基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松的機制及實驗驗證＊

孟 慧 ，于明薇 ，陳宇晗 ，馬云飛 ，王笑民

（1. 北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京 100029；2. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010）

1 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約70%呈激素受體陽性表現(xiàn)，其中60%以上為65 歲及以上患者[1]。內分泌治療是激素受體陽性乳腺癌患者的一線治療，絕經(jīng)后乳腺癌患者接受內分泌治療能夠顯著降低疾病的復發(fā)和轉移，然而體內雌激素水平明顯下降，出現(xiàn)骨量減少、骨微結構改變[2-3]，導致骨脆性增加，骨質破壞，臨床可表現(xiàn)為骨痛、關節(jié)痛，嚴重者出現(xiàn)骨質疏松，甚至骨折，嚴重影響患者的生活質量，降低治療依從性，影響乳腺癌的預后。目前針對絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松尚無統(tǒng)一治療方案，臨床多以雙膦酸鹽、鈣劑等為主要治療方法[4-5]，但療效尚不確切。

在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中，絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松屬于“骨痿”“骨枯”的范疇，肝腎虧虛，經(jīng)絡瘀阻是其主要病機，故多從腎肝論治。益腎健骨方是王笑民教授從肝腎論治絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松癥的常用方劑，取得了良好的療效，臨床研究證實，益腎健骨方可以減輕絕經(jīng)后乳腺癌患者的骨關節(jié)痛，提高患者的骨鈣素水平，增加骨轉換，改善骨質疏松[6-7]。由于益腎健骨方藥物組成多，成分復雜，治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松的機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學[8]是通過生物網(wǎng)絡平衡的辦法構建疾病-成分-靶點網(wǎng)絡，預測中藥治療作用靶點[9]，探索藥物作用機制。

據(jù)此，本文擬通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接方法探討益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松的作用機制，以期為后期研究提供理論基礎支持。

2 研究思路與方法

本文通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選益腎健骨方中藥物活性成分及靶點，TTD、Drugbank、DisGenet 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點，取交集后獲得益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質疏松癥的靶點，通過Cytoscape 構建中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖和蛋白相互作用圖，并對作用靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集，根據(jù)富集分析的結果進行實驗驗證。研究流程圖如圖1所示。

圖1 研究流程圖

3 材料與方法

3.1 益腎健骨方的中藥成分與靶點的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）[10]檢索熟地黃、山茱萸、菟絲子、川牛膝、香附、當歸、茯苓、白芍、川芎、延胡索、絡石藤、透骨草十二味中藥并獲取成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為條件進行篩選，得到益腎健骨方活性成分集合。通過有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲得藥物活性成分的靶點，去除重復靶點基因即得到益腎健骨方活性成分的靶點。

3.2 骨質疏松疾病基因獲取

以“breast cancer”“postmenopausal osteoporosis”為關鍵詞，從藥物靶標數(shù)據(jù)庫（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/），藥 物 數(shù) 據(jù) 庫（DrugBank，https://go. drugbank.com/），疾病相關的基因與突變位點數(shù)據(jù)庫（DisGenet，https://www.disgenet.org/）中獲得絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松相關靶點171個。

3.3 核心靶點篩選和中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建

利用Venn diagram 在線繪圖工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）將益腎健骨方活性成分靶點與絕經(jīng)后乳腺癌骨質疏松靶點繪制Venny 圖，交集靶點即為益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質疏松的核心靶點。利用Cystoscape 3.7.2構建益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質疏松中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡圖。

3.4 蛋白質相互作用網(wǎng)絡的構建和分析

將藥物治療絕經(jīng)后骨質疏松的交集靶點蛋白導入SRTING 數(shù)據(jù)庫，研究生物選擇“Homo sapiens”，隱藏孤立蛋白，導出tsv 文件，運用Cytoscape3.7.2 繪制PPI網(wǎng)絡圖并進行拓撲學分析，獲得核心蛋白。

