補(bǔ)脾益腸丸通過抑制潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠糖酵解代謝途徑發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制研究

肖秋萍，黃佳琦，萬琪，施旻，李姍姍，劉端勇，陳麗玲，鐘友寶，（.江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心，江西 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)方證研究中心，江西 南昌 0004）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩?。╟rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），屬于慢性非特異性腸道炎癥[1]；在中醫(yī)理論中屬于“痢疾”“久痢”等范疇[2]。隨著工業(yè)化快速發(fā)展、飲食結(jié)構(gòu)西方化，我國潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率逐年攀升[3]。潰瘍性結(jié)腸炎臨床上反復(fù)發(fā)作且難以徹底治愈，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將潰瘍性結(jié)腸炎列為十大難治性疾病之一[4]。氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、新型免疫抑制劑等藥物廣泛用于快速緩解潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，但其療效不足、治愈率低、藥物依賴性大、費(fèi)用高等局限性導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎治療仍是醫(yī)療的重大挑戰(zhàn)[5]。因而，尋找更加安全、有效、可靠的治療藥物已然迫在眉睫。

補(bǔ)脾益腸丸（BupiYichangPills）是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用方劑，主治潰瘍性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎等[6]。納入835 例潰瘍性結(jié)腸炎患者的Meta 分析結(jié)果[15]顯示，補(bǔ)脾益腸丸聯(lián)合常規(guī)療法干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎能提高臨床總有效率，減少不良反應(yīng)，并改善結(jié)腸黏膜癥狀評分。在單一用藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的案例[7]中，補(bǔ)脾益腸丸臨床療效明顯優(yōu)于西藥組，腹痛、腹瀉、黏液便等癥狀明顯改善，然而其具體作用機(jī)制尚未見報道。

據(jù)研究[8]報道，糖酵解信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展中扮演關(guān)鍵性角色。潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道黏膜受損，糖酵解相關(guān)酶活性和基因表達(dá)明顯增加，而過度激活的糖酵解會加重潰瘍性結(jié)腸炎患者能量代謝紊亂[9]。此外，糖酵解信號通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)進(jìn)程[10]。中醫(yī)藥可通過干預(yù)糖酵解代謝途徑，改善腸道炎性環(huán)境從而有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎[11]；如清腸溫中方可通過抑制糖酵解代謝而調(diào)控CD4+TRM 細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)有效治療潰瘍性結(jié)腸炎[12]。潰瘍性結(jié)腸炎的典型特征是病情遷延不愈、反復(fù)發(fā)作[13-14]，降低復(fù)發(fā)率是治療關(guān)鍵，而有報道稱補(bǔ)脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎不僅療效好且復(fù)發(fā)率低[15]。

本研究旨在基于糖酵解途徑，擬采用復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎模型揭示補(bǔ)脾益腸丸緩解潰瘍性結(jié)腸炎并抑制復(fù)發(fā)的具體作用機(jī)制，以期為補(bǔ)脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學(xué)依據(jù)，并豐富中醫(yī)理論內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動物7～8 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，體質(zhì)量20～24 g（動物質(zhì)量合格證號： 202132170），購于南京集萃藥康公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心屏障環(huán)境內(nèi)。小鼠自由飲水，采食標(biāo)準(zhǔn)全價飼料，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24℃，濕度50%～60%。本研究方案得到江西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：JZLLSC2020-234，整個實驗操作過程遵守實驗動物標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。

1.2 藥物及試劑補(bǔ)脾益腸丸，購于白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，批號：K05190，組方為黃芪、米炒黨參、砂仁、白芍、當(dāng)歸、白術(shù)、肉桂、醋延胡索、荔枝核、炮姜、炙甘草、防風(fēng)、木香、鹽補(bǔ)骨脂、煅赤石脂；葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS；分子量36～50 kDa），批號：160110，購于美國MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪（Mesalazine，5-ASA，批號：89-57-6），購于美國Sigma-Aldrich公司；戊巴比妥鈉（批號：1014P035），購于美國Sigma 公司；M5 HiPer Universal RNA Mini Kit（批號：MF167）、M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover（批號：MF166）、SYBRgreen Mix（批號：MF-015），均購于北京聚合美生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α（批號：88-7324-88）、白細(xì)胞介素（IL）-1β（批號：BMS6002）、IL-6（批號：88-7064-22）、IL-10（批號：88-7105-22）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1（批號：BMS608-4）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，均購于美國Thermo Scientific 公司；IL-35酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（批號：E-EL-H2443c），購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Anti-PKM2抗體（批號：ab137791）、Anti-Aldolase 抗體（批號：ab252953）、Anti-Glut1 抗體（批號：ab115730）、Anti-Glut4 抗體（批號：ab313775）、Anti-HK2 抗體（批號： ab209847）、 Anti- Glut2 抗體（批號：ab54460），均購于英國Abcam公司。

