基于腸道菌群探討補(bǔ)脾益腎方改善5/6腎切除大鼠腸道屏障延緩慢性腎臟病進(jìn)展的作用機(jī)制

莫業(yè)南 ，李 茵 ，揭西娜 ，王立新 ，吉春蘭 ，盧釗宇 ＊＊，劉旭生 ＊＊

（1. 南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 廣州 510515；2. 廣東省中醫(yī)院 廣州 510120；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510006）

慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）是指存在三個(gè)月或者更長時(shí)間的腎臟損害或腎功能下降，最終發(fā)展至終末期腎臟病而需要透析或腎臟移植。在2017年，CKD的全球患病率為9.1%，較1990年增長了29.3%，已成為全球重大公共衛(wèi)生健康問題之一[1]，由此可見，當(dāng)前我們迫切需要延緩CKD 進(jìn)展的有效方法。在西醫(yī)治療中晚期CKD 方面，ACEI/ARB 因可能引起急性腎功能減退、高鉀血癥等不良反應(yīng)而無法使用，而其他對癥治療如控制血壓、糾正貧血、改善營養(yǎng)不良等措施對延緩CKD 進(jìn)展療效有限。近年來，越來越多的證據(jù)表明中藥對CKD 患者[2-4]和CKD 動物[1-3]有益。廣東省中醫(yī)院腎內(nèi)科劉旭生教授梳理了全國30家中醫(yī)腎病重點(diǎn)?？品桨?，結(jié)合?？贫嗄昱R床實(shí)踐以及全國名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)傳承，提出CKD 的核心病機(jī)為脾腎氣虛為本，水濕瘀阻為標(biāo)，脾腎氣虛貫穿CKD 始終，確定了補(bǔ)脾益腎法，形成具有嶺南特色的補(bǔ)脾益腎方（Bupi Yishen Formula, BYF）[4-5]。方中黃芪、菟絲子為君，補(bǔ)脾氣、溫脾陽；臣藥有黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、首烏，助黃芪健脾益氣、協(xié)菟絲子固精益腎；佐以丹參活血通絡(luò)，祛瘀水之結(jié)；薏苡仁補(bǔ)脾以化濕、化濕以健脾；整方呈現(xiàn)補(bǔ)脾益腎、活血利濕之效。隨后在全國23 家三甲醫(yī)院腎病?？崎_展多中心隨機(jī)對照研究以評估補(bǔ)脾益腎方治療CKD4期的療效，結(jié)果表明，補(bǔ)脾益腎方延緩慢性腎臟病4期進(jìn)展療效優(yōu)于陽性藥氯沙坦且在不良反應(yīng)方面無明顯差異[6-7]，提示補(bǔ)脾益腎方治療CKD4期療效確切、安全可控。但是，補(bǔ)脾益腎方改善腎功能，延緩CKD 進(jìn)展的分子作用機(jī)制尚不清晰，阻礙了補(bǔ)脾益腎方在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。

近年隨著腸道菌群和全身疾病關(guān)系研究的深入，尤其從2011 年腸腎軸被提出以來[8]，研究腸道微生態(tài)和慢性腎臟病之間的關(guān)系也逐漸成為焦點(diǎn)。腸道功能障礙是CKD 常見的并發(fā)癥之一，臨床上常表現(xiàn)為厭食、嘔吐、便秘、腸道粘膜出血糜爛等；并引起腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸道屏障受損[9]，內(nèi)毒素和細(xì)菌代謝物易位至循環(huán)系統(tǒng)，引起尿毒癥毒素積蓄、炎癥、CKD 進(jìn)展和心血管疾病[10]。腸道功能障礙的特點(diǎn)是腸道通透性異常增加，這是腸道屏障受損的指標(biāo)[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)5/6 腎切除小鼠模型中，CKD 進(jìn)程伴隨著血液中硫酸吲哚酚的積累，硫酸吲哚酚可抑制上皮細(xì)胞的跨膜電阻和緊密連接相關(guān)基因的表達(dá)[12]。由此可見，基于“腸腎軸”理論探索補(bǔ)脾益腎方延緩CKD 進(jìn)展的機(jī)制，具有良好的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)?！堆a(bǔ)脾益腎顆粒通過調(diào)整腸道微生態(tài)影響芳烴受體AHR 通路治療慢性腎臟病的機(jī)制研究》為劉旭生教授在2018年獲得國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助，探索腸道菌群的調(diào)整以及腸道屏障的變化是其中的關(guān)鍵部分。

