絲素蛋白/聚左旋乳酸納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的制備及其性能

劉 蛟，陳韶娟，吳韶華

(青島大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，山東 青島 266071)

肌腱是連接肌肉和骨骼之間的軟組織，是肌肉骨骼系統(tǒng)的重要組成部分。肌腱損傷是常見的運(yùn)動型損傷，據(jù)統(tǒng)計，全球每年至少有3 000萬的肌腱損傷患者就醫(yī)[1-2]。原生肌腱是由結(jié)構(gòu)致密的纖維結(jié)締組織構(gòu)成，具有細(xì)胞含量低、成血管能力弱等缺陷，導(dǎo)致肌腱損傷后無法自我修復(fù)[3-4]，對于大尺度損傷的患者來說必須采用補(bǔ)片進(jìn)行輔助治療。

近年來，盡管人工肌腱補(bǔ)片的種類層出不窮，但當(dāng)前實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的人工肌腱補(bǔ)片均采用紡織技術(shù)加工而成。與其他技術(shù)相比，紡織構(gòu)型的肌腱補(bǔ)片具有三維可調(diào)的多孔結(jié)構(gòu)以及剛?cè)岵?jì)的力學(xué)特征，具備顯著的優(yōu)勢[5-6]。然而，傳統(tǒng)紡織結(jié)構(gòu)的肌腱補(bǔ)片仍存在許多缺點(diǎn)。例如：采用的紗線原料為聚酯纖維或碳纖維微米纖維紗線，植入人體后無法降解，容易引發(fā)炎癥，甚至誘發(fā)強(qiáng)烈的機(jī)體免疫反應(yīng)，長期使用具有致畸性和致癌性；此外，微米纖維結(jié)構(gòu)無法有效仿生原生肌腱細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠原蛋白纖維的納米尺度和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致補(bǔ)片的生物活性差，不利于細(xì)胞生長和新生組織再生。新型靜電紡納米纖維成紗技術(shù)所生產(chǎn)的納米纖維紗線具有更高的比表面積，且能夠有效仿生原生肌腱組織ECM膠原纖維的納米束狀多級結(jié)構(gòu)，更有利于細(xì)胞黏附和組織再生[7-8]。此外，在納米纖維成紗過程中，可選用生物可降解的高聚物材料，植入體內(nèi)后伴隨肌腱組織的再生慢慢降解，最終通過新陳代謝排出體外，不會對機(jī)體造成安全隱患[9]。

目前，經(jīng)美國食品與藥品監(jiān)督局(FDA)認(rèn)可的可生物降解高聚物，主要包括聚左旋乳酸(PLLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)和聚對二氧環(huán)己酮(PPDO)等[10-11]。此外，為進(jìn)一步提高細(xì)胞在材料表面的黏附性，可添加一些生物活性高的天然高聚物，如明膠、膠原、殼聚糖以及絲素蛋白(SF)等[12]。基于此，本文通過自主研發(fā)的靜電紡納米纖維成紗技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)紡織機(jī)織工藝，設(shè)計并研發(fā)了幾款可生物吸收的納米結(jié)構(gòu)肌腱補(bǔ)片。以 4種不同SF/PLLA配比的納米纖維紗線為主體材料，以傳統(tǒng)PLLA微米纖維紗線為輔助材料，采用機(jī)織工藝制備了4種不同的肌腱補(bǔ)片，對其形貌、結(jié)構(gòu)、理化性能以及生物性能進(jìn)行測試與分析，為今后可吸收納米結(jié)構(gòu)人工肌腱補(bǔ)片的設(shè)計、研發(fā)以及臨床應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

聚左旋乳酸(PLLA，相對分子質(zhì)量為1×105)，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；六氟異丙醇(HFIP)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PLLA微米纖維紗線(線密度為100 dtex(75 f))，青島叒米科技有限公司；桑蠶繭，青島盛天義商貿(mào)公司；無水碳酸鈉(Na2CO3)、溴化鋰(LiBr)、酒精，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、噻唑藍(lán)溶液(MTT)、二甲基亞砜溶液(DMSO)，索萊寶生物科技有限公司；低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素(P/S)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；鬼筆環(huán)肽染液，上海翎圣生物科技有限公司；Draq5染液，美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 絲素蛋白制備

用剪刀將桑蠶繭剪成硬幣大小狀，稱取桑蠶繭片加入含有0.02 mol/L Na2CO3的溶液中沸煮30 min，使之脫膠；然后，用玻璃棒攪拌并于清水中洗滌3次，置于通風(fēng)櫥中過夜晾干。將配制好的9.3 mol/L的LiBr溶液倒進(jìn)干燥的脫膠蠶絲中，然后于60 ℃溶解4 h，之后將完全溶解的蠶絲溶液于4 ℃離心機(jī)中離心去除雜質(zhì)，再于室溫下透析3 d，于-20 ℃冰箱中冷凍過夜，最后在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥2 d，獲得海綿狀絲素蛋白(SF)。