1.3 主要儀器HistoCore_Arcadia 型全自動包埋機(jī)、Leica2245 型石蠟切片機(jī)、DM2500 型多人共覽顯微鏡，德國Leica 公司；Multiskan Spectrum 型全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀，美國密理博公司；LightCycle 96型熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司；UVP ChemStudio 型化學(xué)發(fā)光成像儀，德國Analytikjena公司。

1.4 方法

1.4.1 潰瘍性結(jié)腸炎模型建立及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分成空白對照組，模型組，低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組，美沙拉嗪組，空白補(bǔ)脾益腸丸組。潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立[12]：模型組和低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組、美沙拉嗪組小鼠于實驗第0～7 天和第14～21 天自由飲用2.5% DSS 溶液，第7～14 天自由飲水。補(bǔ)脾益腸丸和美沙拉嗪預(yù)先溶解于生理鹽水，根據(jù)補(bǔ)脾益腸丸臨床劑量（每天3 次，每次6.0 g）[6]及體表面積換算[16]，低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組和空白補(bǔ)脾益腸丸組小鼠于實驗第7～21天分別灌胃1.5、3.0、6.0、6.0 g·kg-1·d-1補(bǔ)脾益腸丸[17]，美沙拉嗪組小鼠灌胃300 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪，而空白對照組及模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

1.4.2 疾病活動指數(shù)（disease active index，DAI） 整個實驗過程，每天同時間各組小鼠稱質(zhì)量并觀察糞便黏稠度、便血情況，根據(jù)公式計算：DAI=體質(zhì)量損失評分+糞便黏稠度評分+便血情況評分，DAI評價標(biāo)準(zhǔn)參考以往研究[18]。

1.4.3 結(jié)腸長度、質(zhì)量及指數(shù) 小鼠于實驗第21天采用2%戊巴比妥鈉深度麻醉安樂死，迅速打開腹腔并分離整個結(jié)腸，測量結(jié)腸長度；預(yù)冷的PBS溶液清洗腸腔內(nèi)容物，濾紙吸干，結(jié)腸稱質(zhì)量并計算結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)（結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%）。

1.4.4 病理組織技術(shù)分析結(jié)腸損傷 取近端結(jié)腸2 cm，置于4%多聚甲醛溶液中固定，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成4 μm 切片。常規(guī)蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下采集圖片，基于炎性細(xì)胞浸潤和潰瘍形成[13]，由2 位病理學(xué)老師隨機(jī)、盲法對結(jié)腸病理圖片進(jìn)行病理損傷評分。

1.4.5 Elisa 法檢測炎性細(xì)胞因子水平 RIPA 溶液裂解結(jié)腸組織，組織勻漿均質(zhì)化，離心取上清液。BCA法檢測上清總蛋白濃度，1×PBS標(biāo)準(zhǔn)化至2 000 ng·mL-1。根據(jù)Elisa 法檢測試劑盒說明，檢測結(jié)腸組織促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和抗炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 濃度，酶標(biāo)儀讀取450 nm 處吸光度值，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞因子濃度。

1.4.6 qPCR 法檢測炎性細(xì)胞因子及糖酵解激酶基因表達(dá) 提取結(jié)腸組織總RNA，酶標(biāo)儀檢測總RNA 濃度，普通瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBRgreen Mix 試劑盒進(jìn)行實時熒光定量檢測，具體步驟參照試劑盒說明書。基因名稱和引物序列見表1，qPCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以GAPDH 為管家基因，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算炎性細(xì)胞因子及糖酵解激酶基因的表達(dá)水平。