因此，本研究以腸道菌群和腸道屏障為切入點(diǎn)，以5/6 腎切除大鼠構(gòu)建CKD 動物模型，觀察補(bǔ)脾益腎方對CKD 大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用以及對腸道粘膜屏障功能的影響，進(jìn)一步探討補(bǔ)脾益腎方延緩5/6 腎切除大鼠腎功能減退的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF 級雄性 Sprague Dawley 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量范圍在180-220 g，從南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購入。質(zhì)量合格證號：440021000019963，在廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，12 h 明/12 h 暗周期，環(huán)境溫度為20±2℃，相對濕度為50±5%，大鼠可自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)時(shí)間為1周，隨后開始實(shí)驗(yàn)。廣東省中醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會已通過本實(shí)驗(yàn)的倫理審核（動物倫理批號：2019026）。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)脾益腎方由黃芪、黨參、菟絲子、白術(shù)、茯苓、山藥、薏苡仁、何首烏、丹參等組成，購自康美藥業(yè)。中藥浸膏按以下方法進(jìn)行制備：每次取上述飲片共1550 g 生藥混合后，加入純水（1:8（w/v））浸泡30 min，煮沸后煎煮1 h，共煎煮3 次；濾去藥渣，將濾液合并后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮至500 mL 為補(bǔ)脾益腎方高劑量藥液（含生藥濃度為3.1 g·mL-1），冷卻后密封冷藏保存?zhèn)溆?。待使用時(shí)在補(bǔ)脾益腎方高劑量藥液中加入等量純水?dāng)嚢柘♂尀檠a(bǔ)脾益腎方低劑量溶液（含生藥濃度為1.55 g·mL-1）。

1.3 動物分組、模型構(gòu)建及藥物干預(yù)

利用Excel 軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)從40 只大鼠中抽取10 只作為假手術(shù)組（Sham 組），余30 只大鼠則行5/6 腎切除手術(shù)以構(gòu)建CKD 模型：先采用腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）對大鼠進(jìn)行麻醉，備皮、消毒，于脊柱旁開1.5 cm、左肋骨下緣處做一縱向切口，使左側(cè)腎臟充分暴露，剝離腎包膜及腎上腺，動脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，切除左腎上、下極2/3 腎實(shí)質(zhì)，創(chuàng)面止血并確認(rèn)無出血后，將殘余腎組織還納入腹腔，逐層縫合。一周后行右腎切除術(shù)，麻醉及手術(shù)過程與前相同，由此構(gòu)建5/6腎切除CKD大鼠模型。4周后通過眼眶采血進(jìn)行檢測血肌酐和尿素氮，來評估是否造模成功。根據(jù)血肌酐水平將成功造模的5/6 腎切除大鼠隨機(jī)分成3 組：補(bǔ)脾益腎方高劑量組（H-BYF 組）、補(bǔ)脾益腎方低劑量組（L-BYF 組）和模型對照組（5/6Nx 組），每組各 10 只。H-BYF 組和 L-BYF 組大鼠分別給予補(bǔ)脾益腎方高劑量藥液和低劑量藥液灌胃；假手術(shù)組和5/6 腎切除模型組分別予蒸餾水灌胃；一次灌胃量為1 mL/100 g體重，每天1次，連續(xù)4周。

