國產(chǎn)那屈肝素鈣注射液在中國健康受試者中的生物等效性及安全性研究Δ

李潔，宋恒文，楊能，邵志超，錢春艷#（.常州市第一人民醫(yī)院臨床試驗機構(gòu)辦公室，江蘇常州 3000；.常州千紅生化制藥股份有限公司，江蘇常州 35）

低分子肝素是應(yīng)用化學(xué)或酶解方式，將肝素解聚并裂解成分子量1 000～12 000（平均4 000～6 000）的肝素片段，并以此所制成的一類分子量較小的肝素制劑[1-2]。低分子肝素的藥理作用主要包括抗凝血、抗血栓、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抗腫瘤、預(yù)防腹部術(shù)后粘連、抗脂質(zhì)代謝紊亂、抗氧自由基生成等，主要用于心腦血管疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、產(chǎn)科疾病和急性胰腺炎、扁平苔蘚、癌癥的臨床治療，以及術(shù)后血栓的預(yù)防[3]。那屈肝素鈣是一種低分子肝素，由普通肝素通過解聚和分離所得，較普通肝素具有更長的半衰期（t1/2）[4]；同時，該藥具有明顯的抗凝血因子Ⅹa（anti-coagulation factorⅩa，Anti-Ⅹa）活性和較弱的抗凝血因子Ⅱa（anti-coagulation factorⅡa，Anti-Ⅱa）活性，主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞[4]。那屈肝素鈣注射液原研藥的商品名為速碧林?（FRAXIPARINE?，注冊證號 H20181137），由愛爾蘭Aspen Pharma Trading Limited公司研發(fā)。本研究所用國產(chǎn)那屈肝素鈣注射液（國藥準(zhǔn)字H20193057）由常州千紅生化制藥股份有限公司研發(fā)，根據(jù)其注冊批件的要求，本研究擬探討該受試制劑與參比制劑（原研藥）在中國健康人群中的生物等效性和安全性，為國產(chǎn)制劑的進一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為提高藥品可及性、節(jié)約醫(yī)藥成本提供支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SpectraMax Plus 384型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、M37615型渦旋混合器（美國Thermolyne公司）、XS205型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Simplicity型純水儀（德國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究的受試制劑為那屈肝素鈣注射液（國藥準(zhǔn)字H20193057，批號 851911010A，規(guī)格 0.6 mL∶6 150 AⅩaIU），由常州千紅生化制藥股份有限公司生產(chǎn)；參比制劑為那屈肝素鈣注射液（注冊證號H20181137，批號5313A，規(guī)格 0.6 mL∶6 150 AⅩaIU），由法國 Aspen Notre Dame de Bondevile公司生產(chǎn)。

低分子肝素（批號Batch 10，Anti-Ⅹa活性100 IU/mL，Anti-Ⅱa活性33 IU/mL）由歐洲藥品質(zhì)量管理局提供，用于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品和其他驗證樣品；Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性檢測試劑盒均購自法國HYPHEN BioMed公司；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 血漿

健康人體檸檬酸鈉抗凝血漿（空白基質(zhì)）來自武漢市傳染病醫(yī)院Ⅰ期臨床試驗研究室；混合空白基質(zhì)（血漿）由5名健康人體抗凝血漿混合制得；空白溶血基質(zhì)（血漿）的制備方法如下：將含檸檬酸鈉抗凝劑的全血樣品于≤-60℃條件下快速冷凍不少于30 min使血細(xì)胞破裂，解凍后于2～8℃下以2 500×g離心15 min，取上清液適量，與單一來源的空白基質(zhì)混合，即得溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的空白溶血基質(zhì)。