表1 基因名稱及引物序列Table 1 Gene names and primer sequences

1.4.7 Western Blot法檢測糖酵解激酶蛋白表達(dá) RIPA裂解組織結(jié)腸組織，組織勻漿，破碎儀均質(zhì)化，4 ℃、13 000×g離心10 min，收集上清液。BCA法檢測總蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)化至3 000 ng·mL-1，加Loading buffer沸騰10 min。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，120 V條件下電泳；200 mA 條件下轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉；一抗（Glut1，Glut2，Glut4，HK2，Aldolase A，PKM2）4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗特異性結(jié)合，ECL發(fā)光液顯影，化學(xué)發(fā)光成像儀可視化成像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)脾益腸丸抑制DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎可模擬人類結(jié)腸炎發(fā)病過程，常用于潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制及抗結(jié)腸炎新藥研發(fā)[19]。在整個研究過程中，觀察到DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、腹瀉、便血等情況表現(xiàn)出先變差再轉(zhuǎn)好繼而變差的現(xiàn)象，而DAI評分亦呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢（圖1）。與空白對照組比較，模型組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度均明顯下降（P＜0.01），DAI、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)明顯上升（P＜0.01）（圖1、表2）。光學(xué)顯微鏡下觀察到模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜上皮破損脫落、大量潰瘍形成和炎性細(xì)胞浸潤（圖2），其組織病理損傷評分（表2）明顯高于空白對照組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明DSS成功誘導(dǎo)了小鼠實驗性結(jié)腸炎，且癥狀出現(xiàn)復(fù)發(fā)性。

圖1 各組小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）和結(jié)腸長度Figure 1 Disease activity index（DAI）and colonic length of mice in each group

圖2 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織損傷（HE 染色）Figure 2 Bupi Yichang Pills inhibited colonic tissue damage in colitis mice（HE staining）

表2 補(bǔ)脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效評價（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

表2 補(bǔ)脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效評價（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

注：與空白對照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補(bǔ)脾益腸丸組中劑量補(bǔ)脾益腸丸組高劑量補(bǔ)脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補(bǔ)脾益腸丸組結(jié)腸組織病理損傷評分/分0.20±0.04 5.11±0.74**3.80±1.17#2.60±0.92##1.91±0.67##2.36±0.77##0.10±0.30劑量/(g·kg-1)--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0體質(zhì)量/g 25.30±1.12 21.22±1.13**22.56±1.29#23.69±1.32##24.03±1.41##23.77±1.35##25.14±1.12結(jié)腸質(zhì)量/g 0.24±0.02 0.34±0.04**0.31±0.03 0.28±0.03##0.26±0.03##0.27±0.03##0.25±0.02結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%0.95±0.09 1.60±0.20**1.37±0.14#1.18±0.16##1.08±0.19##1.14±0.21##1.00±0.10結(jié)腸長度/cm 8.79±0.32 7.36±0.43**7.68±0.51 7.83±0.42#8.03±0.39##7.89±0.43##8.65±0.40單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)/%2.73±0.36 4.62±0.57**4.04±0.49#3.58±0.52##3.24±0.48##3.42±0.51##2.89±0.36

由圖1 和表2 可知，與模型組比較，低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠體質(zhì)量明顯上升（P＜0.05，P＜0.01），而DAI、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)明顯性下降（P＜0.05，P＜0.01）；此外，中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.01），而結(jié)腸長度明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。觀察病理組織發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸和美沙拉嗪給藥處理的結(jié)腸炎小鼠，結(jié)腸黏膜上皮較完整且潰瘍形成和炎性細(xì)胞浸潤較少（圖2），其組織病理損傷評分（表2）明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。此外，空白補(bǔ)脾益腸丸組小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、結(jié)腸長度、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明補(bǔ)脾益腸丸可有效地抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，療效呈劑量依賴性。

2.2 補(bǔ)脾益腸丸抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)促炎性（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎性細(xì)胞因子（IL-10、IL-35 和TGF-β1）之間的平衡決定著結(jié)腸炎發(fā)病和緩解的進(jìn)程[20]。由表3 可知，模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和濃度均明顯高于空白對照組（P＜0.01）。與模型組比較，除低劑量補(bǔ)脾益腸丸組的TNF-α 濃度外（P＞0.05），各劑量補(bǔ)脾益腸丸組和美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和濃度均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。此外，與空白對照組比較，空白補(bǔ)脾益腸丸組TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA 水平和濃度的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明補(bǔ)脾益腸丸抑制了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

