肉桂人參顆粒的含量測(cè)定、指紋圖譜建立及差異標(biāo)志物篩選Δ

高歡，胡北，李想，陳瑩，許子華（中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽(yáng) 110003）

肉桂人參顆粒為中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是在古籍經(jīng)典名方桂枝人參湯的基礎(chǔ)上制得，主要由肉桂、炙甘草、人參、白術(shù)、干姜5味藥材組成。方中肉桂溫里散寒、通利血脈，為君藥，桂皮醛、肉桂酸為其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和保護(hù)神經(jīng)等作用[1-3]；炙甘草益氣和中[4]，合肉桂辛甘化陽(yáng)以扶衛(wèi)，為臣藥，甘草苷、甘草酸銨為其主要成分，具有抗炎等作用[5]；人參、白術(shù)益氣健脾[6-7]，助甘草大補(bǔ)元?dú)鈁8]；干姜辛熱，溫中散寒、守而不走[9]，同為佐藥；諸藥合用，共奏和解表里之功效，治太陽(yáng)病因誤下而成協(xié)熱下利、表里不解者[10]。該藥臨床上可用于治療外寒直中、營(yíng)衛(wèi)凝滯、血脈流行不利之證，常用于感冒、流行性感冒及胃潰瘍、急慢性胃腸炎等屬中陽(yáng)不足者[11-12]，療效確切且不良反應(yīng)較少。目前該藥相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。由于中成藥成分復(fù)雜，單一成分難以全面地反映中成藥的整體質(zhì)量，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需測(cè)定多個(gè)指標(biāo)成分，且需綜合考慮藥物所含的活性成分、君藥臣藥的特征成分以及含量較高成分等。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法以肉桂人參顆粒中君藥肉桂（含桂皮醛、肉桂酸）和臣藥炙甘草（含甘草酸銨、甘草苷）中的主要成分為指標(biāo)進(jìn)行定量分析，建立其指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析篩選影響肉桂人參顆粒質(zhì)量的差異標(biāo)志物，旨在為該藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)及后續(xù)上市提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-16型HPLC儀、AUW120D型十萬(wàn)分之一電子分析天平、AEL-160型萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司），KQ3200型超聲波清洗機(jī)（杭州微米派科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

甘草苷對(duì)照品（批號(hào)111610-201908，純度93.1%）、肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)110786-201604，純度98.8%）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)110710-202022，純度99.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)wkq21021808，純度≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

肉桂（批號(hào)11321004）、人參（批號(hào)39021005）、干姜（批號(hào)00320015）、炙甘草（批號(hào)05721001）、白術(shù)（批號(hào)07020042）5種藥材均于2021年2月11日購(gòu)自河北仁心藥業(yè)有限公司。上述藥材經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院陸金財(cái)教授鑒定，分別為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥樹(shù)皮、五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer的根、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖（經(jīng)蜂蜜烘制而得）、菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根莖。

10批（編號(hào)S1～S10）肉桂人參顆粒[批號(hào)分別為20210228、20210309、20210312、20210425、20210426、20210427、20210428、20210429、20210430、20210501，規(guī)格為每袋裝15 g（無(wú)糖型）]均為中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，10%B→17%B；20～30 min，17%B→20%B；30～70 min，20%B→26%B；70～112 min，26%B→40%B；112～120 min，40%B→50%B；120～130 min，50%B→10%B；130～140 min，10%B）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[6，13-14]。

2.2 甘草酸銨等4種成分的含量測(cè)定

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，制成上述4個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為0.852、1.224、1.132、3.036 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。取各單一對(duì)照品貯備液適量，加甲醇，制成上述4個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為898.85、550.80、28.30、167.00 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液；取1 mL，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇定容，即得上述4個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為89.89、55.08、2.83、16.70μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取肉桂人參顆粒約2 g，研成細(xì)粉，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率25 kHz）處理30 min，放至室溫，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按肉桂人參顆粒的處方和制備工藝分別制備缺肉桂、甘草的陰性顆粒樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得各陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品（編號(hào)S1）溶液、陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在供試品色譜與對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有吸收峰，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于5 000，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的HPLC圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液，用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)孟盗匈|(zhì)量濃度的工作溶液（甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為17.98、35.95、89.89、179.77、359.54 μg/mL，甘草苷質(zhì)量濃度分別為 11.02、22.03、55.08、110.16、220.32 μg/mL，肉桂酸質(zhì)量濃度分別為0.57、1.13、2.83、5.66、11.32 μg/mL，桂皮醛質(zhì)量濃度分別為3.34、6.68、16.70、33.40、66.80 μg/mL）。取上述系列工作溶液和混合對(duì)照品貯備液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甘草酸銨等4種成分的回歸方程與線(xiàn)性范圍

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD分別為0.10%、0.09%、0.10%、0.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛峰面積的RSD分別為0.78%、1.14%、0.62%、0.77%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取肉桂人參顆粒（編號(hào)S1）共6份，每份約1 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛含量的RSD分別為1.21%、1.72%、1.92%、2.31%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知量的肉桂人參顆粒1 g（編號(hào)S1），分別精密加入各單一對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 甘草酸銨等4種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取10批肉桂人參顆粒（編號(hào)S1～S10）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。每樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 甘草酸銨等4種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）

