健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的建立及4種指標(biāo)成分的含量測(cè)定Δ

宛鑫，李得堂，張麗娟，易美容，祝赫，何嘉侖，陳潔，唐洪梅，丘振文（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510405；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，廣州 510405）

中藥復(fù)方制劑的開(kāi)發(fā)大多源于長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中積累的驗(yàn)方和經(jīng)典名方，具有較強(qiáng)的臨床優(yōu)勢(shì)及中醫(yī)特色，其開(kāi)發(fā)過(guò)程也遵循“臨床-實(shí)驗(yàn)-回歸臨床”的規(guī)律[1-2]。健脾益肺鼻炎方為本課題組臨床專(zhuān)家應(yīng)用了10多年的臨床驗(yàn)方，主要用于肺氣虛寒型變應(yīng)性鼻炎疾病的治療。該方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、干姜、桂枝等8味中藥組成，是在玉屏風(fēng)散、桂枝湯、黃芪桂枝五物湯、辛夷散等經(jīng)典名方基礎(chǔ)上，經(jīng)多年臨床實(shí)踐，不斷加減化裁而成，具有健脾益肺、散寒通竅、益衛(wèi)固表的功效。臨床研究表明，健脾益肺鼻炎方治療肺氣虛寒型變應(yīng)性鼻炎具有可靠的臨床療效，長(zhǎng)期服用可顯著改善患者流涕、鼻塞、鼻癢和打噴嚏等癥狀，減輕鼻部炎癥反應(yīng)，降低患者復(fù)發(fā)率[3]。藥理實(shí)驗(yàn)表明，方中君藥黃芪的有效成分黃芪多糖可通過(guò)抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、核轉(zhuǎn)錄因子κB和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等炎癥因子的表達(dá)，顯著改善卵清蛋白誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎模型大鼠的黏膜炎癥反應(yīng)[4-5]。為深入研究健脾益肺鼻炎方發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究以復(fù)方水煎液為模式標(biāo)準(zhǔn)，參照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備原則和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》制備原則[6]，擬建立其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，篩選影響其質(zhì)量的主要指標(biāo)成分，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，旨在為該方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基準(zhǔn)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）、MS-105DN型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）、TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)RFS-S00411804028）、升麻素對(duì)照品（批號(hào)S-007-180427）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（批號(hào)J-002-180731）、亥茅酚苷對(duì)照品（批號(hào)H-027-180426）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)M-020-190219）、毛蕊異黃酮對(duì)照品（批號(hào)M-021-180926）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)C-018-181216）、木蘭脂素對(duì)照品（批號(hào)RFS-M03111808031）均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，純度均大于97%；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為蒸餾水。

黃芪、白術(shù)等8種中藥飲片均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，由該院藥學(xué)部李得堂副主任中藥師鑒定均為真品。10批健脾益肺鼻炎方中8種中藥飲片的來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 10批健脾益肺鼻炎方中8種中藥飲片來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取健脾益肺鼻炎方全方飲片（黃芪、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、干姜、桔梗、辛夷、白芷各適量），以10倍量水（mL/g）浸泡30 min，先武火煮沸后文火煎煮60 min，濾過(guò)；藥渣加入8倍量水（mL/g），先武火煮沸后文火煎煮40 min，過(guò)濾；合并2次濾液，小火濃縮至300 mL，即得標(biāo)準(zhǔn)湯劑，冷凍備用[6]。

2.1.2 供試品溶液的制備 吸取“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，以4 000 r/min離心20 min，精密量取上清液2 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，以4 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和木蘭脂素對(duì)照品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成上述各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為21.3、15.6、16.0、19.5、20.3、15.5、13.9、17.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 色譜條件色譜柱為YMC Hydrosphere C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～28 min，15%A→23%A；28～36 min，23%A→31%A；36～41 min，31%A→32%A；41～46 min，32%A→40%A；46～52 min，40%A→47%A；52～62 min，47%A→60%A；62～70 min，60%A→75%A）；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以6號(hào)峰為參照峰（該峰分離度較好），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S1），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以6號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于4.00%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.00%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 特征圖譜的建立及共有峰的指認(rèn) 分別精密吸取10批次健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將所得的10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC色譜圖以“AIA”格式文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）》進(jìn)行分析，以S7樣品的HPLC色譜圖為參照?qǐng)D譜（該批樣品色譜峰分離度較好），6號(hào)峰為參照峰，采用中位數(shù)法生成10批樣品的疊加特征圖譜和對(duì)照特征圖譜（R）。結(jié)果，10批健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑共標(biāo)定出24個(gè)共有特征峰（圖1）。經(jīng)與“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品的色譜圖比對(duì)，共指認(rèn)了8個(gè)特征峰，分別是升麻素苷（2號(hào)峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號(hào)峰）、升麻素（5號(hào)峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號(hào)峰）、亥茅酚苷（12號(hào)峰）、毛蕊異黃酮（15號(hào)峰）、芒柄花素（19號(hào)峰）和木蘭脂素（21號(hào)峰）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 10批健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC疊加特征圖譜與對(duì)照特征圖譜（R）

圖2 混合對(duì)照品溶液和健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）》對(duì)10批健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批樣品的相似度分別為0.993、0.968、0.991、0.981、0.994、0.995、0.991、0.989、0.993、0.997，相似度均大于0.960，表明10批次樣品相似度較高，化學(xué)組分大致相同，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

