菊花腦芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆與原核表達分析＊

蔣莉萍，周春苗，鐘浩天，張景景，劉義飛，劉 迪

（湖北中醫(yī)藥大學藥學院 武漢 430065）

菊花腦（Chrysanthemum nankingenseHand.-Mazz.）是菊科菊屬野菊（C.indicumL.）的近緣植物，主要分布在江蘇及其鄰省，例如湖南省、貴州省等，在湖北一些地方已成功進行了引種栽培，生態(tài)適應性較強。藥理研究表明，菊花腦具有清熱降火、解毒和降血壓等功效[9-10]，并且對具有抑菌作用，廣泛作為藥食兩用的原料，在高端市場深受歡迎，具有一定的經(jīng)濟價值。菊花腦揮發(fā)油中含有豐富的萜類成分，主要成分為單萜、倍半萜及其含氧衍生物，芳樟醇是菊花腦的關鍵特征香氣物質(zhì)之一[11-12]。研究表明，芳樟醇是一種天然的抗炎劑，在殺菌抗炎等方面起重要作用[13-14]。

目前，萜類合成途徑已基本被闡明，主要由三個階段組成：①前體物質(zhì)的生成；②直接前體的形成；③萜類化合物的生成和后修飾[15-17]。在植物體中主要有位于質(zhì)體的甲基赤蘚醇磷酸鹽途徑（Methylerythritol phosphate pathway，MEP）和位于細胞質(zhì)的甲羥戊酸（Mevalonate pathway，MVA）途徑[15,18]。萜類合酶是催化直接前體香葉基焦磷酸（Geranyl pyrophoaphate,GPP）形成芳樟醇、香葉醇和月桂烯等單萜類物質(zhì)的關鍵限速酶[19]。之前研究表明，萜類合酶具有復雜多樣性，其主要表現(xiàn)在：①同一萜類合酶可催化不同的直接前體，如獼猴桃的AcNES1 可催化兩種直接前體GPP 和FPP（法尼基焦磷酸，F(xiàn)arnesyl diphosphate），分別產(chǎn)生芳樟醇和橙花叔醇[20]；②不同的萜類合酶可催化同一直接前體產(chǎn)生不同的化合物，如杜鵑的RoTPS059和RoTPS065可催化GPP生成多種單萜類物質(zhì)（芳樟醇、L-α-松油醇、3-蒈烯和β-月桂烯等）[21]；③在同一物種中，不同酶可催化同一底物形成相同產(chǎn)物，如金魚草花中AmNES/LIS-1 和AmNES/LIS-2 等2個萜烯合酶均可催化GPP 產(chǎn)生芳樟醇，催化FPP 形成橙花醇[22]。本文在菊花腦基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)基礎上[23]，首次從菊花腦中克隆和鑒定出一個芳樟醇合酶基因，對其進行生物信息學分析，展示其在不同組織表達的特異性，并在大腸桿菌中進行原核表達，以期為解析菊花腦中萜烯類物質(zhì)的生物合成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗樣品采自湖北中醫(yī)藥大學野菊種質(zhì)資源保存圃，經(jīng)植物標本比對鑒定為菊花腦。2020 年6 月選取10個單株進行扦插繁殖，11月末待其盛花期取舌狀花、管狀花、根、莖和葉五個不同的組織進行后續(xù)分析，生物學重復為每個部位3 個單株重復。所有樣品采集時間集中在上午9 點至11 點完成，樣品經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

TransStart? FastPfuDNA Polymeras 試 劑 盒 、pEASY?-Blunt 克隆載體和Trans1-T1 大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金生物科技有限公司。OMEGA 瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒購于北京諾博萊科技有限公司。EcoR I 內(nèi)切酶、Hind Ⅲ內(nèi)切酶、ABclone MultiF Seamless Assembly Mix購于愛博泰克生物有限公司，IPTG 粉末、卡那霉素、LB 粉末購自索萊寶生物科技有限公司。植物總RNA提取試劑盒購于百泰克（北京）有限公司。PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)和 PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047A）購于寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌BL21 和DH5α 感受態(tài)細胞購于上海唯地生物技術有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

按照百泰克多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒（RP3202）操作說明提取菊花腦根、莖、葉、舌狀花、管狀花中總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。超微量分光光度計（Nano drop-2000）測定菊花腦總RNA A260nm/A280nm 等參數(shù)指標，采用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA，6210A)和PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TAKARA，RR047A）進行反轉(zhuǎn)錄合成兩種cDNA 分別用于目的片段的克隆和實時定量PCR，置于-20℃長期保存。