1.4 標(biāo)本采集

干預(yù)過程中，每周稱重以及記錄大鼠的一般情況。干預(yù)結(jié)束前收集大鼠24 h 尿液和糞便；干預(yù)結(jié)束后行腹主動脈采血，血液標(biāo)本經(jīng)離心機(jī)3000 rpm，15 min 離心后留取血清標(biāo)本，以上尿液、糞便及血清標(biāo)本儲存在-80℃冰箱中備檢；腎臟及結(jié)腸組織分為兩部分標(biāo)本，一部分置入4%甲醛溶液固定以作病理組織切片，另一部分放入凍存管后置入液氮中，再轉(zhuǎn)移在-80℃冰箱中以行western-blot。

1.5 生化檢測與酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測

使用羅氏Cobas C702 全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）、血白蛋白（ALB）。尿蛋白通過使用BCA（Bicinchoninic acid）蛋白濃度測定試劑盒（Thermo Fisher Scientific）檢測。根據(jù)大鼠硫酸吲哚酚 ELISA 試劑盒（Creative Diagnostics）說明書檢測血清硫酸吲哚酚水平。根據(jù)大鼠二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）ELISA 試劑盒（華美）說明書測量血清DAO水平。

1.6 腎臟及腸道病理損傷的檢測

腎臟及腸道組織標(biāo)本在4%甲醛溶液浸泡固定24 h后修剪規(guī)整，隨后進(jìn)行脫水、包埋、切片，切片厚度為3um。切片先進(jìn)行65℃烘烤2 h，再將切片依次進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、染色，腎臟行PAS/Masson 染色（南京建成）觀察腎小管間質(zhì)纖維化情況；結(jié)腸組織行HE 染色（博士德）觀察結(jié)腸粘膜上皮層結(jié)構(gòu)，最后行透明、封片等步驟。

1.7 Western-blot評估腸道屏障功能

將蛋白酶抑制劑（碧云天）、磷酸酶抑制劑（碧云天）和蛋白酶抑制劑（碧云天）加入到RIPA 裂解液（Thermo Fisher Scientific），取結(jié)腸組織放入上述混合液中進(jìn)行裂解后離心，通過BCA 蛋白試劑盒（Thermo Fisher Scientific）檢測上清液的蛋白濃度。取50g 蛋白質(zhì)樣品與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（CST）混合變性后再電泳，并通過Bio-Rad快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印到PVDF膜（Millipore）上。膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，后予ZO-抗體（1:1000，abcam），Occludin（1:1000，abcam），Claudin-1（1:500，abcam），IL-22（1:1000，abcam）或βactin（1:2000,CST）在4℃過夜，次日復(fù)溫后予TBST 洗滌3 次后在室溫下使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 抗體（1:3000,CST）孵育1.5h。繼續(xù)予TBST 洗滌3次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液（Millipore），利用Bio-Rad 凝膠成像儀對信號進(jìn)行捕獲和分析。

1.8 腸道菌群分析

由華大基因公司對糞便標(biāo)本進(jìn)行處理，大鼠糞便DNA 的提取通過使用QIAGEN 糞便基因組DNA 提取試劑盒來完成，并進(jìn)行DNA擴(kuò)增和鑒定。DNA文庫構(gòu)建完成后，通過Illumina HiSeq/MiSeq 16S rDNA測序平臺使用二代測序法進(jìn)行測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、組裝、濾除低質(zhì)量序列，得到高質(zhì)量有效數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。為了探索糞便樣品的物種組成多樣性，對所有有效數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類操作分析，將相似度在97%以上的序列聚類為操作分類單元（Operational Taxonomic Units, OTUs）。得到OUT 序列后，通過BLCA 軟件比對注釋數(shù)據(jù)庫NCBI 對OTUs 的代表序列進(jìn)行物種注釋，得到相對應(yīng)的物種信息及其豐度分布情況。基于門的水平分析差異菌群的相對豐度，以物種豐度柱狀圖呈現(xiàn)；行α-多樣性分析以評估物種多樣性；行β-多樣性以評估物種豐富度。根據(jù)OTUs的物種注釋結(jié)果，采用Lefse方法進(jìn)行組間比較，分析微生物的組間差異，利用條形圖顯示LDA score＞2的物種為顯著差異物種。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工具為SPSS19.0 軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。分析時(shí)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布者采用單因素方差分析比較均值，單因素方差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)則進(jìn)行均值兩兩比較；不滿足正態(tài)分布則應(yīng)用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)脾益腎方有助于改善CKD相關(guān)指標(biāo)