2 低分子肝素Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性的檢測

2.1 分析方法

使用Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性檢測試劑盒，采用發(fā)色底物法以多功能酶標(biāo)儀測定人血漿樣品中低分子肝素的Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取低分子肝素適量，用空白基質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。其中，Anti-Ⅹa活性檢測所用標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的活性分別為0.010 0、0.050 0[定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）]、0.080 0、0.125、0.250、0.500、0.750、0.850、1.00[定量上限（upper limit of quantitation，ULOQ）]IU/mL，Anti-Ⅱa活性檢測所用標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的活性分別為0.010 0、0.018 0（LLOQ）、0.040 0、0.060 0、0.080 0、0.120、0.160、0.200（ULOQ）IU/mL。檢測波長為405 nm，參比波長分別為450 nm（Anti-Ⅹa活性）和455 nm（Anti-Ⅱa活性）。采用SoftMax?Pro GxP 5.4.1軟件進行數(shù)據(jù)采集，采用Watson LIMS 7.4.1軟件對理論活性值與所測平均光密度（optical density，OD）值進行回歸，采用五參數(shù)法對標(biāo)準(zhǔn)曲線所有有效活性水平樣品進行邏輯擬合，權(quán)重因子為1。本方法通過驗證的定量范圍分別為0.050 0～1.00 IU/mL（Anti-Ⅹa活性）和0.018 0～0.200 IU/mL（Anti-Ⅱa活性）。

2.2.2 準(zhǔn)確度與精密度 準(zhǔn)確度與精密度評估將采用6個驗證分析批，由2名實驗人員在2 d內(nèi)完成。每個準(zhǔn)確度和精密度驗證分析批包含1套新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和空白對照樣品以及5套5個活性水平的質(zhì)控樣品，其中Anti-Ⅹa活性檢測所用質(zhì)控樣品的活性分別為1.00（ULOQ）、0.800[高 濃度 質(zhì)控（high quality control，HQC）]、0.400[中濃度質(zhì)控（moderate quality control，MQC）]、0.100[低濃度質(zhì)控（low quality control，LQC）]、0.050 0（LLOQ）IU/mL，Anti-Ⅱa活性檢測所用質(zhì)控樣品的活性分別為 0.200（ULOQ）、0.150（HQC）、0.100（MQC）、0.050 0（LQC）、0.018 0（LLOQ）IU/mL。按“2.2.1”項下方法檢測并處理數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。由表1可見，在本方法條件下，Anti-Ⅹa活性和Anti-Ⅱa活性的批間和批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

表1 Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性檢測方法準(zhǔn)確度與精密度試驗結(jié)果（n＝5或n＝6）

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng) 取空白基質(zhì)和混合空白基質(zhì)，按“2.2.1”項下方法分別制備ULOQ、LLOQ樣品和空白基質(zhì)水平選擇性樣品（Anti-Ⅹa活性：10批次；Anti-Ⅱa活性：20批次）。結(jié)果顯示，在本方法條件下，在定量范圍內(nèi)未見明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

取空白溶血基質(zhì)（Anti-Ⅹa活性檢測所用溶血基質(zhì)的溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%，Anti-Ⅱa活性檢測所用溶血基質(zhì)的溶血體積比分別為0.25%、0.5%、1.0%、2.0%）和混合空白基質(zhì)，按“2.2.1”項下方法分別制備ULOQ、LLOQ樣品及其對應(yīng)活性的空白基質(zhì)水平選擇性樣品。結(jié)果顯示，當(dāng)溶血體積比≤0.25%時，空白溶血基質(zhì)對Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的檢測無影響。

2.2.4 平行性 選用3個接近實測最大活性的臨床樣品考察平行性。采用混合空白基質(zhì)稀釋上述樣品，且保證至少有3個稀釋度樣品的Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性落在定量范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，接近實測最大活性的臨床樣品經(jīng)混合空白基質(zhì)稀釋后，定量范圍內(nèi)樣品活性值的CV均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，所有稀釋度樣品的測試結(jié)果（經(jīng)稀釋倍數(shù)校正）的精密度均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]，提示臨床樣品稀釋具有平行性。