1.4 CnTPS1基因cDNA的克隆

根據(jù)菊花腦基因組數(shù)據(jù)篩選到CnTPS1基因的CDS 序列，運用Snapgene 軟件設計包含完整開放閱讀框 的 正 反 引 物 。 上 游 引 物CnTPS1-F：5’-ATGGCATCAATAAGCTTATTTCCA-3’；下 游 引 物 ：CnTPS1-R：5’-TTATATCCCTTGGATAGGAGTGAAC-3’。 以 菊 花 腦 的 cDNA 為 模 板 ，采 用 全 式 金TransStart?FastPfuDNA Polymeras 試劑盒進行 PCR 擴增（AP221），PCR 反應體系 50μL：cDNA 1μL，引物CnTPS1-F 1μL，引物CnTPS1-R 1μL，5 ×TransStart?FastPfuBuffer 10μL，dNTPs 4μL，TransStart? FastPfuDNA Polymeras 1μL，ddH2O 32μL。PCR 反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸 1 min，40 個循環(huán)；72℃ 5 min 結(jié)束反應，保存于12℃。

1.5 PCR產(chǎn)物純化及克隆測序

PCR 擴增產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳富集至同一位置，確定目的片段大小，沿著目的片段的熒光切膠，目的片段膠用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根DP209）溶解 、純 化 ，用pEASY?-Blunt Cloning Kit（Transgen,CB101）試劑盒與Blunt 載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸感覺DH5α 感受態(tài)細胞，涂布在含有卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)皿的平板，12h后挑取單克隆進行PCR 驗證，陽性克隆菌液送至生工生物工程有限公司（武漢）完成測序。

1.6 生物信息學分析

利 用 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件查找CnTPS1基因完整的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）；利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線工具 BLASTP 對CnTPS1基因氨基酸序列進行相似性比對，BLASTX 對CnTPS1基因堿基序列進行同源比對；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）在線工具預測CnTPS1氨基酸序列的理化特性；利用 SPOMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）對CnTPS1 氨基酸序列二級結(jié)構進行分析；利用Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/）對CnTPS1 氨基酸序列進行蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構預測分析。利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析CnTPS1 氨基酸序列保守結(jié)構域；利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測 CnTPS1氨基酸序列的跨膜結(jié)構域；借助PSORT II Prediction（https://psort.hgc.jp/form2.html）進行亞細胞定位預測。不同植物TPS基因氨基酸序列比對采用ClustalW 軟件，MEGAX 軟件同于鄰接（neighbor-joining）系統(tǒng)進化樹構建，重復比對次數(shù)（bootstrap）為1000次。

實施黨員“三評議”寫實考核加強房地產(chǎn)企業(yè)黨員的教育管理………………………………………………………………于 峰（10.48）

1.7 實時熒光定量PCR

選用 TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus，TaKaRa）試劑盒，利用 Roche Light Cycler 480 熒光定量PCR 儀對菊花腦5 個組織中CnTPS1轉(zhuǎn)錄的mRNA 豐度進行定量檢測。不同組織CnTPS1轉(zhuǎn)錄的mRNA 拷貝數(shù)據(jù)使用菊花腦內(nèi)參基因Actin進行校正，上游引物Actin-F：5'-AGCCGTTCTTTCCCTGTATG-3'，下游引物Actin-R：5'-GAATACCCACGCTCTGTAAGG-3'[24]。應用Snapgene 軟件設計菊花腦CnTPS1基因熒光定量短片段（250 bp）正反引物，上游引物qCnTPS1-F：5'-GCTGAGTTTCATGTAAGGCG-3'，下 游 引 物qCnTPS1-R：5'- GATTTTCGTATCATTGTCTTCACTG-3'。采用 20μL 的反應體系，其中 cDNA 模板 2μL、上下游引物各0.8μL，2 × TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10μL，RNasefree H2O 6.4μL。反應程序：預變性95℃、30 s；定量分析95℃、5 s，60℃、30 s，共40 個循環(huán)；溶解曲線95℃、5 s，60℃、1 min，95℃（模式Continuous）；降溫60℃、30 s。每個組織三個生物學重復及三次機械重復。根據(jù)溶解曲線的峰圖特征判斷產(chǎn)物是否特異；依據(jù)定量擴增曲線的 Ct 值，用 2-ΔΔCt公式計算CnTPS1基因在不同組織的基因表達量。