表3 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表3 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補(bǔ)脾益腸丸組中劑量補(bǔ)脾益腸丸組高劑量補(bǔ)脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補(bǔ)脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH為內(nèi)參）濃度/（pg·mL-1）IL-6 975.26±62.13 1423.23±132.23**1225.13±92.53#1054.55±86.29##903.12±85.21##1033.22±104.52##1042.13±121.23--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 TNF-α 1.15±0.24 4.25±0.93**3.25±0.75#2.63±0.54##1.92±0.32##2.04±0.51##1.33±0.35 IL-1β 1.33±0.41 4.62±0.91**3.11±0.79##2.54±0.61##1.61±0.46##2.27±0.51##1.72±0.53 IL-6 0.92±0.25 2.48±0.57**2.14±0.51##1.71±0.37##0.89±0.41##1.25±0.31##0.25±0.03**TNF-ɑ 92.2±5.21 230.11±19.53**216.23±23.72 180.25±16.71##150.33±15.52##140.25±20.10##95.81±9.82 IL-1β 113.02±26.28 270.25±30.15**221.45±31.32#188.75±26.31##167.35±24.57##203.12±20.15##102.45±18.62

2.3 補(bǔ)脾益腸丸促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)由表4可知，模型組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1的mRNA 水平及濃度均明顯低于空白對照組（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組及美沙拉嗪組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的IL-10 和TGF-β1 的mRNA 水平及濃度均明顯上升（P＜0.01），且中、高劑量補(bǔ)脾益腸丸組及美沙拉嗪組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的IL-35 的mRNA 水平及濃度均明顯上升（P＜0.01）。這些結(jié)果表明補(bǔ)脾益腸丸可促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)。

表4 補(bǔ)脾益腸丸促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表4 補(bǔ)脾益腸丸促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組低劑量補(bǔ)脾益腸丸組中劑量補(bǔ)脾益腸丸組高劑量補(bǔ)脾益腸丸組美沙拉嗪組空白補(bǔ)脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH為內(nèi)參）濃度/（pg·mL-1）TGF-β1 75.23±9.36 20.11±3.56**26.36±3.89##35.51±4.22##40.56±5.87##38.44±5.21##80.23±10.95--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 IL-10 1.29±0.21 0.13±0.02**0.25±0.03##0.38±0.04##0.52±0.06##0.62±0.07##1.57±0.36 IL-35 1.15±0.19 0.31±0.04**0.35±0.05 0.48±0.04##0.67±0.11##0.57±0.09##0.98±0.14 TGF-β1 0.97±0.22 0.26±0.05**0.47±0.06##0.61±0.11##0.77±0.14##0.52±0.09##1.24±0.21*IL-10 26.21±3.56 5.32±0.74**7.12±1.13##9.65±1.67##11.35±2.03##10.36±1.87##30.22±4.32 IL-35 1.53±0.22 0.55±0.08**0.61±0.09 0.85±0.12##0.93±0.19##0.89±0.15##1.39±0.21

2.4 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶基因表達(dá)結(jié)腸組織伴隨著糖酵解過度活化的能量代謝紊亂是結(jié)腸炎發(fā)病的典型特征之一[21]。見表5，與空白對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Pfkm、PEPCK2、Aldolase A 和PKM2的mRNA 水平明顯上升（P＜0.01）。高劑量補(bǔ)脾益腸丸給藥處理后明顯降低了Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A和PKM2的mRNA水平（P＜0.01）。

表5 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶基因的表達(dá)（±s，n=6）Table 5 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic metabolic kinase gene in colitis mice（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組高劑量補(bǔ)脾益腸丸組空白補(bǔ)脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）mRNA的相對表達(dá)量PKM2 1.13±0.17 4.87±0.67**2.14±0.41##1.23±0.26--6.0 6.0 Glut1 1.05±0.15 4.52±1.32**1.47±0.23##0.89±0.22 Glut2 1.22±0.20 6.08±0.66**1.81±0.29##1.42±0.33 Glut4 0.95±0.17 21.35±3.05**3.87±0.48##1.32±0.41 HK2 1.13±0.26 11.32±2.53**3.95±0.42##2.87±0.61**Pfkm 1.18±0.18 2.64±0.55**2.35±0.62 1.36±0.34 PEPCK2 1.13±0.21 3.44±0.94**2.66±0.89 0.93±0.21 Aldolase A 0.91±0.22 3.35±0.72**1.23±0.21##0.82±0.16

