地稔中6種成分含量測(cè)定及其與抗氧化活性的相關(guān)性分析Δ

劉 靜 ，明惠儀 ，麻秀萍 ，錢 松 ，楊 菁 ，4，吳登莉 ，郭江濤 ，4（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.織金縣人民醫(yī)院藥劑科，貴州畢節(jié) 5500；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心/貴州中藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴陽 55005；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)茶大健康食品開發(fā)研究中心，貴陽 55005）

地稔為野牡丹科植物地菍Melastoma dodecandrumLour.的新鮮或干燥全草，是貴州地區(qū)常用民族藥，具有清熱解毒、活血止血的功效，臨床常用于治療高熱、肺癰、水腫、帶下、產(chǎn)后腹痛、癰腫等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，地稔含有黃酮、有機(jī)酸、甾體及其苷、鞣質(zhì)、多糖等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、止血、降脂、降血糖等作用[2-3]?！顿F州省中藥材、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中僅記載了地稔的性狀、鑒別、性味歸經(jīng)等，尚無含量測(cè)定項(xiàng)目，不能有效評(píng)價(jià)其質(zhì)量。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用外標(biāo)法測(cè)定地稔中沒食子酸、蘆丁、牡荊素、異牡荊素、鞣花酸等成分的含量[4-6]，但所報(bào)道的方法僅能同時(shí)測(cè)定1～2種成分，難以經(jīng)濟(jì)、有效地評(píng)價(jià)地稔的質(zhì)量，故建立同時(shí)測(cè)定地稔中多指標(biāo)成分含量的方法很有必要。

一測(cè)多評(píng)（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法是以性質(zhì)穩(wěn)定且廉價(jià)易得的某個(gè)成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分的相對(duì)校正因子（fs/i）來計(jì)算待測(cè)成分含量的方法，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分同時(shí)測(cè)定[7-8]。該方法既解決了對(duì)照品不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等問題，也節(jié)約了工作時(shí)間，降低了含量測(cè)定成本[8]。活性氧是一系列參與人體病理和退行過程的代謝物，過量的活性氧會(huì)誘導(dǎo)器官及組織的自由基損傷，從而加速多種疾病的發(fā)展[9]。有研究表明，地稔可有效地清除氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用[10]，但目前對(duì)其發(fā)揮抗氧化活性的有效成分尚不明確。本研究選擇地稔中6種含量相對(duì)較高的成分（包括酚酸類成分沒食子酸、原兒茶酸，黃酮類成分牡荊素、異牡荊素、蘆丁，鞣質(zhì)類成分鞣花酸）為對(duì)象，建立QAMS法同時(shí)測(cè)定其含量，并分析上述6種成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性，旨在為地稔的質(zhì)量分析及控制提供準(zhǔn)確、可行、經(jīng)濟(jì)的評(píng)價(jià)方法。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1290 InfinityⅡ系列超高效液相色譜（UPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）、MS205DU型十萬分之一電子天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）、FA2204N型萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）、1530型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201906，純度91.5%）、原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)110809-201906，純度97.7%）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào)111687-201704，純度94.9%）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)111959-201903，純度88.8%）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)C100001-200628，純度98.0%）和異牡荊素對(duì)照品（批號(hào)C101499-201219，純度98.00%）均購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；甲醇（色譜純）購自美國(guó)Tedia公司；其余試劑均為分析純；水為超純水。

23批地稔藥材采集于貴州、廣東、廣西、湖南、浙江等地，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定均為野牡丹科植物地菍M.dodecandrumLour.的全草。地稔藥材來源信息見表1。