3.5 GO生物過程富集分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape 在線作圖進行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析。選取P值前20 條繪圖。利用Cytoscape3.7.2 構建靶點-通路圖，直觀闡釋益腎健骨方治療芳香化酶抑制劑相關骨質疏松的靶點和信號通路。

3.6 分子對接

將疾病-成分-靶點網(wǎng)絡中拓撲分析結果按照Degree 值排序，取排名前5 的化合物進行分子對接。排名前5 位靶點蛋白與PPI 網(wǎng)絡中Degree 排名前5 的靶點蛋白取交集，得到2 個核心靶點。通過KEGG 通路富集結果，得到通路關鍵靶點。通過蛋白結構數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank）獲得核心靶點和關鍵靶點的3D結構，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得活性成分3D 結構，通過DockThor數(shù)據(jù)庫（https://dockthor.lncc.br/v2/）進行分子對接。

3.7 實驗驗證

3.7.1 藥物及試劑

益腎健骨方（含生藥熟地黃20 g，酒萸肉15 g，菟絲子10 g，川牛膝15 g，香附10 g，當歸10 g，茯苓15 g，白芍15 g，川芎10 g，延胡索15 g，透骨草15 g，絡石藤20 g）購自北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院顆粒藥房，由專業(yè)人員質檢確保藥品質量。阿那曲唑片（阿斯利康，批號：J20150021）、阿侖膦酸鈉片（默沙東，批號：J20130085）由本院藥房提供。多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：1605162），pi3k 一抗（批號CST4263），akt 一抗（批號 CST9272），β-actin 兔抗（CST3700）。

3.7.2 實驗動物

9月齡SD雌性大鼠15只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，隨機分為假手術組、去勢組、西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組3只。

3.7.3 造模及給藥

大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)一周后，其中12只做雙側卵巢摘除，正常組僅摘除卵巢周圍等質量的脂肪組織。術后一周灌胃給藥，中藥組以阿那曲唑片和益腎健骨方灌胃，給藥劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進行換算，低劑量組為2 g/kg/天，高劑量組為8 g/kg/天，阿那曲唑片0.1 mg/kg/天，阿侖膦酸鈉片1 mg/kg/天。連續(xù)給藥12 周后處死大鼠，取股骨做HE 染色，Masson 染色觀察骨微結構并比較各組膠原容積比，Western blot法檢測大鼠骨組織pi3k蛋白相對表達。

3.7.4 統(tǒng)計學分析

4 結果

4.1 益腎健骨方中藥物活性成分與靶點的篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索益腎健骨方中12 味中藥，共得到141種藥代動力學特征較好的活性成分，其中白芍10種，川牛膝4種，川芎6種，當歸2種，茯苓15種，絡石藤9 種，山茱萸19 種，熟地黃2 種，透骨草4種，菟絲子11種，香附16種，延胡索43種，去除重復活性成分，共113 種，部分有效成分見表1。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得活性成分化合物的SMILE 結構，提交Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，獲得對應靶點的Gene Symbol。所有活性成分共得到靶點基因1186 個。通過TTD 數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫、DisGenet 數(shù)據(jù)庫獲得疾病相關靶點171 個，與中藥復方靶點取交集即得到益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質疏松的潛在靶點，共43個（圖2）。

圖2 藥物-疾病靶點基因圖

表1 益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質疏松的藥物活性成分信息

4.2 網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape3.7.2 軟件對益腎健骨方治療絕經(jīng)后骨質疏松的靶點進行網(wǎng)絡可視化構建，結果見圖3。綠色菱形代表靶點，藍色方形代表中藥，六邊形為益腎健骨方的不同活性成分，其中黃色六邊形為12味中藥共有的9 種活性成分。節(jié)點的大小根據(jù)自由度確定，其中Degree 值排名前5 個的靶點是CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1，其Degree 值分別為91、71、68、67、65。活性成分對照信息見表2。

