神農(nóng)香菊莖葉總黃酮與總酚的提取純化和抗氧化活性研究＊

馮 穎，李 彬，周春苗，葉利春，盧 山，劉義飛

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065）

神農(nóng)香菊（Chrysanthemum indicumvar.aromaticum）屬于菊科菊屬植物，是野菊的一個(gè)新變種[1]。神農(nóng)香菊具有較高的藥用價(jià)值，其干燥頭狀花序可入藥,具有清熱解毒、散風(fēng)降壓、平肝明目等藥理作用；從神農(nóng)香菊中提取的精油具有較強(qiáng)的抑菌，可以作為食品中一種天然抗氧化劑[2]。然而，神農(nóng)香菊的利用多集中在花部位，其莖和葉則在收獲期間被丟棄，導(dǎo)致資源的巨大浪費(fèi)。因此，為了實(shí)現(xiàn)神農(nóng)香菊資源利用的最大化，急需對(duì)其莖葉的潛在價(jià)值進(jìn)行深入研究和評(píng)估。

目前，針對(duì)神農(nóng)香菊的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)研究集中在對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)成分的分析，只有少量研究關(guān)注到其黃酮類化合物的含量，極少?gòu)姆肿訉用鎸?duì)神農(nóng)香菊黃酮與酚酸類進(jìn)行成分鑒定[3-4]。因此，本文首先篩選適宜于從神農(nóng)香菊莖葉中提取純化總黃酮與總酚的工藝參數(shù)，然后使用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式建立一種能夠同時(shí)測(cè)定神農(nóng)香菊莖葉提取物中多種成分的定性和定量分析方法，最后通過(guò)DPPH 自由基清除試驗(yàn)和分子對(duì)接評(píng)價(jià)神農(nóng)香菊莖葉提取物作為天然抗氧化原料的潛力，為神農(nóng)香菊莖葉資源的應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

本實(shí)驗(yàn)所使用的儀器主要包括UV-1800PC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司），RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SCQ-5201C 超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司），Scientz-100F 冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），Nexera X2 超高效液相色譜儀（日本島津）和4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）等。

1.2 原料與試劑

神農(nóng)香菊莖葉原料采集于湖北神農(nóng)架中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院神農(nóng)香菊種植基地。新鮮莖葉用純化水洗凈晾干，液氮速凍后通過(guò)研磨機(jī)碾碎，在鋁箔包裹下于-80°C 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。大孔?shù)脂（AB-8、D101、HP-20）購(gòu)自東鴻化工有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈購(gòu)自默克公司；分析級(jí)無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兒茶酚、蘆丁、槲皮素、蒙花苷、綠原酸、去甲漢黃芩素、木犀草素、芹菜素、3-羥基黃酮和1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；二丁基羥基甲苯（BHT）購(gòu)自江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮與總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

總黃酮含量（TFC）測(cè)定采用Wang等[5]描述的方法進(jìn)行。取適量蘆丁溶液于25 mL 容量瓶中，加入1 mL亞硝酸鈉溶液（10%）混勻，放置6 min；然后加入1 mL硝酸鋁溶液（5%）混勻，放置6 min；最后加入5 mL 氫氧化鈉溶液（4%），用60%乙醇溶液定容至刻度混勻，放置15 min 后，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)量吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=11.7x+0.0054（r2=0.9990）。

總酚含量（TPC）測(cè)定采用Yoshimoto 等[6]描述的方法進(jìn)行。取0.1 mL 兒茶酚溶液與0.5 mL 福林-酚試劑渦旋混勻，在 25°C 下放置 20 min；再加入 0.5 mL 碳酸鈉溶液（6%）和0.9 mL 雙蒸水，渦旋混勻，放置10 min后，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在760 nm 處測(cè)量吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0093x+0.0005（r2=0.9997）。