2.3 肉桂人參顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰（分離度好、峰面積大、保留時(shí)間適中），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤2.02%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD≤2.04%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤0.36%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD≤4.36%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置 0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以桂皮醛為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤0.86%（n＝7），相對(duì)峰面積的RSD≤4.01%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的生成 取10批肉桂人參顆粒（編號(hào)S1～S10）樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將得到的圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以各成分色譜響應(yīng)均較強(qiáng)的S1樣品為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.3 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行Mark峰匹配，生成肉桂人參顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜（R）。結(jié)果顯示，10批肉桂人參顆粒共有16個(gè)共有峰。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 10批肉桂人參顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜

2.3.5 共有峰的指認(rèn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見(jiàn)圖3）。通過(guò)與混合對(duì)照品比對(duì)，共指認(rèn)了4個(gè)共有峰，分別為甘草苷（6號(hào)峰）、肉桂酸（10號(hào)峰）、桂皮醛（11號(hào)峰）、甘草酸銨（15號(hào)峰）。

圖3 混合對(duì)照品溶液與供試品溶液的HPLC圖

2.3.6 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)10批肉桂人參顆粒指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.95，表明不同批次樣品的成分種類(lèi)穩(wěn)定，所建指紋圖譜可以反映肉桂人參顆粒的整體特征。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10批肉桂人參顆粒的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4 聚類(lèi)分析

以16個(gè)共有峰的峰面積為變量，以平方歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示，當(dāng)類(lèi)間距離為10時(shí)，10批樣品可聚為3類(lèi)，其中S3為一類(lèi)，S1～S2、S4～S5、S10為一類(lèi)，S6～S9為一類(lèi)，表明不同批次樣品中各成分含量存在差異。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 10批肉桂人參顆粒的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.5 主成分分析

以16個(gè)共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分的特征值大于1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為91.918%。結(jié)果見(jiàn)表5（表中僅展示前3個(gè)主成分的數(shù)據(jù)）。

表5 主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率

2.6 正交偏最小二乘法-判別分析

以16個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值可用來(lái)衡量各共有峰的表達(dá)模式對(duì)樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，以輔助篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物[15]。結(jié)果顯示，10批樣品數(shù)據(jù)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，10批樣品可分為3類(lèi)，其中S3為一類(lèi)，S1～S2、S4～S5、S10為一類(lèi)，S6～S9為一類(lèi)，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)篩選影響樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物[15]，結(jié)果顯示，有4個(gè)共有峰的VIP值大于1，分別為11號(hào)峰（桂皮醛）、15號(hào)峰（甘草酸銨）、6號(hào)峰（甘草苷）、9號(hào)峰（成分未知）。結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 正交偏最小二乘法-判別分析的得分散點(diǎn)圖

圖7 共有峰的VIP值

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考2020年版《中國(guó)藥典》（一部），甘草苷和甘草酸銨的檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm、桂皮醛為290 nm[6]?；诖?，本研究分別考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)（210、254、265、280、290 nm）對(duì)各色譜峰峰面積和分離度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm時(shí)，各色譜峰的峰面積和分離度均較好，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。

3.2 提取條件的優(yōu)化

本研究考察了供試品溶液的制備方法，采用不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（50%、60%、70%、80%、100%甲醇）來(lái)提取樣品，結(jié)果顯示，以60%甲醇為提取溶劑時(shí)，各色譜峰的峰形較好，含量較高，故選擇提取溶劑為60%甲醇。本研究還考察了不同超聲時(shí)間（15、30、45 min）的提取效果，結(jié)果顯示，各成分含量可隨超聲時(shí)間增加而逐漸升高，但超聲30 min與超聲45 min對(duì)各成分含量的影響較小，考慮到實(shí)驗(yàn)效率，故選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

含量測(cè)定結(jié)果顯示，10批肉桂人參顆粒中甘草酸銨、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛的含量分別為1.808 4～2.770 0、1.137 2～1.481 4、0.076 5～0.091 8、0.130 9～0.478 4 mg/g，表明不同批次樣品間各成分含量存在差異，以桂皮醛的差異較大，這可能與制備過(guò)程中的加熱導(dǎo)致桂皮醛揮發(fā)有關(guān)。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，不同批次樣品的相似度均大于0.95，其中S2、S4、S6樣品的相似度相對(duì)較低，這可能與藥材在貯藏或生產(chǎn)過(guò)程中造成的含量差異有關(guān)[16]。

3.4 指標(biāo)成分的選擇與化學(xué)模式識(shí)別分析

10批肉桂人參顆粒共有16個(gè)共有峰，共指認(rèn)出了4個(gè)共有峰，分別為甘草苷（6號(hào)峰）、肉桂酸（10號(hào)峰）、桂皮醛（11號(hào)峰）、甘草酸銨（15號(hào)峰）。桂皮醛和甘草苷均為2020年版《中國(guó)藥典》（一部）單味藥項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)成分[6]。通過(guò)主成分分析發(fā)現(xiàn)，前3個(gè)主成分的特征值大于1，表明這3個(gè)成分能夠概括樣品中的絕大部分信息。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，10批樣品可聚為3類(lèi)，其中S3為一類(lèi)，S1～S2、S4～S5、S10聚為一類(lèi)，S6～S9聚為一類(lèi)；正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，11號(hào)峰（桂皮醛）、15號(hào)峰（甘草酸銨）、6號(hào)峰（甘草苷）、9號(hào)峰的VIP值大于1，表明甘草酸銨、桂皮醛、甘草苷和9號(hào)峰代表的化學(xué)成分可能是影響肉桂人參顆粒質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜及含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于肉桂人參顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)；甘草酸銨、桂皮醛、甘草苷等成分可能是影響肉桂人參顆粒質(zhì)量的差異標(biāo)志物。