厄貝沙坦聯(lián)合5-氟尿嘧啶對Lewis肺癌細胞增殖及ERK/PPARγ信號通路的影響Δ

翟美娟，季士亮，江翊國，白秀華#（1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院藥學部，江蘇蘇州 1500；.蘇州科技城醫(yī)院呼吸科，江蘇蘇州 15000）

肺癌是全球病死率最高的惡性腫瘤，其死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的18%[1]。5-氟尿嘧啶（5-fluoruracil，5-FU）是一種常用且經(jīng)典的化療藥物，可通過抑制胸苷酸合成酶阻滯DNA合成，從而發(fā)揮抗腫瘤活性，臨床常用于各種實體惡性腫瘤的治療。然而，5-FU在使用中存在耐藥性和中樞神經(jīng)毒性等毒副作用，限制了其臨床應用[2]。因此，尋找協(xié)同增效或削弱5-FU毒性的藥物是目前研究的熱點。

厄貝沙坦（irbesartan，Irb）是一種血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化及抗腫瘤等特性，可通過調節(jié)機體內炎癥因子的釋放，發(fā)揮心臟保護作用[3]。已有研究表明，Irb與化療藥物表柔比星聯(lián)用可削弱后者的毒性[4]，亦可通過抑制胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的磷酸化（即成為p-ERK1/2）來阻滯乳腺癌MCF-7細胞的增殖[5]，還可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater activated receptor gamma，PPARγ）來誘導細胞自噬[6-7]。基于此，本研究考察了Irb聯(lián)合5-FU對Lewis肺癌細胞增殖及ERK/PPARγ信號通路的影響，以期為臨床肺癌治療方案的優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Miulab GIS-500型凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）、DMI 3000B型倒置顯微鏡（德國Leica公司）、BB150-2TCS型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

Irb（批號T1615，純度99%）購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；5-FU（貨號V900394-1G，純度98%）購自美國Sigma公司；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（批號HY-B0796）購自美國Med Chem Express公司；MTT溶液（批號CS2905）購自北京博奧森生物技術有限公司；Giemsa液（批號G1010-500）購自北京索萊寶科技有限公司；通用型Bradford蛋白定量試劑盒（批號E211-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；兔增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、腫瘤抑制蛋白 p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+p-ERK2（T185）、PPARγ、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H&L）二抗（批號分 別 為 ab92552、ab32389、ab184699、ab201015、ab178860、ab181602、ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞

小鼠Lewis肺癌細胞購自美國ATCC生物標準品資源中心，貨號AC-2654H。

2 方法

2.1 Irb對細胞增殖活力的影響考察

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞，用培養(yǎng)基稀釋至1×105個/mL，吸取200 μL接種于96孔板中，用不同濃度（0、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1mmol/L[5]）的Irb處理細胞，孵育48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，避光孵育4 h后，去除培養(yǎng)基，再加入二甲基亞砜200 μL，用酶標儀在570 nm波長處檢測光密度（optical density，OD），以OD值評價細胞增殖活力。

2.2 細胞分組與給藥

取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞，分為正常對照組、Irb低濃度組（1×10-3mmol/L，根據(jù)“2.1”項下實驗結果設置）、Irb高濃度組（1×10-1mmol/L，根據(jù)“2.1”項下實驗結果設置）、5-FU組（10 μmol/L[8]）、Irb低濃度+5-FU組（Irb 1×10-3mmol/L+5-FU 10 μmol/L）和Irb高濃度+5-FU組（Irb 1×10-1mmol/L+5-FU 10 μmol/L），除正常對照組細胞正常培養(yǎng)外，其余5組細胞使用相應濃度的Irb或（和）5-FU培養(yǎng)24 h。