表1 地稔藥材來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以 Waters ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相A、甲醇為流動(dòng)相B進(jìn)行洗脫梯度（0～4 min，3%B；4～6 min，3%B～5%B；6～18 min，5%B～10%B；18～23 min，10%B～25%B；23～27 min，25%B～30%B；27～42 min，30%B～35%B；42～44 min，35%B；44～48 min，35%B～40%B；48～50 min，40%B～50%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；進(jìn)樣體積為0.8 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對(duì)照品各適量，加甲醇溶解，分別制成質(zhì)量濃度為0.361、0.314、0.325、0.400、0.454 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。另精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量，加入二甲基亞砜2 mL使溶解，再以甲醇稀釋制成0.165 mg/mL的鞣花酸對(duì)照品溶液。取上述6種單一對(duì)照品溶液適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度制成混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取地稔粉末（過2號(hào)篩）1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，85℃水浴回流提取1 h，取出放冷，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性考察 分別精密量取空白溶劑（75%甲醇）、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各0.8 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，空白溶劑對(duì)6種待測(cè)成分的檢測(cè)無干擾，方法專屬性好。色譜圖見圖1（空白溶劑圖略）。

圖1 地稔中6種待測(cè)成分的UPLC圖

2.3.2 線性范圍考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液各適量，加甲醇稀釋制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各待測(cè)對(duì)照品的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 地稔中6種待測(cè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下線性范圍下限濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.36%、0.28%、0.64%、0.29%、0.20%、0.69%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（編號(hào)DR23），分別于室溫放置2、4、6、8、10、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.27%、0.38%、0.56%、0.60%、0.29%、2.96%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批地稔藥材（編號(hào)DR23）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算各成分的含量。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸含量的RSD分別為2.06%、1.64%、1.57%、2.36%、2.93%、2.49%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批地稔藥材（編號(hào)DR23）6份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入與地稔中各成分含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的平均加樣回收率分別為 97.79%、100.18%、97.84%、96.45%、91.84%、108.06%，RSD分別為1.71%、2.32%、1.41%、1.48%、1.20%、6.66%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.4 QAMS法的建立

2.4.1fs/i的計(jì)算 分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積。以牡荊素為內(nèi)參物，采用多點(diǎn)校正法計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的fs/i：fs/i＝（As×ci）/（cs×Ai）（As為內(nèi)參物的峰面積，ci為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度，cs為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)成分的峰面積）[11]。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的fs/i分別為0.255、0.140、1.038、0.654、0.070，RSD分別為1.46%、1.18%、2.51%、0.91%、3.28%（n＝6）。

2.4.2 不同色譜柱、柱溫和流速對(duì)fs/i的影響 采用Agilent 1290 InfinityⅡ系列UPLC儀，考察不同色譜柱（Waters ACQUITY UPLC HSS T3、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、Agilent ZORBAX Stable Bond SB-C18，規(guī)格均為 2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.18、0.20、0.22 mL/min）對(duì)各成分fs/i的影響。結(jié)果顯示，在不同色譜柱、柱溫和流速下，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的平均fs/i分別為0.259、0.141、1.061、0.616、0.076，RSD 分別為 0.72%、0.83%、0.73%、1.07%、1.48%（n＝9），表明不同色譜柱、柱溫和流速對(duì)5種待測(cè)成分的fs/i無明顯影響。

2.4.3 不同色譜柱、柱溫和流速對(duì)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間差的影響 以牡荊素為內(nèi)參物，計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間差，考察“2.4.2”項(xiàng)下不同色譜柱、柱溫、流速對(duì)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間差的影響。結(jié)果顯示，5種成分的平均相對(duì)保留時(shí)間分別為0.175、0.336、1.092、1.166、1.215，RSD分別為10.27%、7.27%、0.96%、1.40%、1.99%（n＝9）；平均相對(duì)保留時(shí)間差分別為-25.628、-31.860、3.546、6.439、8.344，RSD 分 別 為1.70%、1.89%、13.95%、12.76%、13.77%?？梢?，異牡荊素、蘆丁、鞣花酸均可利用相對(duì)保留時(shí)間值法進(jìn)行準(zhǔn)確定位。由于沒食子酸和原兒茶酸的相對(duì)保留時(shí)間偏小，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD均大于5%，利用相對(duì)保留時(shí)間值法對(duì)沒食子酸和原兒茶酸準(zhǔn)確定位較為困難；而二者相對(duì)保留時(shí)間差的RSD均小于5%，表明二者可利用相對(duì)保留時(shí)間差值法進(jìn)行準(zhǔn)確定位，此外還可結(jié)合二者的紫外吸收特征對(duì)色譜峰進(jìn)行定位。