5/6Nx 組的血肌酐、尿素氮和24 h 蛋白尿及血清硫酸吲哚酚水平顯著高于Sham 組，H-BYF 組大鼠的上述指標(biāo)均明顯下降（表1）。蛋白尿方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx 組大鼠的24 h 蛋白尿有明顯升高（151.3±14.0 vs 448.8±50.4，P=0.003）；與 5/6Nx 組 比較，H-BYF 組的24h 蛋白尿定量明顯下降（448.8±50.4 vs 239.7±22.2，P=0.028）。血肌酐方面，與 Sham 組大鼠相比，5/6Nx組大鼠的血肌酐水平有明顯升高（31.1±0.7 vs 66.8±5.6，P＜0.001）；與5/6Nx 組比較，H-BYF 組的血肌酐水平明顯下降（66.8±5.6 vs 51.3±1.5，P=0.007）。血尿素氮方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx組大鼠的尿素氮水平有明顯升高（5.3±0.2 vs 10.1±0.6，P＜0.001）。與 5/6Nx 組比較，H-BYF 組的尿素氮水平明顯下降（10.1±0.6 vs 7.5±0.3，P=0.002）。硫酸吲哚酚方面，與Sham 組大鼠相比，5/6Nx 組大鼠的硫酸吲哚酚水平有明顯升高（5.8±0.6 vs 18.8±0.9，P＜0.001）。與5/6Nx 組比較，H-BYF 組的硫酸吲哚酚水平明顯下降（18.8±0.9 vs 9.0±1.0，P＜0.001）

表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白定量的比較

與大鼠血肌酐和尿素氮的變化相一致，低劑量和高劑量補(bǔ)脾益腎方可改善CKD 大鼠的腎臟病組織病理損傷（圖1）。根據(jù)Masson染色所顯示腎臟纖維化結(jié)果，假手術(shù)組未見纖維沉積；5/6 腎切除模型組可見膠原纖維大量沉積于腎間質(zhì)中，而低劑量組和高劑量組大鼠腎臟組織中膠原纖維沉積減少，其中高劑量組的減少尤為明顯。PAS 染色顯示，假手術(shù)組未見明顯病理改變，符合正常腎臟的病理切片表現(xiàn)；模型組大鼠出現(xiàn)腎小管腔增大、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，伴有大量單核淋巴細(xì)胞浸潤；腎切除大鼠接受低劑量和高劑量補(bǔ)脾益腎方治療后，腎臟病理損傷減輕，其中以高劑量補(bǔ)脾益腎方治療后腎損傷緩解最為明顯。

圖1 各組大鼠腎臟病理Masson（A）和PAS（B）染色結(jié)果（X200）

2.2 補(bǔ)脾益腎方可修復(fù)腸道屏障功能

假手術(shù)組大鼠的結(jié)腸黏膜組織緊密、未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；CKD 模型組大鼠的固有層組織疏松、結(jié)腸黏膜層水腫、炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重。與5/6 腎切除大鼠模型組相比，補(bǔ)脾益腎方治療組大鼠粘膜層和固有層的水腫均得到明顯改善，炎性細(xì)胞的浸潤明顯減少（圖2A）。

圖2 各組大鼠結(jié)腸病理HE染色結(jié)果(X200，A)及血清DAO水平（B）

如圖 2B 所示，與 Sham 組相比，5/6Nx 組血清 DAO水平顯著升高（6.0±0.8 vs 18.7±4.1，P=0.016），而經(jīng)高劑量補(bǔ)脾益腎方治療后血清DAO 水平顯著降低（18.7±4.1 vs 7.3±1.4，P=0.034）。