2.3 Irb聯(lián)合5-FU對細胞增殖活力的影響考察

按“2.1”項下方法檢測“2.2”項下各組細胞培養(yǎng)24 h后的細胞增殖活力。

2.4 Irb聯(lián)合5-FU對細胞集落形成數(shù)的影響考察

取按“2.2”項下方法分組、給藥處理18 h后的細胞，制備成單細胞懸液。取單細胞懸液1 mL（細胞密度200個/mL）鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1～2周，每天更換1次培養(yǎng)基，直至出現(xiàn)肉眼可見的細胞增殖時終止培養(yǎng)，除去培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液浸洗2～3次，干燥后加入甲醇固定15 min，去除甲醇，晾干后，使用Giemsa液染色10 min，洗去染料，干燥后在顯微鏡下拍照記錄細胞集落形成數(shù)（按細胞數(shù)＞50個、直徑0.3～1.0 mm為1個集落）。實驗重復3次。

2.5 Irb聯(lián)合 5-FU 對細胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達的影響考察

采用Western blot法進行檢測。取按“2.2”項下方法分組、給藥處理24 h后的細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液沖洗2～3次，加入含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，在4℃下裂解30 min后以15 000×g離心20 min，分離上清液即為總蛋白，測定蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸15 min變性，置于-20℃冰箱備用。每孔上樣蛋白50 μg，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用TBST緩沖液沖洗3次，加入5%牛血清白蛋白（用TBST緩沖液稀釋）室溫封閉2 h，加入PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+p-ERK2（T185）、PPARγ和GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶500），低溫孵育過夜；用TBST緩沖液沖洗3次，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h，用TBST緩沖液沖洗3次，顯影成像。使用Image J v1.8.0軟件分析條帶的灰度值，按下式計算目的蛋白的表達水平：目的蛋白表達水平＝目的蛋白的灰度值/GAPDH蛋白的灰度值。實驗重復3次。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 Irb對細胞增殖活力的影響

與0 mmol/L比較，Irb濃度為1×10-5、1×10-4mmol/L時細胞增殖活力無明顯變化（P＞0.05），Irb濃度為1×10-3、1×10-2、1×10-1mmol/L時細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）。后續(xù)試驗選擇1×10-1mmol/L為Irb高濃度（OD值為0.66±0.02），1×10-3mmol/L為Irb低濃度（OD值為0.78±0.05）。

3.2 Irb聯(lián)合5-FU對細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)的影響

與正常對照組比較，其余5組細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)均顯著降低/減少（P＜0.05）。與Irb低、高濃度組比較，5-FU組、Irb低濃度+5-FU組和Irb高濃度+5-FU組細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)均顯著降低/減少（P＜0.05）。與5-FU組比較，Irb低濃度+5-FU組和Irb高濃度+5-FU組細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)均顯著降低/減少（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

圖1 Irb聯(lián)合5-FU對細胞集落形成數(shù)的影響

表1 Irb聯(lián)合5-FU對細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)的影響（±s，n＝3）

表1 Irb聯(lián)合5-FU對細胞增殖活力和細胞集落形成數(shù)的影響（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與Irb低濃度組比較，P＜0.05；c：與Irb高濃度組比較，P＜0.05；d：與5-FU組比較，P＜0.05

細胞集落形成數(shù)387.12±15.26 315.27±21.03a 244.98±11.23a 182.36±8.26abc 141.25±12.02abcd 97.25±9.15abcd 589.629＜0.05組別正常對照組Irb低濃度組Irb高濃度組5-FU組Irb低濃度+5-FU組Irb高濃度+5-FU組F P OD值0.96±0.09 0.80±0.06a 0.67±0.04a 0.56±0.04abc 0.43±0.02abcd 0.26±0.01abcd 224.088＜0.05

3.3 Irb聯(lián)合 5-FU 對細胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達的影響

與正常對照組比較，其余5組細胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低，p53蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與Irb低、高濃度組比較，5-FU組、Irb低濃度+5-FU組和Irb高濃度+5-FU組細胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低，p53蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與5-FU組比較，Irb低濃度+5-FU組和Irb高濃度+5-FU組細胞中PCNA、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低，p53蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。各組細胞中ERK1/2蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05）。結果見圖2、表2。