2.5 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達(dá)由圖3 及表6 可知，模型組結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中糖酵解激酶Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平明顯高于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01）；補(bǔ)脾益腸丸給藥處理后，高劑量補(bǔ)脾益腸丸組的Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平均明顯低于模型組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明補(bǔ)脾益腸丸可抑制DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠糖酵解途徑活化。

圖3 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達(dá)Figure 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase protein in colitis mice

表6 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達(dá)（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

表6 補(bǔ)脾益腸丸抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解激酶蛋白表達(dá)（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組高劑量補(bǔ)脾益腸丸組空白補(bǔ)脾益腸丸組劑量/（g·kg-1）以GAPDH為內(nèi)參的蛋白相對表達(dá)量PKM2 0.53±0.17 0.77±0.21*0.43±0.11##0.24±0.05**--6.0 6.0 Glut1 2.15±0.39 3.08±0.18**2.02±0.21##1.92±0.36 Glut2 0.38±0.04 0.95±0.28**0.33±0.04##0.36±0.03 Glut4 0.89±0.14 1.42±0.23**0.91±0.21##1.03±0.28 HK2 0.91±0.24 1.62±0.29**0.89±0.23##0.88±0.36 Aldolase A 1.58±0.19 2.54±0.31**1.35±0.17##1.42±1.20

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)辨證分型為大腸濕熱、肝郁脾虛、脾氣虛弱、脾腎陽虛等不同證型[22]。脾虛氣滯型潰瘍性結(jié)腸炎是由于脾胃氣虛導(dǎo)致中焦運(yùn)化失常，進(jìn)而引發(fā)痢疾和泄瀉；其患者出現(xiàn)的慢性腹瀉、黏液便或膿血便、腹痛、里急后重等癥狀呈慢性反復(fù)發(fā)作或持續(xù)性，并伴有神疲乏力、納谷不香、口淡不渴、舌淡胖大、苔白膩、脈緩弱等特征，屬于本虛標(biāo)實的證候[23]。補(bǔ)脾益腸丸常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎脾虛氣滯所致的泄瀉證候[6]。補(bǔ)脾益腸丸含內(nèi)外2層，外層以黃芪、黨參等七味益氣藥為主，針對腹瀉、神疲乏力等脾胃虛弱癥狀而專補(bǔ)脾氣；內(nèi)層以延胡索、赤石脂等八味行氣止瀉藥為主，針對泄瀉里急后重、下痢膿血等結(jié)腸炎典型癥狀而重在止瀉。在本研究中觀察到小鼠結(jié)腸炎癥狀出現(xiàn)了首發(fā)、緩解與復(fù)發(fā)，表現(xiàn)為小鼠精神狀態(tài)、腹瀉等癥狀及DAI評分由差轉(zhuǎn)好再轉(zhuǎn)差的現(xiàn)象，說明此模型具有復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎特征；而補(bǔ)脾益腸丸呈劑量賴性地有效緩解DSS誘導(dǎo)的實驗性結(jié)腸炎相關(guān)癥狀，明顯逆轉(zhuǎn)小鼠體質(zhì)量減輕、結(jié)腸長度縮短、結(jié)腸質(zhì)量增加、單位結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)上升及結(jié)腸黏膜組織損傷。美沙拉嗪是治療輕、中度潰瘍性結(jié)腸炎患者的首選藥物，也常作為陽性對照藥評估新型抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的療效[24]。我們發(fā)現(xiàn)高劑量補(bǔ)脾益腸丸對結(jié)腸炎小鼠的療效與陽性對照藥美沙拉嗪效果相近，進(jìn)一步展示了補(bǔ)脾益腸丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛力。