2.2.5 稀釋效應(yīng)和鉤狀效應(yīng) Anti-Ⅹa活性和Anti-Ⅱa活性檢測結(jié)果顯示，在10、5倍ULOQ活性樣品中均未觀察到鉤狀效應(yīng)，樣品在按最小稀釋倍數(shù)進行稀釋之前最多可以采用混合空白基質(zhì)預(yù)稀釋80、32倍。

2.2.6 穩(wěn)定性 標(biāo)準(zhǔn)品原始儲備液（Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性）在-90～-60℃下放置41 d穩(wěn)定；將其溶于基質(zhì)中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩(wěn)定，在-25～-15℃、-90～-60℃下放置62 d均穩(wěn)定，反復(fù)凍融（-80℃～室溫，下同）6次穩(wěn)定。

將受試制劑（Anti-Ⅹa活性）溶于基質(zhì)中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩(wěn)定，在-25～-15℃、-90～-60℃下放置61 d均穩(wěn)定，反復(fù)凍融6次穩(wěn)定。將參比制劑（Anti-Ⅹa活性）溶于基質(zhì)中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩(wěn)定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置39、61 d均穩(wěn)定，反復(fù)凍融6次穩(wěn)定。將受試制劑（Anti-Ⅱa活性）溶于基質(zhì)中，在室溫和2～8℃下放置27 h均穩(wěn)定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置40、61 d均穩(wěn)定，反復(fù)凍融6次穩(wěn)定。將參比制劑（Anti-Ⅱa活性）溶于基質(zhì)中，在室溫和2～8℃下放置27 d均穩(wěn)定，在-25～-15℃、-90～-60℃下分別放置61 d均穩(wěn)定，反復(fù)凍融6次穩(wěn)定。

在冰水浴條件下，含標(biāo)準(zhǔn)品、受試制劑、參比制劑的人全血樣本（Anti-Ⅹa和Anti-Ⅱa活性）放置2 h均穩(wěn)定。

3 2種制劑的生物等效性及安全性評價

3.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究方案通過常州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)[倫理批件號（2020）藥第02號]。

健康受試者納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）18周歲及以上，男女不限；（2）體質(zhì)量不低于50 kg，體質(zhì)量指數(shù)為19.0～26.0 kg/m2；（3）經(jīng)生命體征、體格檢查，血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化檢測，胸片（正位）/胸部CT檢查，傳染病篩查，凝血功能檢查，妊娠試驗（女性）和12導(dǎo)聯(lián)心電圖檢查等，各指標(biāo)均無異?；虍惓５珶o臨床意義；（4）在未來6個月內(nèi)無生育計劃且自愿采取有效避孕措施；（5）充分了解試驗?zāi)康摹⑿再|(zhì)、方法和可能發(fā)生的不良反應(yīng)，自愿參與本研究并簽署知情同意書，能夠按照方案要求完成試驗。

排除標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）有過敏史（如哮喘、蕁麻疹、濕疹等）或過敏體質(zhì)者，已知對本藥成分或類似物、魚精蛋白和橡膠過敏者；（2）藥物濫用篩查陽性或酒精呼氣測試陽性者；（3）有凝血功能障礙疾病史者，或在過去6個月內(nèi)發(fā)生過增加出血風(fēng)險相關(guān)事件者，或既往有顱內(nèi)出血、胃腸道出血、紫癜、消化道潰瘍疾病史者，或過去30 d內(nèi)接受過大手術(shù)者，或有活動性病理性出血、顱內(nèi)出血疾病史者；（4）經(jīng)傳染病篩查出現(xiàn)以下任一情況者：抗人類免疫缺陷病毒抗體陽性、乙肝表面抗原陽性、抗丙肝抗體陽性、抗梅毒螺旋體抗體陽性；（5）在篩選前3個月有獻血史或失血超過400 mL者[6]。