2.2 神農(nóng)香菊莖葉總黃酮與總酚的提取

2.2.1 單因素考察

神農(nóng)香菊莖葉總黃酮和總酚的提取使用超聲波輔助進(jìn)行（溫度為25°C，頻率為50 Hz）[7]，工藝流程如圖1A 所示。首先稱取神農(nóng)香菊莖葉原料5 g，反復(fù)提取兩次，過(guò)濾并合并濾液；然后將粗提液在50°C 下減壓蒸發(fā)濃縮；最后冷凍干燥以完全去除水分。單因素試驗(yàn)分別按照以下條件進(jìn)行：料液比（1:5 g·mL-1、1:10 g·mL-1、1:20 g·mL-1、1:30 g·mL-1、1:40 g·mL-1、1:50 g·mL-1）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、100%）、提取時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）。結(jié)果如圖1B-D 所示，在料液比為1:5 g·mL-1、乙醇濃度為70%和提取時(shí)間為40 min時(shí)，總黃酮和總酚的提取率最高。

圖1 神農(nóng)香菊莖葉的提取流程和單因子考察

2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素考察基礎(chǔ)上，采用L（933）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化了神農(nóng)香菊莖葉總黃酮和總酚的提取參數(shù)[8]。如表1 所示，分別選取了料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間三個(gè)因素中的三個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行優(yōu)化。每份試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如表2，三個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響順序?yàn)榱弦罕龋≧=5.30）＞乙醇濃度（R=5.01）＞提取時(shí)間（R=1.92）。類似的，三個(gè)因素對(duì)總酚提取率的影響順序也為料液比（R=1.62）＞乙醇濃度（R=1.43）＞提取時(shí)間（R=0.34）。該結(jié)果與方差分析中的F 值大小是一致的（表3）。因此，確定神農(nóng)香菊莖葉總黃酮和總酚的最佳提取參數(shù)如下：乙醇濃度70%，料液比1:5 g·mL-1，提取時(shí)間60 min。該最佳參數(shù)組合包括在9 組試驗(yàn)中（A2B1C2），且表現(xiàn)出最高的總黃酮提取率（18.30%）和總酚提取率（6.01%）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中使用的因素和水平

表2 神農(nóng)香菊莖葉總黃酮和總酚提取率的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果（n=3）

表3 正交試驗(yàn)的方差分析

2.3 神農(nóng)香菊莖葉總黃酮與總酚的純化

2.3.1 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理

本文考察了常用于黃酮純化的三種樹(shù)脂類型（AB-8、D101 和 HP-20）。首先樹(shù)脂以 1:20（樹(shù)脂/溶劑）的比例在95%乙醇溶液中浸泡24 h，充分溶脹后用去離子水洗滌樹(shù)脂至無(wú)乙醇味，再依次在5%氫氧化鈉（m/v）和5%鹽酸（v/v）溶液中浸泡24 h；然后將樹(shù)脂用去離子水洗滌，直至達(dá)到中性。最后將樹(shù)脂浸泡在無(wú)水乙醇中，再次用水洗滌至無(wú)乙醇味[9]。

2.3.2 大孔樹(shù)脂的篩選

稱取處理后的三種樹(shù)脂各4 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL 樣品溶液，置恒溫振蕩器中振搖24 h使總黃酮和總酚充分吸附（25°C，100 rpm），離心，過(guò)濾并測(cè)定濾液中總黃酮和總酚含量。然后用去離子水洗滌樹(shù)脂兩次，再將洗滌后的樹(shù)脂置于40 mL 的60%乙醇溶液中振搖24 h 使總黃酮和總酚充分解吸附，離心，過(guò)濾并測(cè)定濾液中總黃酮和總酚含量。以樹(shù)脂的靜態(tài)吸附率（A%）和靜態(tài)解吸率（D%)為指標(biāo)，每份樣品重復(fù)三次。

結(jié)果如圖2 所示，D101 樹(shù)脂對(duì)總黃酮的吸附率最高，HP-20 樹(shù)脂對(duì)總酚的吸附率最高。另一方面，D101樹(shù)脂對(duì)總黃酮和總酚都具有最優(yōu)的解吸附能力，而HP-20 樹(shù)脂對(duì)總酚的解吸率明顯偏低，表明總酚不能充分從HP-20樹(shù)脂中洗脫。相比之下，D101樹(shù)脂更適合富集純化神農(nóng)香菊莖葉總黃酮與總酚。