與Sham 組大鼠比較，5/6Nx 組大鼠的結(jié)腸組織緊密連接蛋白（ZO-1 和Claudin-1）以及IL-22 表達(dá)水平明顯下降，具有顯著性差異；與5/6Nx 組比較，H-BYF組則均有升高，具有顯著性差異。腸道組織緊密連接蛋白Occludin 的表達(dá)水平在各組間均無顯著性差異，但是與假手術(shù)組比較，5/6Nx 組大鼠的腸組織緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)水平具有升高的趨勢，與5/6Nx組比較，L-BYF 組與H-BYF 組的結(jié)腸Occludin表達(dá)水平具有下降趨勢（圖3）。

圖3 各組大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白和IL-22的表達(dá)水平

上述結(jié)果共同表明CKD 大鼠的腸道屏障功能損傷，補(bǔ)脾益腎方可以保護(hù)腸道屏障，修復(fù)腸道屏障功能，維護(hù)腸道屏障的完整性。

2.3 補(bǔ)脾益腎方可調(diào)整CKD大鼠的腸道菌群

2.3.1 測序結(jié)果質(zhì)量分析

物種累積曲線是用于衡量和預(yù)測群落物種組成和豐富度的有效工具，被廣泛用于判斷抽樣量的充分性以及估計(jì)物種的豐富度。在本研究中，物種累計(jì)曲線圖的曲線末端上升趨勢趨于平緩，提示采樣率足夠，可進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析（圖4A）。

2.3.2 腸道菌群的多樣性分析

（1） α-多樣性分析 基于OUT 水平的分析，在Shannon指數(shù)上，Sham組和H-BYF組較5/6Nx模型組低；在Simpson 指數(shù)上，Sham 組和 H-BYF 組較 5/6Nx 模型組高。根據(jù)Wilcoxon Rank-Sum 檢驗(yàn)結(jié)果，提示模型組和高劑量組之間Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0011和0.0006）（圖4B）。

（2） β-多樣性分析 基于非加權(quán)的距離的主坐標(biāo)分析，5/6 腎切除模型組大鼠與高劑量組大鼠的物種明顯分開，各聚成一簇，而低劑量組大鼠則處于模型組和高劑量組二者之間，由此可知CKD 大鼠經(jīng)高劑量補(bǔ)脾益腎方治療后腸道微生物多樣性發(fā)生改變（圖4C）。

圖4 補(bǔ)脾益腎方調(diào)整CKD大鼠的腸道菌群

2.3.3 物種組成分析

為分析各組間物種的變化情況，通過與注釋數(shù)據(jù)庫NCBI 比對，對OUT 進(jìn)行物種分類，并通過物種豐度柱狀圖直觀展示在門的水平上各組物種組成及比例。在門的水平上，各組大鼠腸道相對豐度最高的菌群均為擬桿菌門和厚壁菌門，其相對豐度分別為假手術(shù)組36.7%和58.2%，5/6Nx 模型組31.6%和62.2%，低劑量組27.5%和66.2%，高劑量組41.1%和47.9%（圖4D）。與正常組相比，5/6Nx 模型組的擬桿菌門和厚壁菌門數(shù)值比值（Bacteroidetes/Firmicutes, B/F）降低；與模型組相比，高劑量組的B/F值升高。

高劑量組和5/6Nx 模型組大鼠之間的腸道菌群多樣性存在差異，進(jìn)一步使用Lefse分析以篩選組間差異物種，結(jié)果顯示：與5/6Nx 組比較，高劑量組大鼠糞便Prevotella（普氏菌屬）、Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamona（巨單胞菌屬）的相對豐度顯著升高，Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（鹽扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假單胞菌科）和Ruminococcus（瘤胃球菌）的相對豐度顯著降低（圖4E）。

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾益腎方可有效降低5/6 腎切除CKD 大鼠的血肌酐、尿素氮和硫酸吲哚酚水平，降低24 h 蛋白尿定量水平，改善腎臟病理損傷；同時(shí)，經(jīng)過補(bǔ)脾益腎方治療后，腸道菌群中益生菌增加，致病菌減少，腸道組織IL-22 及緊密連接蛋白的表達(dá)增加，腸道屏障功能修復(fù)。因而，我們認(rèn)為，補(bǔ)脾益腎方可能是通過調(diào)整腸道菌群，保護(hù)腸道屏障功能，減少尿毒癥毒素入血，發(fā)揮延緩CKD 進(jìn)展的腎保護(hù)作用。