補(bǔ)脾益腸丸中，黃芪與黨參為君藥，黨參益氣健脾和胃，黃芪補(bǔ)中益氣，托毒排膿，養(yǎng)血生肌。白術(shù)、砂仁為臣藥，共助君藥健脾理氣，祛除因脾虛所致體內(nèi)濕停。肉桂、干姜溫中止痛，補(bǔ)骨脂溫補(bǔ)脾腎，白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血調(diào)血，延胡索、荔枝核、木香行氣止痛，符合治痢思想。赤石脂澀腸止瀉止血，防風(fēng)祛風(fēng)散濕，甘草調(diào)和諸藥。全方組方嚴(yán)謹(jǐn)，通過健脾和胃、補(bǔ)益氣血，調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，有效改善潰瘍性結(jié)腸炎引起的臨床癥狀。細(xì)胞因子風(fēng)暴是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的典型特征，表現(xiàn)為促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6過度分泌，而抗炎因子IL-10、IL-35、TGF-β1 低表達(dá)[25]。臨床研究[26]表明，靶向阻斷細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6），有助于緩解持續(xù)的結(jié)腸黏膜炎癥。黃芪、黨參的有效組分黃芪多糖、黨參多糖可有效抑制促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)[27-28]。本研究中，結(jié)腸炎小鼠經(jīng)補(bǔ)脾益腸丸口服給藥，結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6濃度呈劑量依賴性下降，而抗炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 呈劑量依賴性上升，表明補(bǔ)脾益腸丸可有效抑制結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

中醫(yī)認(rèn)為，脾主運(yùn)化水谷精微，是人體生化過程的基礎(chǔ)，而脾胃功能失調(diào)是潰瘍性結(jié)腸炎的主要病機(jī)之一?，F(xiàn)代生理學(xué)則認(rèn)為，能量代謝是一切生命活動的基礎(chǔ)。水谷作為能量的來源，通過新陳代謝轉(zhuǎn)化能量以維持人體的正常生命活動；而糖酵解是能量代謝中不可缺少的環(huán)節(jié)。單樣本基因組富集分析顯示，與健康對照組比較，IBD 腸道樣本中的糖酵解明顯升高[29]；腸道上皮細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)重編程，糖酵解代謝過度活化以維持慢性炎癥[30]。能量代謝重編程在慢性結(jié)腸炎的發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵性角色，特征為葡萄糖的極劇消耗，糖酵解的活性增強(qiáng)[31]，Glut、LDHA、PFK、PKM2 酶活性過度活化，炎性因子IL-6 高表達(dá)；并且能量代謝方式異常與活躍的黏膜炎癥密切相關(guān)[32]。研究[33-34]發(fā)現(xiàn)，在DSS 誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中，糖酵解關(guān)鍵酶HK2、LDHA、PFK、PKM2 表達(dá)升高，炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6等含量亦升高。臨床上小分子靶向干預(yù)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及糖酵解代謝關(guān)鍵激酶（包括Glut、HK、PKM2）能有效調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，表明干預(yù)能量代謝途徑是抑制腸道炎癥反應(yīng)的有效措施[35]。而中藥成分黃芪皂苷能明顯下調(diào)結(jié)腸炎小鼠有氧糖酵解途徑及LDH、Glut、HK2、c-Myc 蛋白表達(dá)，并減弱炎癥反應(yīng)[36]。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)脾益腸丸也能抑制結(jié)腸炎小鼠糖酵解代謝，表現(xiàn)為Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A 和PKM2 蛋白及基因表達(dá)水平明顯下降，炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)及含量被調(diào)節(jié)；而補(bǔ)脾益腸丸對正常小鼠的糖酵解代謝激酶表達(dá)及炎性細(xì)胞因子水平均無明顯影響，這表明糖酵解代謝途徑是補(bǔ)脾益腸丸抗結(jié)腸炎的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

綜上所述，補(bǔ)脾益腸丸對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有明顯的保護(hù)性作用。補(bǔ)脾益腸丸可明顯抑制結(jié)腸組織中促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達(dá)，且促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 表達(dá)，這與其抑制糖酵解信號通路密切相關(guān)。本研究闡釋了補(bǔ)脾益腸丸通過抑制糖酵解代謝通路抗結(jié)腸炎的作用機(jī)制，可為補(bǔ)脾益腸丸臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎提供科學(xué)依據(jù)。