圖2 三種大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率

2.3.3 上樣濃度的影響

動(dòng)態(tài)吸附和解吸附過(guò)程采用填充D101 樹(shù)脂（干重為9.82 g）的玻璃層析柱（2.6 cm×30 cm）進(jìn)行，柱體積為40 mL（1 BV）。分別向?qū)游鲋屑尤?20 mL 不同濃 度（0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15 和 0.16 g·mL-1）的樣品溶液，控制上樣流速為3.0 BV/h，收集流出液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同濃度下總黃酮和總酚的吸附率。結(jié)果如圖3A 所示，在考察范圍內(nèi)總黃酮和總酚的吸附率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)上樣濃度為0.12 g·mL-1時(shí)，總黃酮和總酚的吸附率達(dá)到其最大值，分別為94.48%和87.69%。因此，選擇上樣濃度為0.12 g·mL-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.4 上樣體積的影響

制備濃度為0.12 g·mL-1的神農(nóng)香菊莖葉提取液（總黃酮含量為 3241.90 ± 3.61 μg·mL-1、總酚含量為892.78 ± 0.20 μg·mL-1），以 3.0 BV/h 的流速加入到D101 樹(shù)脂層析柱中，每1 BV 收集1 份流出液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同體積下總黃酮和總酚的含量。當(dāng)流出液中總黃酮或總酚的含量達(dá)到初始樣品溶液的10%時(shí)，即達(dá)到泄露點(diǎn)。從圖3B 可以看出，當(dāng)上樣體積為3 BV時(shí)，流出液中總黃酮與總酚的濃度剛好達(dá)到初始樣品濃度的10%，分別為344.70 μg·mL-1和88.72 μg·mL-1，表明樹(shù)脂已達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附平衡。因此，選擇上柱體積為3 BV。

2.3.5 上樣流速的影響

將120 mL 濃度為0.12 g·mL-1的神農(nóng)香菊莖葉提取液，以不同流速（1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 BV/h）加入到D101樹(shù)脂層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。收集流出液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同流速下總黃酮和總酚的吸附率。如圖3C 所示，當(dāng)上樣流速大于3.0 BV/h 時(shí)，總黃酮與總酚在樹(shù)脂上的吸附率顯著降低。這可能是因?yàn)榱魉佥^大時(shí)，樣品溶液與樹(shù)脂的接觸時(shí)間較短，黃酮和多酚類化合物不能及時(shí)被吸附而發(fā)生泄漏?？紤]到時(shí)間成本，選擇最佳純化流速為3.0 BV/h。

2.3.6 洗脫濃度的影響

首先按照上述優(yōu)化后的吸附條件進(jìn)行吸附過(guò)程，待上樣完畢后靜置30 min，使用120 mL 去離子水洗滌樹(shù)脂兩次去除雜質(zhì)。然后，以120 mL 不同濃度（10%、30%、50%、70%、80%和90%）的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為3 BV/h。收集洗脫液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同乙醇濃度洗脫下總黃酮和總酚的解吸率。結(jié)果如圖3D 所示，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，總黃酮和總酚的解吸率同時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，兩者解吸率呈下降趨勢(shì)。因此，選擇80%乙醇溶液作為解吸附溶劑。

2.3.7 洗脫流速的影響

使用相同的程序，將120 mL 80%乙醇溶液以不同流速（1.5、3.0、4.5、6.0 和7.5 BV/h）加入到層析柱中進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同洗脫流速下總黃酮和總酚的解吸率。從圖3E可以看出，當(dāng)洗脫流速大于4.5 BV/h 后，總黃酮與總酚的解吸率均顯著降低，表明低流速更有利于總黃酮與總酚的洗脫，這可能是由于乙醇能充分進(jìn)入樹(shù)脂孔徑內(nèi)部使黃酮和多酚洗脫。考慮到時(shí)間成本，選擇洗脫流速為4.5 BV/h。