2.5 地稔中6種成分含量的測(cè)定

取23批地稔藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以牡荊素為內(nèi)參物，通過fs/i分別計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的含量，同時(shí)采用外標(biāo)法計(jì)算沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸的含量。采用SPSS 25.0軟件對(duì)外標(biāo)法與QAMS法的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。平行2份操作，取平均值，結(jié)果見表3。

表3 23批地稔藥材中6種成分外標(biāo)法與QAMS法的含量測(cè)定結(jié)果（n＝2，%%）

2.6 地稔抗氧化活性的測(cè)定

2.6.1 DPPH自由基清除法 參考文獻(xiàn)[12]的方法制備1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）工作液。取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，用75%甲醇稀釋200倍，得到生藥質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的供試品溶液。將96孔板分為空白組、樣品組、對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)平行樣?？瞻捉M加入75%甲醇溶液100 μL+DPPH工作液100 μL，樣品組加入供試品溶液100 μL+DPPH工作液100 μL，對(duì)照組加入供試品溶液100 μL+75%甲醇100 μL。3組樣品均于室溫下避光靜置20 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，依次記為A0（空白組）、A1（樣品組）和A2（對(duì)照組）。按下式計(jì)算自由基清除率：自由基清除率＝[1-（A1-A2）/A0]×100%。結(jié)果見表4。

表4 23批地稔藥材的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果（n＝4）

2.6.2 ABTS自由基清除法 參考文獻(xiàn)[12]的方法制備2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）法工作液。取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，用75%甲醇稀釋100倍，得到生藥質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的供試品溶液。將96孔板分為空白組、樣品組、對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)平行樣。空白組加入75%甲醇溶液20 μL+ABTS工作液180 μL，樣品組加入供試品溶液20 μL+ABTS工作液180 μL，對(duì)照組加入供試品溶液20 μL+水180 μL。3組樣品均于室溫下避光靜置30 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，依次記為A0（空白組）、A1（樣品組）和A2（對(duì)照組）。按“2.6.1”項(xiàng)下公式計(jì)算ABTS自由基清除率。結(jié)果見表4。

2.6.3 FRAP法 參考文獻(xiàn)[13]的方法制備鐵離子還原/抗 氧 化 能 力（ferric ion reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）工作液。將96孔板分為樣品組和空白組，每組設(shè)置4個(gè)平行樣。樣品組加入“2.6.2”項(xiàng)下生藥質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的供試品溶液20 μL+FRAP工作液180 μL，空白組加入75%甲醇20 μL+FRAP工作液180 μL。2組樣品均于37℃下靜置10 min，在593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，分別記為Ai（樣品組）、Aj（空白組）。另分別配制濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmoL/L的硫酸亞鐵溶液，按上述方法測(cè)定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液的吸光度（Ai-Aj）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算對(duì)應(yīng)的硫酸亞鐵濃度，記為“FRAP值”。結(jié)果見表4。

2.7 6種成分的含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

2.7.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 采用Excel 2010軟件，對(duì)23批地稔藥材中6種成分的含量與抗氧化活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、鞣花酸含量與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)系數(shù)均大于0.6，表明關(guān)聯(lián)度較高[13]。6種成分對(duì)DPPH自由基清除率貢獻(xiàn)大小順序?yàn)楫惸登G素＞鞣花酸＞牡荊素＞蘆?。驹瓋翰杷幔緵]食子酸，對(duì)ABTS自由基清除率貢獻(xiàn)大小順序?yàn)楫惸登G素＞蘆?。灸登G素＞鞣花酸＞原兒茶酸＞沒食子酸，對(duì)FRAP值貢獻(xiàn)大小順序?yàn)楫惸登G素＞牡荊素＞蘆?。诀坊ㄋ幔驹瓋翰杷幔緵]食子酸。結(jié)果見表5。

