收集組方中5味藥材的化學(xué)成分信息，包括名稱、分子式、精確分子量、準(zhǔn)分子離子、碎片離子等信息，建立一個數(shù)據(jù)庫。采用Xcalibur軟件對Q-Exactive Orbitrap-MS總離子流圖進(jìn)行峰提取處理，然后比對自建庫，對各分子離子峰代表的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定。

3 結(jié) 果

半夏厚樸湯在正負(fù)離子模式下的總離子流圖(TIC)見圖1所示。通過質(zhì)譜的裂解規(guī)律共推測出了90種化學(xué)成分，見表1所示。

圖1 半夏厚樸湯在正離子(A)和負(fù)離子(B)模式下的TIC圖

表1 半夏厚樸湯化學(xué)成分

續(xù)表1

*與標(biāo)準(zhǔn)品比對；▲[M+H-H2O]+；★[M]+；B：半夏；H：厚樸；F：茯苓；S：生姜；Z：紫蘇；All：都有。

以和厚樸酚在負(fù)離子條件下的裂解為例，化合物121在一級質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子為m/z 265.1232[M-H]-,在二級質(zhì)譜中，負(fù)離子模式下[M-H]-分別丟失一分子CH4、·C3H5和C3H6生成m/z 249.0925、m/z 224.0851和m/z 223.0781的碎片離子；m/z 249.0925的碎片離子繼續(xù)丟失一分子C3H4生成m/z 209.0596的碎片離子；m/z 223.0781的碎片離子繼續(xù)丟失一分子C2H2生成m/z 197.0605的碎片離子。通過與自建庫的和厚樸酚對比，初步推斷該化合物為和厚樸酚，通過與對照品的保留時間和碎片離子對比，進(jìn)一步確證該化合物是和厚樸酚，其在負(fù)離子模式下的裂解途徑見圖2所示。

圖2 和厚樸酚在負(fù)離子模式下可能的裂解途徑

4 結(jié) 論

本研究采用UPLC Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)，結(jié)合二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、保留時間，與相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)進(jìn)行比對，共鑒別了半夏厚樸湯中90種化合物，主要包括苯丙素類、氨基酸類、黃酮類和三萜類成分。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，可作為半夏厚樸湯質(zhì)量控制的參考方法之一，同時為半夏厚樸湯后續(xù)的臨床應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。