1.8 CnTPS1原核表達載體構建與誘導表達

對CnTPS1核苷酸序列酶切位點進行分析，設計帶有酶切位點的同源臂正反引物。根據(jù)原核表達載體pET-28a上的EcoRI和HindⅢ酶切位點，利用PrimerPremier5軟件設計同源重組引物，上游同源臂引物EcoRI-CnTPS1-F：5’-GCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGCATCAATAAG CTTATTTCCA-3’；下游同源臂引物HindⅢ-CnTPS1-R：5’AAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTATATCCCTTG GATAGGAGTGAAC-3’。使用高保真Mix 擴增兩端含有同源臂的全長序列，PCR 產(chǎn)物溶解回收，同時EcoRI和HindⅢ雙酶切pET-28a 原核空載體。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，切膠，回收目的條帶，并用ABclone MultiF Seamless Assembly Mix 連接目的條帶和線性載體，構建重組載體質(zhì)粒。

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核誘導感受態(tài)細胞BL21（DE3），涂布在含有卡那霉素的LB 培養(yǎng)基平板上，37℃過夜培養(yǎng)至長出單菌落，挑取單克隆進行PCR驗證，陽性克隆于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至OD 值為0.5-0.6（取1 mL 菌液8000 rpm 離心5 min，收集菌體，棄上清，向沉淀中加入250μL Tris-HCl 裂解液，保存于4℃，用于后續(xù)跑膠），加入IPTG 至終濃度為0.1mM，16℃誘導培養(yǎng)20h，以同樣條件處理pET-28a 空載作為空白對照。取4 m L 菌液，8000 rpm離心5 min，收集菌體，棄上清，向沉淀中加入1mLTris-HCl 裂解液，用超聲細胞破碎儀（寧波新芝，JY96-IIN）超聲10 min，破碎菌體，取500μL 破碎菌體保存于4℃，用于后續(xù)跑膠；在4℃的條件下，剩余500μL 破碎菌體于 8000 rpm 離心 5 min，吸取上清，向沉淀加入 500μL Tris-HCl 裂解液，重懸。分別取 40μL 空載、未誘導、誘導后粗酶、上清和沉淀，加入10μL 上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，上樣后進行12%SDSPAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CnTPS1的克隆

根據(jù)菊花腦基因組信息，以菊花腦葉片提取的總RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，PCR 擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳顯示得到了清晰的特異條帶，條帶長度大小與預期相符合（圖1），并將其重組載入Blunt 載體中，測序結(jié)果用CodonCode Aligner 軟件拼接測序結(jié)果的峰圖，得到1749 bp 的cDNA 序列，命名為CnTPS1（NCBI 登錄號為 OM621911），經(jīng) ORF Finder 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)其為一個完整的開放閱讀框，共編碼582 個氨基酸。

將菊花腦CnTPS1編碼的氨基酸序列提交到NCBI網(wǎng)站應用BLASTP 進行序列比對，比對結(jié)果顯示CnTPS1 氨基酸序列與UniProtKB/Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫中已功能驗證的植物TPS 氨基酸序列有較高的同源性，其中CnTPS1與青蒿（Artemisia annua）兩個芳樟醇基因編碼的氨基酸序列相似度最高（與Q9SPN1.1相似度為91%，與Q9SPN0.1 相似度為89.88%）；利用MEGAX 比對CnTPS1 與序列相似性前五的其他植物TPS基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)均含有萜類合酶保守結(jié)構域DDxxD、R(R)X8W和NSE/DTE（圖2）。

圖2 CnTPS1與其它植物萜烯合酶的多序列比對

2.2 生物信息學分析

利用在線軟件ExPASy 對CnTPS1基因編碼的氨基酸序列進行基本理化特性分析。結(jié)果表明，CnTPS1編碼582個氨基酸；等電點pI值為5.72（＜7），屬于酸性蛋白；疏水性為-0.247（＜0），屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為35.54（＜40），屬于穩(wěn)定蛋白；編碼的蛋白由20種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）和絲氨酸（Ser）所占比例最多，分別占11.8%和8.1%。