圖3 動(dòng)態(tài)吸附和解吸附曲線

2.3.8 洗脫體積的影響

使用相同的程序，將120 mL 80%乙醇溶液以4.5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫。每1 BV 收集1份洗脫液，測(cè)定吸光度并計(jì)算不同洗脫體積下總黃酮和總酚的解吸率。結(jié)果如圖3F 所示，洗脫峰主要集中在0-3 BV 的洗脫體積內(nèi)，表明大部分總黃酮和總酚已被解吸附[10]。相比總酚而言，總黃酮的峰窄而高，說(shuō)明總黃酮比總酚更容易從樹(shù)脂中洗脫出來(lái)。當(dāng)洗脫體積大于4 BV時(shí)，洗脫液中總黃酮的含量基本未發(fā)生變化，表明樹(shù)脂中所吸附的黃酮已洗脫完全；而在5 BV的洗脫體積下，洗脫液中的總酚才基本洗脫完全?？紤]到在4 和5 BV 時(shí)，洗脫液中總酚含量的差異小于2%，洗脫體積的增加可能會(huì)導(dǎo)致成本和所需時(shí)間增加，也不利于溶液的濃縮，因此確定洗脫體積為4 BV。

2.3.9 純化工藝驗(yàn)證

使用D101 大孔樹(shù)脂對(duì)神農(nóng)香菊莖葉粗提液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸附，上樣濃度為0.12 g·mL-1，上樣體積為3 BV，上樣流速為3.0 BV/h，洗脫溶劑為80%乙醇溶液，洗脫流速為4.5 BV/h，洗脫體積為4 BV。以純化率作為驗(yàn)證指標(biāo)，進(jìn)行三批驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)D101 大孔樹(shù)脂吸附后，提取物中總黃酮純度為52.18±0.52%，總酚純度為24.24±0.54%，分別是粗提物的2.85倍和4.03倍。

2.4 神農(nóng)香菊莖葉提取物純化前后的UPLC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件

Agilent SB-C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為超純水（加入0.1%的甲酸），B為乙腈（加入0.1%的甲酸），梯度洗脫程序：0.0-5.0 min，18%B；5.0-15.0 min，25% B；15.0-20.0 min，25% B；20.0-30.0 min，25% B；30.0-45.0 min，33% B。流速為0.35 mL·min-1，柱溫為40°C，進(jìn)樣量為4 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），離子噴霧電壓（Ion Spray Voltage）5500 V（正離子模式）；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；離子源氣體I（GS I）,氣體Ⅱ（GSⅡ）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為 50、60 和 25 psi；離子源溫度為550°C。各標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)化質(zhì)譜離子參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 被測(cè)樣品離子優(yōu)化參數(shù)。

2.4.3 樣品溶液的制備

分別稱取0.01 g 純化前后的樣品，加入20 mL 80%甲醇超聲溶解，離心，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4.4 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱取適量蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸對(duì)照品，加入80%甲醇超聲溶解，制成濃度為1.0 mg ·mL-1的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；然后分別量取適量各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.4.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

吸取適量供試品稀釋液和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按以上色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。總離子流圖如圖4 所示，8 個(gè)成分之間分離良好，分離度均大于1.5，并以蒙花苷為例給出其MRM 掃描下的色譜圖信息，樣品稀釋液與混合對(duì)照品的質(zhì)譜圖各成分離子流色譜峰保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)，表明本方法專屬性良好。

圖4 神農(nóng)香菊樣品UPLC-MS/MS色譜圖

2.4.6 線性關(guān)系考察

吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加80%甲醇稀釋為5-500 μg·L-1的梯度溶液。以待測(cè)物的峰面積對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度做線性回歸分析，計(jì)算各相關(guān)系數(shù)，結(jié)果均大于0.998，表明8 種標(biāo)準(zhǔn)品在該范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N ≥10）為定量限（LOQ），信噪比（S/N ≥ 3）為檢測(cè)限（LOD）（表5）。

表5 八種成分的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限（n=6）。

2.4.7 精密度試驗(yàn)