3.2 給藥方案與血樣采集

本試驗采用開放、隨機、單劑量、兩序列、兩周期交叉設(shè)計，健康受試者采用區(qū)組隨機化方法按1∶1分配到TR（受試制劑-參比制劑）組和RT（參比制劑-受試制劑）組。受試者均禁食過夜（至少10 h），并于給藥前后禁水1 h。兩組患者均于第1周期的第1天空腹皮下注射受試制劑或參比制劑6 150 AⅩaIU，第2周期交叉給藥，清洗期為7 d。

在給藥0 h（給藥前1 h內(nèi)）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、10、12、16、24 h采集血樣4 mL至含檸檬酸鈉的抗凝管中，輕柔顛倒混勻數(shù)次，于4℃下以2 500×g離心15 min，取上層血漿1 mL轉(zhuǎn)移至分析用凍存管中，剩余血漿轉(zhuǎn)移至備份用凍存管中。所有樣品均需在采集后120 min內(nèi)完成離心，并置于-20℃冰箱中凍存。待受試者同周期血漿全部收集完成后再統(tǒng)一轉(zhuǎn)移至-60℃超低溫冰箱中凍存。試驗期間，所有受試者統(tǒng)一進食標(biāo)準(zhǔn)餐。

3.3 數(shù)據(jù)處理

將隨機化后至少服用1次藥物（無論參比制劑或受試制劑）且具有安全性評價數(shù)據(jù)的受試者納入安全性分析集；將充分依從于試驗方案且按照方案要求完成給藥、生物樣品采集和檢測分析的受試者納入符合方案集。

取各受試者血漿樣品，按“2.1”項下方法檢測后，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性。利用WinNonlin?8.0分析軟件，采用非房室模型計算兩藥的藥效動力學(xué)參數(shù)并繪制活性-時間曲線。藥效動力學(xué)參數(shù)包括Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性最大值（Anti-Ⅹamax、Anti-Ⅱamax）、活性-時間曲線下面積（AUEC0-t、AUEC0-∞）、達峰時間（tmax）、t1/2。應(yīng)用SAS 9.4軟件，對Anti-Ⅹa活性的藥效動力學(xué)參數(shù)（Anti-Ⅹamax、AUEC0-t和AUEC0-∞）進行生物等效性分析。若受試制劑與參比制劑Anti-Ⅹa活性的主要藥效動力學(xué)參數(shù)幾何均值比的90%置信區(qū)間在80.00%～125.00%內(nèi)，可認(rèn)為兩藥生物等效[7]。

3.4 結(jié)果

3.4.1 受試者人口學(xué)特征 本研究共納入健康受試者24例，其中男性20例、女性4例，均為漢族；身高為（170.05±6.86）cm，體質(zhì)量為（64.82±6.50）kg，體質(zhì)量指數(shù)為（22.41±1.83）kg/m2；所有受試者均完成全部試驗。

3.4.2 受試者給藥后2種制劑的藥效動力學(xué)參數(shù)比較24例受試者空腹皮下注射那屈肝素鈣注射液受試制劑或參比制劑后，其Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的藥效動力學(xué)參數(shù)見表2，其活性-時間曲線見圖1（圖1B中，因Anti-Ⅱa活性在16 h后低于LLOQ，故時間范圍為0～16 h）。

圖1 受試者給予受試制劑/參比制劑后的平均血漿抗凝血因子活性-時間曲線

表2 受試制劑/參比制劑Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性的主要藥效動力學(xué)參數(shù)（n＝24）

3.4.3 生物等效性評價 兩藥藥效動力學(xué)參數(shù)（Anti-Ⅹamax、AUEC0-t和AUEC0-∞）的幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為110.98%～123.50%、112.11%～121.24%、111.57%～120.00%。參照“3.3”項下生物等效性判定標(biāo)準(zhǔn)[7]，兩種制劑生物等效。