5/6 腎切除大鼠模型制作較簡單、重復(fù)性好，是研究腎纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制及相關(guān)治療方法的理想模型，其典型病理改變是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，與人類腎臟纖維化病理過程相一致。在我們的研究中，與假手術(shù)組相比，5/6 腎切除模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生、腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化、炎性細(xì)胞浸潤等病理改變。與5/6 腎切除模型組相比，低劑量和高劑量補(bǔ)脾益腎方組的腎臟病理損傷均能得到緩解。

腸道不僅是消化食物和吸收營養(yǎng)的重要器官，所形成的屏障還能防止內(nèi)毒素、尿毒癥毒素等腸腔內(nèi)有害物質(zhì)穿過腸道粘膜進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾益腎方可有效改善CKD 大鼠的腸道屏障功能。按照結(jié)構(gòu)和功能的不同，腸道屏障包括四個(gè)部分：腸道生物屏障、腸道機(jī)械屏障、腸道免疫屏障和腸道化學(xué)屏障，共同維持著腸道乃至整個(gè)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。腸道組織緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin 和Claudin-1等表達(dá)減少提示著腸道黏膜結(jié)構(gòu)受損，可能引起腸上皮通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌易位，并伴隨血清DAO 水平升高[13]。DAO 在血液中的含量通常較低，主要表達(dá)在腸黏膜中，并與腸道屏障的通透性呈正相關(guān)[14]。而IL-22 可促進(jìn)上皮細(xì)胞的再生和抗菌肽的產(chǎn)生，已被證明在粘膜防御中起關(guān)鍵作用[15]。我們的研究表明，補(bǔ)脾益腎方有助于改善腸道機(jī)械屏障和免疫屏障，前者是通過調(diào)節(jié)粘膜結(jié)構(gòu)和上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)來改善，從而降低從結(jié)腸到血清的DAO 水平；后者則是通過促進(jìn)IL-22的產(chǎn)生來改善腸道免疫屏障功能。

與此同時(shí)，補(bǔ)脾益腎方還對腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)生影響。生物屏障是由寄生于腸腔表面的大量細(xì)菌、病毒等構(gòu)成的。在本研究中，CKD 大鼠經(jīng)補(bǔ)脾益腎方治療后，腸道菌群獲得一定的調(diào)整。首先體現(xiàn)在菌群多樣性的改變，與假手術(shù)組比較，CKD 模型組的 α 多樣性指數(shù)如 Shannon 升高，Simpson 下降，提示CKD 大鼠腸道菌群多樣性增加，這可能由于CKD 的疾病狀態(tài)下，與尿毒癥毒素代謝有關(guān)的致病菌過度生長[16]，而補(bǔ)脾益腎方的治療可有效調(diào)整腸道菌群。我們發(fā)現(xiàn)，在門的水平上在各組中相對豐度最高的細(xì)菌均為擬桿菌門和厚壁菌門，二者在調(diào)節(jié)宿主炎癥及免疫平衡中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和厚壁菌門的比值（F/B）與腸道通透性關(guān)系密切，二者呈正相關(guān)[17]。在本研究中，模型組的F/B 比值比假手術(shù)組高，高劑量組的F/B 比值較模型組下降，此變化趨勢與高血壓患者和糖尿病動物的腸道菌群F/B 值相一致[18-19]。