表5 地稔中6種成分含量與抗氧化活性的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.7.2 雙變量相關(guān)性分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量與DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），原兒茶酸含量與DPPH自由基清除率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。在ABTS自由基清除率和FRAP值分析中，牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），沒食子酸、原兒茶酸含量與抗氧化活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)果見表6。

表6 地稔中6種成分含量與抗氧化活性的雙變量相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的篩選

本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品溶液的制備條件[提取方式（回流、超聲）和甲醇體積分?jǐn)?shù)（25%、50%、75%、100%）]進(jìn)行了比較，并對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。以6種成分的提取率為指標(biāo)，綜合優(yōu)選采用75%甲醇回流提取制備供試品溶液。6種成分在254 nm和260 nm波長(zhǎng)下均有較大吸收，牡荊素和異牡荊素在260 nm波長(zhǎng)下較254 nm波長(zhǎng)下響應(yīng)值高，因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

3.2 混合對(duì)照品溶液穩(wěn)定性的考察

本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了混合對(duì)照品溶液在5 d和2、3個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、異牡荊素、蘆丁溶液放置3個(gè)月的fs/i的RSD均小于3.00%，表明穩(wěn)定性較好；鞣花酸溶液在上述3個(gè)時(shí)間段的fs/i的RSD分別為2.36%、3.70%、7.00%，表明穩(wěn)定性相對(duì)較差。由于鞣花酸同時(shí)含有親脂結(jié)構(gòu)（4個(gè)環(huán)）和親水結(jié)構(gòu)（4個(gè)酚基和2個(gè)內(nèi)酯環(huán)），導(dǎo)致其親水性及親脂性均較差，微溶于水和醇，溶于二甲基亞砜，故制備鞣花酸對(duì)照品溶液時(shí)需加適量二甲基亞砜助溶[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)，鞣花酸的fs/i會(huì)隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而增大，故不宜保存過久，盡量在5 d內(nèi)測(cè)定。

3.3 地稔中6種成分的抗氧化活性分析

酚類化合物中羥基的數(shù)量、位置、相關(guān)的糖基化以及其他取代基在很大程度上決定了其自由基清除活性，其中鄰二羥基是所有酚類化合物顯示出高活性最重要的結(jié)構(gòu)特征[15]。黃酮類化合物骨架中2，3-雙鍵、4-酮基、3′，4′-鄰二酚羥基和C-3位羥基結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化活性起重要作用[16-17]。已有研究報(bào)道，鞣花酸、沒食子酸對(duì)地稔抗氧化活性貢獻(xiàn)顯著，原因可能與其含量及結(jié)構(gòu)中鄰二酚羥基有關(guān)[3]?；疑P(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示，6種成分的含量與抗氧化活性均有較高關(guān)聯(lián)度，其中異牡荊素與抗氧化活性關(guān)聯(lián)度最高，沒食子酸與抗氧化活性關(guān)聯(lián)度最低；雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示，蘆丁與抗氧化活性相關(guān)性最顯著，而鞣花酸與抗氧化活性無顯著相關(guān)性。這一結(jié)果差異可能是因?yàn)橹苽涞牡仫┰嚻啡芤何唇?jīng)水解，致使沒食子酸含量偏低，而鞣花酸理化性質(zhì)特殊，單純使用75%甲醇提取率較低所致。

綜上所述，本研究成功建立了QAMS法同時(shí)測(cè)定地稔中6種成分的含量，測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法無顯著差異；地稔中6種成分與抗氧化活性均有較高相關(guān)性。