NCBI 的Conserved domains 在線工具分析表明，CnTPS1編碼的蛋白質(zhì)具有Terpene_cyclase_plant_C1活性位點，屬于Isoprenoid_Biosyn_C1 超家族（圖3A）。利用TMHMM2.0 在線工具預測CnTPS1 是否具有跨膜結(jié)構域（圖3C），結(jié)果顯示，CnTPS1 氨基酸中無跨膜結(jié)構存在，為膜外蛋白。通過在線程序PSORT II Prediction 對CnTPS1 蛋白進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示CnTPS1 在細胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體中定位的概率分別為60.9%、17.4%和21.8%，因此，該蛋白可能是位于細胞質(zhì)中。

圖3 CnTPS1的生物信息學分析

利用在線生物學工具SOPMA 預測菊花腦CnTPS1氨基酸序列的二級結(jié)構（圖3B）。結(jié)果顯示，該蛋白的二級結(jié)構主要由α-螺旋結(jié)構（alpha helix）和無規(guī)則卷曲（random coil）組成，占 93.49%，其次是延伸鏈（extended strand）和 β-轉(zhuǎn)角（beta turn），分別占比3.60% 和2.92%（表1）。利用在線服務器SWISSMODEL對菊花腦CnTPS1蛋白進行三維空間結(jié)構同源建模，匹配最佳三維空間模型（圖3D），其蛋白的折疊情況與二維結(jié)構相似。經(jīng)在線軟件ExPAsy structure assessment 推導，CnTPS1 蛋白最佳模型為 3n0f.1.A，得分為0.73，蛋白序列的相似性為43.58%。

表1 CnTPS1蛋白二級結(jié)構預測

為分析CnTPS1 與其他物種萜烯合酶間的親緣關系，通過MEGAX 等軟件對CnTPS1 進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。結(jié)果表明（圖4），CnTPS1 與青蒿、薄荷、薰衣草及番茄等物種中的芳樟醇合酶基因聚為同一簇，其中與青蒿的親緣關系最近，與其他倍半萜和二萜合酶基因的遺傳距離較遠，推測其可能為一個芳樟醇合酶。

圖4 CnTPS1與其他物種萜烯合酶系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

2.3 組織表達特性分析

利用qRT-PCR技術分析CnTPS1在菊花腦盛花期各組織中的相對表達量。結(jié)果表明CnTPS1基因在菊花腦各個組織部位均有表達，在莖和管狀花中的表達量顯著高于根、舌狀花和葉（圖5）。CnTPS1基因的相對表達量為：莖＞管狀花＞根＞舌狀花＞葉，與轉(zhuǎn)錄組基因表達量大體趨勢一致。由此可以看出CnTPS1基因在不同組織中表達量存在顯著差異，揭示其所催化的萜類物質(zhì)的生成和積累可能同樣具有組織特異性。

圖5 不同組織中CnTPS1基因表達水平

2.4 CnTPS1原核表達載體構建及誘導表達分析

將構建好的原核表達重組載體質(zhì)粒pET-28a-CnTPS1經(jīng)液氮轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞內(nèi)，挑取若干單菌落，進行菌液PCR 驗證，鑒定結(jié)果為陽性，表明目的基因CnTPS1成功插入到表達載體中，并轉(zhuǎn)化至表達感受態(tài)細胞。重組載體質(zhì)粒菌株表達產(chǎn)物進行12% SDS-PAGE 蛋白電泳驗證。電泳膠圖顯示（圖6），含有CnTPS1 重組蛋白的全菌及沉淀在67.58 kDa 處出現(xiàn)明顯的特異蛋白條帶，符合預期。CnTPS1蛋白在沉淀中表達量較高，但在上清中表達量較小，說明蛋白表達形式傾向于包涵體，不適合進一步純化分析，適合用總蛋白和底物反應，測定酶活。

圖6 CnTPS1重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖

3 討論

菊花腦屬于菊科菊屬野菊近緣植物，野菊倍性復雜（例如二倍體、四倍體、六倍體野菊等），故菊花腦可以作為模式植物開展野菊的相關研究。菊科植物具有特殊的香氣，這些香氣成分以萜烯為主[25-28]。萜烯是植物體內(nèi)中種類最多、分布最為廣泛的次生代謝產(chǎn)物,是植物與植物間、植物與昆蟲間的信號素[29-31]。萜類合酶的種類和數(shù)量是萜烯豐富多樣的原因，因而挖掘和分析萜類合酶基因?qū)ρ芯恐参镙葡╊惔x產(chǎn)物的多樣化具有重要意義。