在科的水平上，補(bǔ)脾益腎方干預(yù)組降低了Clostridiaceae（梭菌科）、Haloplasmataceae（鹽扁菌科）、Micrococcaceae（微球菌科）、Pseudomonadaceae（假單胞菌科）的相對豐度。已有研究發(fā)現(xiàn)，上述四種菌科可促進(jìn)脲酶和尿酸酶等產(chǎn)尿毒癥毒素特定酶的產(chǎn)生[20]。在屬的水平上，補(bǔ)脾益腎方有助于提高了CKD 大鼠的Prevotella（普氏菌屬）、Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamonas（巨單胞菌屬）的相對豐度，降低了Ruminococcus（瘤胃球菌）的相對豐度。在輕度腎功能受損的成人中，Ruminococcus的豐度與硫酸吲哚酚水平呈正相關(guān)，與腎功能呈負(fù)相關(guān)[21]。在本研究中，與5/6 腎切除組大鼠相比，低劑量和高劑量補(bǔ)脾益腎方組的血肌酐、尿素氮以及硫酸吲哚酚均明顯下降，并呈劑量依賴性，考慮與補(bǔ)脾益腎方減少產(chǎn)尿毒癥毒素特定酶的菌屬相關(guān)。

已有研究證明腸道菌群失調(diào)，致病菌增多促進(jìn)尿毒癥毒素的產(chǎn)生，破壞腸道粘膜屏障功能，使毒素進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，加速CKD 發(fā)展[12]。補(bǔ)脾益腎方降低產(chǎn)尿毒癥毒素特定酶的腸道菌群，包括Clostridiaceae（ 梭 菌 科 ）、Haloplasmataceae（ 鹽 扁 菌 科 ）、Micrococcaceae（微球菌科）和Pseudomonadaceae（假單胞菌科）的相對豐度，因而我們可檢測出補(bǔ)脾益腎方組的大鼠血清硫酸吲哚酚明顯減少。一些腸道微生物來源的尿毒癥毒素，包括苯乙酰谷氨酰胺、硫酸吲哚酚、硫酸對甲酚和氧化三甲胺，在CKD 和終末期腎臟病患者血清中升高，并與CKD 的發(fā)展、心血管事件、死亡等臨床終點(diǎn)呈正相關(guān)。已有實(shí)驗(yàn)證明硫酸吲哚酚、硫酸對甲酚等尿毒癥毒素能促進(jìn)CKD 大鼠腎間質(zhì)纖維化。上述研究發(fā)現(xiàn)支持了腸源性尿毒癥毒素的增加可促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展。終末期腎臟病患者的腸道屏障功能受損，促進(jìn)尿毒癥毒素進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，是尿毒癥患者普遍存在的全身炎癥的潛在原因。尿毒癥患者即使接受規(guī)律血液透析治療，硫酸吲哚酚等腸道微生物來源的尿毒癥毒素不能被有效清除，毒素蓄積引起的尿毒癥綜合癥，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量和縮短了預(yù)期壽命。因此，我們認(rèn)為，補(bǔ)脾益腎方調(diào)節(jié)腸道菌群可以緩解尿毒癥的毒素蓄積癥狀，提高生活質(zhì)量，延緩CKD 進(jìn)展，或可推遲進(jìn)入腎臟替代治療的時(shí)機(jī)。