表2 益腎健骨方活性成分對照表

圖3 疾病-中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡圖

4.3 蛋白質相互作用關系

將篩選出的益腎健骨方治療芳香化酶抑制劑相關骨質疏松的43個靶點利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape3.7.2 對PPI 網(wǎng)絡進行可視化，隱藏孤立靶點，網(wǎng)絡圖中包含38 個節(jié)點，200 條邊，節(jié)點代表不同的基因蛋白，邊代表其相連接的蛋白有相互作用的關系。節(jié)點的大小和顏色按照Degree 值大小確定。按照Degree 值，排名前5 位的基因蛋白為別為ESR、ALB、IL6、SRC、CTNNB1（圖4）。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

4.4 GO和KEGG富集分析結果

GO 富集分析共得到GO 條目（P＜0.05）1048 個，其中生物學過程（Biological process）923 個，分子功能（Molecular function）78 個 ，細 胞 成 分（Molecular function）47 個。通過KEGG 通路分析，得到KEGG（P＜0.05）條目84 個，涉及腫瘤通路、人乳頭瘤病毒感染等相關通路（圖5-圖6）。

圖5 GO富集分析結果

圖6 KEGG通路富集分析結果

4.5 KEGG關系網(wǎng)絡的構建

根據(jù)益腎健骨方成分-靶點網(wǎng)絡、蛋白相互作用網(wǎng)絡，將益腎健骨方可能作用到絕經(jīng)后骨質疏松的前20 條KEGG 信號通路及作用靶基因進行分析，通過Cytoscape3.7.2 得到KEGG 網(wǎng)絡圖（圖7），中間黃色節(jié)點代表靶蛋白，周圍紅色節(jié)點代表信號通路，根據(jù)Degree 值大小調節(jié)節(jié)點大小和透明度。如圖所示，益腎健骨方可能通過多個通路、多靶點共同起效治療絕經(jīng)后乳腺癌骨質疏松。

圖7 KEGG通路-靶點網(wǎng)絡

4.6 分子對接結果

根據(jù)疾病-成分-靶點網(wǎng)絡中網(wǎng)絡拓撲學分析結果，Degree 值排名前五的化合物為β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚，排名前五的靶點分別為CYP19A1、ESR2、SRC、AR、ESR1，將疾病-成分靶點網(wǎng)絡中Degree 排名前 5 的靶點與 PPI 網(wǎng)絡中Degree 排名前5 的靶點取交集，得到核心靶點2 個，分別為ESR1、SRC。通過KEGG 通路富集，COX2與絕經(jīng)后骨質疏松的關系緊密，在此與核心靶點一起通過分子對接進行驗證（表3）。

表3 Degree前5的化合物與核心靶點和潛在靶點的分子對接信息

通過DockThor數(shù)據(jù)庫（https://dockthor.lncc.br/v2/）進行分子對接，并計算靶點與化合物對接后的結合能。一般認為，配體與受體之間的結合能越低，結合越穩(wěn)定，其發(fā)生作用的可能性就越大，分子對接結果見表2。核心靶點SRC、ESR，潛在靶點COX2 與β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、槲皮苷、山柰酚均能較好結合，對接示意圖見圖8～圖10。

圖8 從上至下依次為SRC與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對接

圖9 從上至下依次為ESR與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對接

圖10 從上至下依次為COX2與β-谷甾醇（A）、豆甾醇（B）、谷甾醇（C）、槲皮苷（D）、山奈酚（E）的分子對接

可以看出核心靶點和潛在靶點與槲皮苷的結合能最低，表明槲皮苷與核心靶點和潛在靶點的結合穩(wěn)定。圖 9 中槲皮苷通過 Gln198、Glu54、Lys44、Asp194形成氫鍵相互作用，結合在SRC的活性口袋。圖10中槲皮苷通過殘基 Glu75、Glu111、Tyr231、Asp232 形成氫鍵相互作用，結合在ESR的活性口袋。圖11中槲皮苷通過殘基His2、Asn7、Gln296 形成氫鍵，與潛在靶點COX2結合。