3.4.4 安全性評價 給藥前后，所有受試者的生命體征及心電圖檢查均未見明顯異常，有14例受試者發(fā)生不良事件，合計19例次，分級均為1級，無嚴(yán)重的不良事件發(fā)生。試驗過程中，受試者發(fā)生的不良事件包括：低鈉血癥（受試制劑使用者2例次，參比制劑使用者1例次）、尿路感染（受試制劑使用者和參比制劑使用者各1例次）、體位性低血壓（受試制劑使用者1例次）、惡心（參比制劑使用者1例次）、高尿酸血癥（受試制劑使用者5例次，參比制劑使用者1例次）、竇性心動過速（參比制劑使用者2例次）、高甘油三酯血癥（受試制劑使用者1例次）、紫癜（受試制劑使用者1例次）、斑丘疹（參比制劑使用者1例次）、血腫（受試制劑使用者1例次）。其中，血腫被判定為“肯定有關(guān)”，紫癜和斑丘疹被判定為“很可能有關(guān)”，其余不良事件均被判定為“可能無關(guān)”[8-10]。本課題組初步認(rèn)為，那屈肝素鈣注射液受試制劑和參比制劑均具有良好的安全性。

4 討論

本試驗設(shè)計主要參考國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心《關(guān)于仿制的低分子肝素類產(chǎn)品新增技術(shù)要求的意見》[11]、《低分子量肝素注射液人體藥效學(xué)生物等效性研究一般考慮》[12]和美國FDA發(fā)布的低分子肝素類藥品生物等效性指導(dǎo)原則（如Recommended Guidance：Draft Guidance on Enoxaparin Sodium[13]）和既往文獻報道[14]，在健康受試者空腹條件下以體內(nèi)藥效學(xué)（Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性）為終點進行單劑量、雙交叉的生物等效性研究。本研究采用發(fā)色底物法測定人血漿中受試制劑和參比制劑的Anti-Ⅹa、Anti-Ⅱa活性，方法學(xué)驗證結(jié)果符合2020年版《中國藥典》（四部）通則“生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”的相關(guān)要求[5]。

在本項以中國健康受試者為對象的那屈肝素鈣注射液隨機、開放、單劑量、兩序列、兩周期交叉的生物等效性試驗中，受試制劑與參比制劑（Anti-Ⅹa活性）的主要藥效動力學(xué)參數(shù)幾何均值比的90%置信區(qū)間均在80.00%～125.00%內(nèi)，可判斷健康受試者空腹皮下注射那屈肝素鈣注射液受試制劑（0.6 mL∶6 150 AⅩaIU）與參比制劑（速碧林?，0.6 mL∶6 150AⅩaIU）生物等效。

那屈肝素鈣注射液的安全性事件主要有不同部位的出血，偶見血小板減少癥和血栓形成，極少數(shù)患者會出現(xiàn)皮膚壞死、注射部位小血腫、皮膚反應(yīng)、全身性過敏反應(yīng)（如血管神經(jīng)性水腫、一過性氨基轉(zhuǎn)移酶增高）[8-10]。本試驗中，受試者發(fā)生的不良事件包括低鈉血癥、尿路感染、體位性低血壓、惡心、高尿酸血癥、竇性心動過速、高甘油三酯血癥、紫癜、斑丘疹、血腫。所有藥物相關(guān)不良事件（紫癜、斑丘疹、血腫）均為輕度，未見嚴(yán)重的不良事件發(fā)生，受試者生命體征各項指標(biāo)大致保持平穩(wěn)。由此表明，那屈肝素鈣注射液受試制劑和參比制劑均具有良好的安全性。與既往研究相比[14]，本項試驗基于受試者體征、體格、血常規(guī)等檢查結(jié)果，更多地關(guān)注了制劑的安全性。

綜上所述，國產(chǎn)那屈肝素鈣注射液與參比制劑生物等效，兩藥的安全性均較好。