雖然在本研究中未能以數(shù)據(jù)明確說明短鏈脂肪酸在各組間的差異，但是Prevotella（普氏菌屬），Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）和Megamonas（巨單胞菌屬）可促進(jìn)腸道中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，為產(chǎn)短鏈脂肪酸菌[22-24]。當(dāng)前已有研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸作為腸道上皮特殊營養(yǎng)和能量組分，發(fā)揮著保護(hù)腸道黏膜屏障、降低人體炎癥水平和促進(jìn)胃腸道運(yùn)動機(jī)能等作用，對維持人體健康至關(guān)重要。腸道菌群代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可通過抑制組蛋白去乙?；福せ頖PR41以促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α及芳香烴受體的表達(dá)，從而促進(jìn)CD4+ T 細(xì)胞及固有免疫細(xì)胞中白介素-22（IL-22）的表達(dá)，以維持腸道免疫屏障穩(wěn)態(tài)[15]。IL-22是IL-10 家族成員，通過促進(jìn)上皮屏障功能和誘導(dǎo)抗菌肽來保護(hù)宿主以免受到腸道炎癥的損傷[25]。IL-22敲除的基因小鼠，腸道屏障功能受損、抗菌肽減少，致病菌增加、益生菌減少、菌群失調(diào)，導(dǎo)致血液中菌群產(chǎn)物脂多糖和氧化三甲胺增多，活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，啟動動脈粥樣硬化的發(fā)生，而補(bǔ)充IL-22可抑制小鼠促動脈粥樣硬化的菌群增殖，從而對動脈粥樣硬化起抑制作用[26]。另一方面，短鏈脂肪酸本身具有一定的腎保護(hù)作用，譬如補(bǔ)充短鏈脂肪可有效抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞的炎癥，降低小鼠糖尿病腎病的發(fā)生[22]。對于終末期腎病患者而言，腸源性尿毒癥毒素可加劇全身炎癥和氧化應(yīng)激，可促進(jìn)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展和提高患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)一項(xiàng)初步臨床研究結(jié)果可知，維持性血液透析患者補(bǔ)充丙酸鈉可降低維持性血液透析患者的炎癥參數(shù)，抑制氧化應(yīng)激[27]。在本研究中，經(jīng)補(bǔ)脾益腎方治療后的CKD 大鼠腸道病理改善、腸道組織緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin-1 增多，可能是補(bǔ)脾益腎方治療通過增加產(chǎn)短鏈脂肪酸的菌群，促進(jìn)IL-22的表達(dá)，增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，保護(hù)腸道屏障，維持腸道穩(wěn)態(tài)。

《金匱要略》有“四季脾旺不受邪”之說；中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾居中焦，為氣血生化之源；脾的這種抗邪能力和運(yùn)化水谷與腸道菌群的機(jī)體免疫功能和營養(yǎng)物質(zhì)代謝具有類比之處。當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí),可出現(xiàn)脾虛癥狀如腹脹、納呆、腹脹、乏力、便溏等,腸道菌群失調(diào)或許是中醫(yī)脾虛證的重要生物學(xué)機(jī)制之一[28]。在補(bǔ)脾益腎方中，黃芪、黨參、山藥、白術(shù)、薏苡仁、茯苓均具健脾功效，生物活性成分有黃酮類、多糖類、生物堿等，具有促進(jìn)益生菌生長、抑制致病菌生長、抑制炎癥因子、保護(hù)腸黏膜、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用[29]。腎為先天之本，脾為后天之本，水谷精微的培育和充養(yǎng)，才能使腎的精氣得到不斷充盈和成熟。因此，我們考慮：腸道菌群保持相對穩(wěn)態(tài)—脾胃化生水谷精微功能正?！院筇祓B(yǎng)先天，腎的精氣得到充盈；腸道菌群紊亂—脾失健運(yùn),產(chǎn)生濕、毒、瘀等邪實(shí)——腎的精氣受損。

綜上，補(bǔ)脾益腎方在減少致病菌生長的同時(shí)增加益生菌的相對豐度，調(diào)節(jié)腸道菌群，減少尿毒癥毒素的產(chǎn)生，促進(jìn)腸道緊密連接蛋白和免疫因子IL-22 的產(chǎn)生，修復(fù)腸道粘膜屏障功能，減少毒素入血進(jìn)入全身循環(huán)，從而延緩CKD 的進(jìn)展。本研究的創(chuàng)新之處在于基于腸腎軸理論模型，從腸道菌群與腸道屏障相關(guān)的新角度，證實(shí)補(bǔ)脾益腎方可能通過調(diào)整腸道菌群，保護(hù)腸道屏障，延緩慢性腎臟病，構(gòu)成補(bǔ)脾益腎方-腸道菌群-腸道屏障-尿毒組毒素-CKD 的潛在作用機(jī)制。本研究的不足之處在于探討補(bǔ)脾益腎方與腸道菌群和腎臟病的相關(guān)關(guān)系同時(shí)，未能對其因果關(guān)系進(jìn)行確認(rèn)，亦未能排除中藥對腎功能的直接作用，待日后進(jìn)一步研究。