4.7 骨組織H&E染色及Masson染色結果

大鼠股骨下段H&E染色，正常大鼠股骨骨小梁排列緊密規(guī)則，模型組可見骨小梁稀疏且排列不規(guī)則；中藥高劑量組和中藥低劑量組骨小梁排列致密，可見少量新生骨組織（圖11）。

圖11 術后12周各組大鼠股骨組織切片H&E染色（10×）

對SD 大鼠股骨下段矢狀面進行Masson 染色，骨小梁藍染，骨髓腔呈紅色。光鏡下觀察，正常組骨小梁排列規(guī)則，層次清晰；模型組骨小梁稀疏且排列不規(guī)則；與模型組相比較，中藥低劑量組及中藥高劑量組骨小梁結構完整，膠原層次清晰（圖12-圖13）。

圖12 術后12周各組大鼠股骨組織Masson染色（10×）

圖13 各組大鼠股骨下段膠原容積比

4.8 各組大鼠骨組織pi3k蛋白相對表達

采用Western blot 法檢測各組大鼠股骨組織pi3k蛋白表達，結果顯示，中藥低劑量組pi3k 表達量較模型組顯著降低（P＜0.05），中藥低劑量組p-pi3k 的表達水平顯著低于正常組、陽性對照組、中藥高劑量組（P＜0.05）（圖14、表4）。

表4 各組大鼠骨組織中pi3k和p-pi3k蛋白表達比較（）

表4 各組大鼠骨組織中pi3k和p-pi3k蛋白表達比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，ΔP＜0.05，與陽性對照組比較，▲P＜0.05，與中藥高劑量組比較，**P＜0.05。

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圖14 各組大鼠骨組織pi3k和p-pi3k蛋白表達

4 討論

絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松是絕經(jīng)后激素受體陽性乳腺癌患者服用芳香化酶抑制劑后常見的臨床疾病。絕經(jīng)后女性體內雌激素主要通過芳香化酶從雄激素轉化而來，芳香化酶抑制劑可以選擇性阻斷芳香化酶的作用，降低循環(huán)雌激素水平。雌激素有利于骨細胞的生成，雌激素水平下降，破骨細胞及其前體產(chǎn)生增多，骨吸收增加，骨量減少及骨微結構改變[11]，患者可以有骨痛、關節(jié)痛等表現(xiàn)，雙能X 線吸收測定（DXA）可表現(xiàn)骨密度下降。益腎健骨方以補腎健脾、調肝理氣為法，全方共12 味藥，熟地黃、山茱萸、菟絲子、川牛膝補腎健骨，香附、當歸、白芍調肝理氣，川芎、延胡索、透骨草、絡石藤通絡止痛，茯苓補中有瀉，兼益心脾。

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫對益腎健骨方進行成分-靶點的篩選，以OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，得到113 種藥代動力學較好的活性成分，藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡顯示，延胡索的活性成分最多，其次為山茱萸、茯苓、香附。益腎健骨方中活性成分較好的化合物β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山奈酚等可能 通 過 Pathways in cancer、Human papillomavirus infection、Pi3k-Aktsignaling pathway、Focal adhesion 等通路作用于 ESR1、SRC、ALB、IL-6、PTGS2、CTNNB1等靶點發(fā)揮抗骨質疏松作用。β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇是常見的植物甾醇類成分，植物甾醇具有抗炎[12]、抗腫瘤[13]及免疫調節(jié)[14-15]等功能。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可以改善骨骼脆性[16]，通過刺激OPG mRNA 的表達促進成骨細胞生成，抑制骨吸收[17]。槲皮苷、山柰酚為黃酮類化合物，具有抗氧化[18-19]、抗腫瘤[20-21]的作用，其中槲皮苷是山茱萸、菟絲子、川牛膝、香附、延胡索、透骨草的共有成分。實驗研究發(fā)現(xiàn)，槲皮苷可能通過抑制NFATc1、TRAP 的表達，從而抑制破骨細胞活性及骨吸收[22]，發(fā)揮抗骨質疏松的作用。山柰酚是菟絲子、香附、透骨草、白芍的共有成分，體外研究報道，山柰酚可能通過下調RANKL、c-Fos 及TRAF6 的表達減少破骨細胞的生成[23-24]治療骨質疏松。