吸取適量混合對(duì)照品溶液，一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。經(jīng)計(jì)算，蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸的RSD 值分別為0.86%、0.96%、1.14%、0.81%、0.85%、1.07%、1.24%和0.98%，表明儀器精密度良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取上述純化后的凍干粉共6份，制備樣品溶液，按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄各個(gè)化合物的峰面積。經(jīng)計(jì)算，蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸的RSD 值分別為0.8%、1.2%、1.0%、1.5%、1.2%、2.2%、2.2%、2.6%，表明儀器重復(fù)性良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將上述樣品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8、10 和12 h，進(jìn)樣測(cè)定，記錄各個(gè)化合物峰面積。經(jīng)計(jì)算，蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸的RSD 值分別為1.3%、0.3%、0.7%、1.0%、2.0%、1.3%、2.5%、2.0%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.10 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取8 份已知含量的純化后凍干粉樣品，每份約0.05 g，然后分別加入相當(dāng)于樣品中各標(biāo)準(zhǔn)品量80%、100%和120%的對(duì)照品，每個(gè)水平平行三次，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸的平均加標(biāo)回收率分別為101.68%、99.67%、101.34%、100.51%、98.94%、97.67%、96.51% 和99.63%，其 RSD 值 分 別 為 0.89%、2.23%、0.97%、1.26%、1.41%、1.12%、1.27%和 0.89%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.11 含量測(cè)定

稱取適量純化前后的神農(nóng)香菊莖葉提取物，按照上述檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量（表6）。選取綠原酸與蒙花苷為《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版“菊花”和“野菊”項(xiàng)下規(guī)定的檢測(cè)指標(biāo)，其他檢測(cè)成分為目前神農(nóng)香菊與野菊相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的主要成分[11]。為確定8 種物質(zhì)在神農(nóng)香菊提取物中的存在確定性與含量，因此采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)成分進(jìn)行定性定量分析。與純化前相比，純化后提取物中蘆丁、芹菜素、去甲漢黃芩素、蒙花苷、槲皮素、木犀草素、3-羥基黃酮和綠原酸等8種物質(zhì)的含量都顯著增加，這可能表明大孔樹(shù)脂的應(yīng)用有利于黃酮類和酚類物質(zhì)的富集，因此導(dǎo)致純化后提取物中總黃酮和總酚含量增加。

表6 純化前后神農(nóng)香菊莖葉提取物中8種成分的含量（n=3）。

2.5 DPPH自由基清除試驗(yàn)

本文采用DPPH 自由基清除方法評(píng)價(jià)了神農(nóng)香菊莖葉提取物的抗氧化能力，以BHT 為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)槠渥鳛橐环N最常用的抗氧化劑，普遍應(yīng)用于食品、化妝品和藥品中。根據(jù)Andrade 等[12]描述的方法，稱取適量純化后的樣品粉末，用無(wú)水乙醇溶解并稀釋成一系列濃度為0.02-0.4 mg·mL-1的樣品溶液。然后取1 mL 樣品溶液與3 mL DPPH 乙醇溶液（0.2 mM）渦旋混勻，置25°C 黑暗環(huán)境下反應(yīng)30 min，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)量吸光度。DPPH自由基清除率（SR）計(jì)算為：

其中，A1為 DPPH 的吸光度，A2為 DPPH 與樣品溶液的吸光度，A3為樣品溶液的吸光度。半數(shù)抑制率（IC50）根據(jù)DPPH 自由基清除率對(duì)樣品濃度的曲線計(jì)算。每份試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。

如圖 5 所示，當(dāng)樣品濃度為 0.2 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基清除率已達(dá)到88.26%，表明神農(nóng)香菊莖葉提取物對(duì)DPPH 自由基具有較好的清除活性。經(jīng)計(jì)算，神農(nóng)香菊莖葉提取物和BHT的IC50分別為0.086 mg·mL-1和0.056 mg·mL-1，表明BHT 的半數(shù)清除活性更低。然而，可以觀察到當(dāng)濃度大于0.15 mg·mL-1時(shí)，在相同濃度下，神農(nóng)香菊莖葉提取物的DPPH 自由基清除率相比BHT 而言更大。總的來(lái)說(shuō)，神農(nóng)香菊莖葉提取物具有良好的抗氧化效果，可以作為天然抗氧化劑的潛在來(lái)源。