萜類合酶可以分為TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g、TPS-h 等七個亞家族，其中 TPS-a 主要是倍半萜合酶基因，TPS-b 主要是單萜合酶基因[32]。單萜合酶主要定位于質(zhì)體，倍半萜合酶主要定位于細胞質(zhì)[33]。本研究克隆了一個菊花腦TPS 基因CnTPS1，得到了編碼582 個氨基酸全長1749bp 的cDNA 序列。通過NCBI BlastP，發(fā)現(xiàn)鑒定的CnTPS1基因與青蒿的兩個芳樟醇合酶基因具有高度的同源性，序列相似性均大于90%，推測該基因為芳樟醇合酶。與序列相似度較高的其它物種的萜類合酶序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因具有萜類合酶的保守結(jié)構域：DDxxD、R(R)X8W 和NSE/DTE。

萜類化合物的結(jié)構復雜性和多樣性主要來自萜烯合酶（TPS）催化前體（C5異戊二烯）的環(huán)化模式。根據(jù)線性前體底物的環(huán)化的啟動方式，TPS 可以分為兩類（I 和II）。 I 類TPS 是金屬依賴性酶，其通過對碳結(jié)構發(fā)電的二磷酸酯來引發(fā)線性異戊二烯二磷酸的環(huán)化，而II類TPS在異戊二烯底物的C=C鍵或環(huán)氧化物的質(zhì)子化引發(fā)催化[34]。在結(jié)構上，富含天冬氨酸的DDxxD 基序和 NSE/DTE 基序通常存在于 I 類 TPS 中，而一般酸基序DxDD 是II 類TPS 的標志[35]。菊花腦CnTPS1基因?qū)儆?I 類 TPS，理論上可以催化 GPP 和FPP 形成萜類化合物。亞細胞定位預測分析顯示CnTPS1基因定位在細胞質(zhì)中的可能性最大，這與番茄、薰衣草、茶樹和青蒿等芳樟醇合酶在細胞中的定位結(jié)果一致[36-39]。

CnTPS1基因在舌狀花、管狀花、葉、莖和根中都有表達，但是存在組織特異性，以莖和管狀花中表達最多。這可能與芳樟醇防御病蟲害以及在管狀花中揮發(fā)油的成分有關。該基因在原核表達體系，經(jīng)過IPTG 16h 的誘導能夠在總蛋白中誘導得到目標大小的蛋白，符合前期對CnTPS1基因生物信息學的相關分析。預測該基因可以與GPP 或FPP 底物結(jié)合產(chǎn)生以芳樟醇為主產(chǎn)物，其它單萜和/或倍半萜為次產(chǎn)物的混合產(chǎn)物。青蒿（Artemisia annuaL.）三個TPS-b 分支基因AaLS(QH1和QH5)和AaBPS之前被證明編碼單萜合成酶，分別催化GPP 形成(3R)-芳樟醇和β-蒎烯[38,40]。合歡（Albizia julibrissin）的AjTPS10基因被驗證是芳樟醇合酶，只能形成單產(chǎn)物芳樟醇[41]。到手香（Plectranthus amboinicus）中克隆到一個萜類合酶PamTps1，體內(nèi)外功能研究均表明其形成芳樟醇[42]。Yu 等基于鐵皮石斛（Dendrobium officinale）全基因組鑒定TPS 基因家族及表達譜，并克隆和分析了DoTPS10基因的功能，該基因定位在葉綠體中，重組DoTPS10蛋白在體外能特異將香葉酰二磷酸轉(zhuǎn)化為芳樟醇[43]。本研究基于菊花腦全基因組數(shù)據(jù)，克隆到一個TPS基因，通過生物信息學分析，預測該基因編碼的蛋白的生理生化特性以及二級、三級結(jié)構等，并檢測該基因在各組織特異的表達模式，利用原核系統(tǒng)成功誘導出67.58 kDa大小的蛋白；通過與其它已驗證功能的萜類合酶基因進行比較推測，預測該基因可能催化單萜或倍半萜合酶的底物(GPP/FPP)產(chǎn)生萜烯類化合物。后期本研究將從全基因組水平，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組、代謝組和功能基因組學等多組學手段，系統(tǒng)地挖掘菊花腦萜類合酶（TPS）基因家族，為深入解析菊花腦萜類物質(zhì)的生物合成途徑與代謝調(diào)控的分子機制提供理論依據(jù)。