由蛋白質相互作用網(wǎng)絡，ESR、IL-6、SRC 等可能是益腎健骨方治療絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松的關鍵靶點。ESR 可以通過多種方式參與骨代謝過程，雌激素與ESR 結合參與成骨細胞的生成與礦化[25]，破骨細胞的增殖與凋亡[26]，雌激素存在條件下，ESR 可以激活 PI3K/AKT/GSK 通路[27]，通過 RANKL/RANK/OPG 途徑調節(jié)破骨細胞的生成和活性[28]，影響骨代謝。IL-6為骨吸收誘導劑，主要作用于破骨細胞，增強破骨細胞活性。有研究報道，去勢大鼠血清中IL-6水平明顯升高[29]，骨密度與 IL-6 呈明顯負相關[30]。SRC 家族成員有調節(jié)雌激素依賴的雌激素受體靶基因表達的作用[31]，同時也是調節(jié)乳腺癌細胞增殖和雌激素受體轉錄活性的調節(jié)因子[32]，有研究發(fā)現(xiàn)，SRC 可以通過調控ERα 的活性促進人成骨細胞的增殖分化[33]，促進骨形成過程。

通過 GO 富集分析及 KEGG 通路分析，GO-BP 富集集中在細胞遷移和運動的正向調節(jié)，移行的正向調節(jié)，血管形態(tài)的發(fā)生，而GO-MF 富集分析結果主要集中在轉錄因子結合、細胞黏附分子結合及蛋白質結構域特異性結合等方面，GO-CC 富集分析顯示黏著斑、細胞基質黏著連接、質膜蛋白復合物等與絕經(jīng)后乳腺癌患者骨質疏松相關。益腎健骨方通過癌癥通過癌癥通路、人乳頭瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路等。其中Pi3k-Akt 信號通路通過多種方式參與信號轉導，與骨質疏松、骨關節(jié)炎等疾病相關[34-35]，強勝林等[36]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，抑制Pi3k-Akt 信號通路的激活可以減少破骨細胞的分化，從而改善骨質疏松。在癌癥通路和人乳頭瘤病毒感染通路圖中，益腎健骨方還可對Wnt信號通路、COX2等進行調節(jié)以治療骨質疏松。

5 結論

本研究利用網(wǎng)絡藥理學、分子對接方法展示了益腎健骨方通過β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮苷、山柰酚等多種成分作用于 CYP19A1、ESR2、AR、SRC、ESR1 等靶點，從而影響癌癥通路、人乳頭瘤病毒感染通路、Pi3k-Akt 通路干預絕經(jīng)后乳腺癌骨質疏松癥。為驗證以上網(wǎng)絡藥理學方法預測結果，本研究通過大鼠體內實驗進行驗證，結果顯示，益腎健骨方可以增加大鼠骨小梁密度及骨組織膠原溶劑，改善骨質疏松狀態(tài)。Pi3k-AKt 信號通路參與成骨細胞和破骨細胞活動的調控，本實驗中益腎健骨方下調大鼠骨組織中Pi3k蛋白表達，改善大鼠骨質疏松狀態(tài)。

參照《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》[37]，本文中疾病、藥物成分靶點來源于目前網(wǎng)絡藥理學研究的權威數(shù)據(jù)庫；所用的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡分析軟件及分析方法為網(wǎng)絡藥理學研究廣泛使用。通過動物體內研究對結果進行驗證，實驗設計合理，結果具有可重復性。但本研究仍有一定局限性：本文中中藥成分眾多，組成復雜，結合臨床實際，實驗驗證針對中藥可能作用的信號通路進行，但未涉及處方中篩選到的主要活性成分，未來可開展相關實驗研究。