圖5 0.02-0.4 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)的DPPH自由基清除率圖

2.6 分子對(duì)接

據(jù)報(bào)道，木犀草素、槲皮素和芹菜素等黃酮類化合物可以作為一種潛在的黃嘌呤氧化酶抑制劑，對(duì)體內(nèi)黃嘌呤氧化過(guò)程中超氧陰離子(O2-)或過(guò)氧化氫的產(chǎn)生具有較強(qiáng)抑制作用[13-15]。因此，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步探索了神農(nóng)香菊莖葉提取物中去甲漢黃芩素和3-羥基黃酮的體內(nèi)抗氧化潛力。配體的SDF 結(jié)構(gòu)文件來(lái)源于PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)，黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自于RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB ID:3ETR）。通過(guò)去除所有水分子，加入氫原子以及計(jì)算Gasteiger 電荷制備了受體蛋白的坐標(biāo)文件。隨后，使用AutoDock 4.2進(jìn)行了分子對(duì)接，網(wǎng)格尺寸設(shè)置為 126 ? × 126 ? ×126 ?，網(wǎng)格間距設(shè)置為0.375 ?。對(duì)接計(jì)算采用拉馬克遺傳算法（LGA）作為搜索參數(shù)，其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值?；谀芰康脑u(píng)分函數(shù)包括了范德華力、靜電相互作用、氫鍵和熵效應(yīng)，以結(jié)合能最低的構(gòu)象表示小分子配體-蛋白最可能的結(jié)合模式。

如圖6A所示，去甲漢黃芩素的A環(huán)羥基上氧原子分別與黃嘌呤氧化酶中纈氨酸（VAL259）、甘氨酸（GLY260）、天冬酰胺（ASN261）、蘇氨酸（THR262）和谷氨酸（GLU263）殘基上的氫原子形成了氫鍵相互作用，其結(jié)合能為-8.7 kcal·mol-1。如圖6B 所示，3-羥基黃酮C環(huán)羥基上氧原子分別與黃嘌呤氧化酶中絲氨酸（SER347）和甘氨酸（GLY350）殘基上的氫原子形成了氫鍵相互作用，其結(jié)合能為-8.4 kcal·mol-1。兩種分子的結(jié)合位點(diǎn)主要位于FAD 域周圍，這與槲皮素和黃嘌呤氧化酶結(jié)合的活性位點(diǎn)相似，表明去甲漢黃芩素和3-羥基黃酮與黃嘌呤氧化酶具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[12]。

圖6 分子對(duì)接示意圖

3 討論

首先考察了料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間對(duì)總黃酮和總酚提取率的綜合影響，篩選出最佳提取工藝。然后，為了進(jìn)一步提高提取物中總黃酮和總酚的含量，對(duì)純化工藝進(jìn)行了篩選。大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)因其成本低、安全性好、易于回收和環(huán)境污染小等特點(diǎn)，被選擇用于黃酮和酚類物質(zhì)的分離純化[16]。與純化前相比，純化后的提取物中總黃酮和總酚純度分別為提高了2.85 倍和4.03 倍。通過(guò)UPLC-MS/MS 分析表明，芹菜素、去甲漢黃芩素、槲皮素、木犀草素和綠原酸等的含量顯著增加。因此，本研究篩選的純化工藝可應(yīng)用于改善神農(nóng)香菊莖葉總黃酮和總酚的純度。

與常用抗氧化劑BHT 相比，神農(nóng)香菊莖葉提取物具有較強(qiáng)的自由基清除活性，這可能與其中的黃酮和酚酸類化合物有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，黃嘌呤氧化酶是人體氧源自由基的重要生物學(xué)來(lái)源，它參與了許多對(duì)組織氧化損傷的過(guò)程，包括炎癥、衰老和痛風(fēng)等，而黃酮類化合物可以作為黃嘌呤氧化酶的一種潛在抑制劑，發(fā)揮抗氧化作用。分子對(duì)接作為一種常用的輔助工具，被使用進(jìn)一步探索神農(nóng)香菊莖葉中黃酮分子與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合機(jī)制?？傊?，本研究為神農(nóng)香菊莖葉資源的可回收利用提供了一種有前景的策略。