2.2 化學(xué)計(jì)量法分析

2.2.1 聚類(lèi)分析 將10批健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有特征峰峰面積量化處理，用SPSS 26.0軟件分析，采用瓦爾德聯(lián)接方法，數(shù)據(jù)以平方歐氏距離為測(cè)距，進(jìn)行聚類(lèi)分析（cluster analysis，CA）。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，10批樣品聚為3類(lèi)，S1、S2和S10聚為一類(lèi)，S3～S7聚為一類(lèi)，S8、S9聚為一類(lèi)。

圖3 10批樣品CA樹(shù)狀圖

2.2.2 主成分分析 以24個(gè)共有特征峰峰面積為初始數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，共確定出4個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.509%，表明這4個(gè)主成分對(duì)健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)具有良好的代表性。結(jié)果見(jiàn)表2（表中僅展示前4個(gè)主成分的相關(guān)數(shù)據(jù)）。以24個(gè)共有特征峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，10批次樣品可聚為3類(lèi)，與CA結(jié)果一致。

表2 PCA的特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖4 10批樣品的PCA圖

2.2.3 正交偏最小二乘法-判別分析 采用SIMCA 14.1軟件對(duì)10批健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的24個(gè)共有特征峰峰面積進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。結(jié)果顯示，其模型解釋率參數(shù)R2X、R2Y和預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2分別為0.962、0.996、0.649，均大于0.5，說(shuō)明該模型具有較好的擬合能力及預(yù)測(cè)能力[7]。以變量重要性投影（variable important in projection，VIP）值＞1.5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)確定影響樣品的差異變量（變量VIP值越高，對(duì)組間差異的影響越大），結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，共有3個(gè)共有特征峰的VIP值＞1.5，依次為升麻素苷（2號(hào)峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號(hào)峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號(hào)峰），表明這3個(gè)成分可能是影響健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量差異的主要化學(xué)成分。

圖5 24個(gè)共有特征峰OPLS-DA的VIP值圖

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8、10 μL，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果，各成分在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，詳見(jiàn)表3。

表3 各成分線(xiàn)性回歸方程和線(xiàn)性范圍

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD分別為0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.21%、1.34%、1.00%、0.18%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S1），按“2.1.2”項(xiàng)下條件平行制備6份供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的RSD分別為0.17%、0.38%、0.36%、0.13%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品各適量，分別加甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為163、107、103、120 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑（編號(hào)S5）1 mL，共6份，按質(zhì)量比1∶1精密加入各對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，4種成分的平均加樣回收率分別為105.98%、98.06%、96.38%、104.17%，RSD分別為1.75%、3.87%、4.03%、1.27%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 4種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3.6 樣品含量測(cè)定 精密量取10批次健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備10批供試品溶液，再按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 4種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/mL）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究在建立特征圖譜時(shí)，分別考察了Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18、YMC Hydrosphere C18、Kromasil C183種色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YMC Hydrosphere C18分離效果最好，出峰多且峰形較佳。又分別考察了甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分離效果較優(yōu)。為改善峰形及基線(xiàn)，分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)的磷酸溶液（0.02%、0.05%、0.1%），結(jié)果表明，0.05%磷酸溶液可較好地改善峰形和分離度，且色譜峰基線(xiàn)平穩(wěn)。因此，選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相。又分別對(duì)不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，在1.0 mL/min的流速下，色譜峰之間的分離度更優(yōu)。本研究還考察了200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的色譜峰效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在230 nm下，各峰之間分離度較好，吸收峰多且基線(xiàn)平穩(wěn)，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的建立及定量指標(biāo)的選擇

中藥復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)湯劑為中醫(yī)臨床用藥的主要形式，其作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，可保障臨床藥效和質(zhì)量的一致性[8-9]。本研究收集了臨床在用的10批處方飲片，以復(fù)方標(biāo)準(zhǔn)水煎液為模式標(biāo)準(zhǔn)，建立了化學(xué)特征圖譜和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，共確定了24個(gè)共有特征峰，相似度均大于0.960。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，共指認(rèn)出8個(gè)色譜峰?；瘜W(xué)計(jì)量法CA、PCA和OPLS-DA評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，10批樣品可分為3類(lèi)，S1、S2和S10聚為一類(lèi)，S3～S7聚為一類(lèi)，S8、S9聚為一類(lèi)；VIP值＞1.5的色譜峰主要有3個(gè)，依次為升麻素苷（2號(hào)峰）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（4號(hào)峰）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（6號(hào)峰），推測(cè)以上3個(gè)成分可能是影響樣品質(zhì)量差異的主要化學(xué)成分。

上述分析中，升麻素雖不是影響健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量的重要差異成分，但多種研究表明，升麻素具有較強(qiáng)的抗炎作用[10-11]，可通過(guò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間的緊密連接，降低相關(guān)炎癥因子TSLP和白介素33的表達(dá)，顯著抑制異硫氰酸熒光素誘導(dǎo)的小鼠過(guò)敏性皮炎[12]。因此，筆者建議可將升麻素也作為健脾益肺鼻炎方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，即將升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素4種成分共同作為HPLC的含量測(cè)定指標(biāo)。含量測(cè)定結(jié)果顯示，4種成分的含量分別為 12.12～18.87、3.86～6.40、3.10～4.27、11.17～15.79 μg/mL，各批次成分含量測(cè)定具有一定的差異，可能與藥材采收時(shí)間、采收地點(diǎn)、產(chǎn)地加工方式等多種因素有關(guān)，再次表明對(duì)該方標(biāo)準(zhǔn)湯劑建立全面規(guī)范的質(zhì)量控制體系具有必要性。

綜上所述，本研究建立的HPLC特征圖譜方法穩(wěn)定可行，可用于健脾益肺鼻炎方的質(zhì)量控制；升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷可作為該方標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。