表2 Irb聯(lián)合 5-FU 對細胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平的影響（±s，n＝3）

表2 Irb聯(lián)合 5-FU 對細胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平的影響（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與Irb低濃度組比較，P＜0.05；c：與Irb高濃度組比較，P＜0.05；d：與5-FU組比較，P＜0.05

PPARγ 1.28±0.13 1.05±0.07a 0.90±0.06a 0.75±0.07abc 0.56±0.05abcd 0.34±0.04abcd 180.063＜0.05組別正常對照組Irb低濃度組Irb高濃度組5-FU組Irb低濃度+5-FU組Irb高濃度+5-FU組F P PCNA 1.45±0.12 1.22±0.10a 0.97±0.09a 0.75±0.05abc 0.52±0.04abcd 0.27±0.01abcd 284.135＜0.05 p53 0.12±0.01 0.26±0.03a 0.47±0.05a 0.69±0.07abc 0.94±0.10abcd 1.20±0.11abcd 299.402＜0.05 p-ERK1/2 1.01±0.09 0.88±0.07a 0.76±0.06a 0.63±0.04abc 0.49±0.05abcd 0.25±0.01abcd 196.373＜0.05 ERK1/2 1.35±0.11 1.29±0.10 1.33±0.12 1.26±0.15 1.31±0.11 1.34±0.10 0.764 0.581

圖2 各組細胞中 PCNA、p53、ERK1/2、p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達的電泳圖

4 討論

PCNA是DNA合成過程中不可缺少的一種輔助蛋白，同時也是衡量腫瘤細胞增殖活性的標志物之一[9]。p53是一種腫瘤抑制蛋白，是研究最為廣泛的一種抑癌因子。本研究結果顯示，與正常對照組比較，Irb、5-FU單用及聯(lián)用均可顯著降低Lewis肺癌細胞增殖活力、減少細胞集落形成數(shù)、降低細胞中PCNA蛋白表達水平，顯著提高p53蛋白表達水平；與Irb低、高濃度組比較，5-FU組、Irb低濃度+5-FU組及Irb高濃度+5-FU組Lewis肺癌細胞增殖活力、細胞集落形成數(shù)和細胞中PCNA蛋白表達水平均顯著降低/減少，p53蛋白表達水平均顯著升高；與5-FU組比較，Irb低濃度+5-FU組及Irb高濃度+5-FU組Lewis肺癌細胞增殖活力、細胞集落形成數(shù)和細胞中PCNA蛋白表達水平均顯著降低/減少，p53蛋白表達水平均顯著升高。上述結果說明，Irb和5-FU單用均可有效降低Lewis肺癌細胞增殖活力，二者聯(lián)用對Lewis肺癌細胞增殖抑制作用更強。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族中最重要的一員，其本身不具備活性，只有被磷酸化后形成p-ERK才具有活性，可調控細胞增殖、分化等多個生物學過程，并可參與調節(jié)炎癥因子的產生和分泌[10]。PPARγ是核受體超家族的一部分，可參與調節(jié)細胞分化、增殖、免疫/炎癥反應和脂質代謝的基因表達，同時在結腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細胞中均有表達[11]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，Irb、5-FU單用及聯(lián)用均可顯著降低Lewis肺癌細胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平；與Irb低、高濃度組比較，5-FU組、Irb低濃度+5-FU組及Irb高濃度+5-FU組Lewis肺癌細胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低；與5-FU組比較，Irb低濃度+5-FU組及Irb高濃度+5-FU組Lewis肺癌細胞中p-ERK1/2、PPARγ蛋白表達水平均顯著降低。上述結果說明，Irb和5-FU對Lewis肺癌細胞增殖活力的抑制作用可能與抑制ERK1/2磷酸化和PPARγ表達有關。

綜上所述，Irb聯(lián)合5-FU可抑制Lewis肺癌細胞增殖，且效果優(yōu)于二者單用，其機制可能與下調ERK/PPARγ信號通路有關。