1.3 SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片制備

SF/PLLA紡絲液配制：按照質(zhì)量比為0∶100、20∶80、35∶65和50∶50分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的SF和PLLA，然后溶于HFIP中配制0.1 g/mL的聚合物溶液，于室溫在磁力攪拌器上攪拌過夜，獲得均勻的共混紡絲液。

SF/PLLA納米纖維紗線的制備：將配制好的紡絲液靜置30 min，然后采用自制的靜電紡納米纖維成紗牽伸一體機(jī)紡制納米纖維紗線[13]。負(fù)載共混紡絲液的雙噴頭電壓設(shè)置為±12 kV，2個噴頭間距離為20 cm，紡絲液流速為0.8 mL/h，利用金屬圓盤和空心金屬棒(間距為10 cm)收集2個噴頭噴出的納米纖維，金屬圓盤旋轉(zhuǎn)(250 r/min)將納米纖維加工成紗線，然后經(jīng)由初紗輥送入熱牽伸裝置(溫度為80 ℃)，經(jīng)1倍牽伸后獲得納米纖維紗線并卷繞在輥筒上。

SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的制備：以PLLA微米纖維紗線為經(jīng)紗，自制的不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線作為緯紗，在SGA598型半自動織布小樣機(jī)上織造成布，經(jīng)密為120 根/(10 cm)，緯密為260 根/(10 cm)。采用熱刀裁剪獲得4種不同材質(zhì)的肌腱補(bǔ)片，補(bǔ)片縱向?yàn)榭椢锞暭喎较?，補(bǔ)片橫向?yàn)榭椢锝?jīng)紗方向。

1.4 形貌觀察

采用VEGA3型掃描電子顯微鏡(SEM)對4種補(bǔ)片的形貌進(jìn)行觀察，觀察前利用小型離子濺射儀進(jìn)行噴金處理，加速電壓為10 kV，工作距離為10 mm。

1.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

采用5225 Verona RD型傅里葉變換紅外光譜儀對4種補(bǔ)片的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行分析，分辨率為4 cm-1，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.6 晶體結(jié)構(gòu)測試

采用Ultima IV型廣角X射線衍射儀對4種補(bǔ)片的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，掃描范圍(2θ)為5°～45°，掃描速度為5 (°)/min，掃描電壓為40 kV，電流為40 A。

1.7 拉伸力學(xué)性能測試

用數(shù)顯千分尺對4種補(bǔ)片的厚度進(jìn)行測量，精度為0.001 mm。沿補(bǔ)片縱向裁取40 mm×20 mm(長×寬)的樣品，采用Instron-3300型單軸拉伸強(qiáng)力儀進(jìn)行拉伸力學(xué)性能測試，每組分別測試5個樣品，取平均值作為測試結(jié)果。實(shí)驗(yàn)夾持距離為20 mm，拉伸速度為120 mm/min，預(yù)加張力為1 N。

1.8 體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

樣品準(zhǔn)備：將樣品裁剪成半徑約為3.5 mm的圓片狀，在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行紫外光照射滅菌，樣品正反面各照射2 h，然后用70%酒精浸泡過夜，用滅菌的PBS緩沖溶液洗滌3次，最后放入細(xì)胞培養(yǎng)基中浸泡過夜。

細(xì)胞培養(yǎng)及接種：選取人的跟腱細(xì)胞為模型細(xì)胞對補(bǔ)片的細(xì)胞相容性進(jìn)行測試，培養(yǎng)基主體是DMEM，含有10%的FBS和1%的P/S。按照密度為1×105個/圓片將細(xì)胞接種到樣品上。實(shí)驗(yàn)過程中每2 d更換1次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)7 d。

1.8.1 鬼筆環(huán)肽染色

細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時，對接種細(xì)胞的樣品進(jìn)行固定、透膜、封閉后，在避光條件下，采用鬼筆環(huán)肽染液對細(xì)胞骨架蛋白(F-actin)染色2 h，然后用Draq5染液對細(xì)胞核(Nuclei)染色30 min，最后利用Zeiss 900 CLSM型激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察染色情況。

1.8.2 細(xì)胞黏附性能測試

細(xì)胞培養(yǎng)至第7 天時，將接種細(xì)胞的樣品固定后，于30%、50%、70%、80%、90%、100%的梯度酒精中分別脫水5 min，于40 ℃干燥箱中干燥過夜，噴金90 s后通過SEM觀察細(xì)胞在樣品表面的黏附情況。

1.8.3 MTT增殖實(shí)驗(yàn)

接種細(xì)胞的樣品培養(yǎng)至第1、3、7 天時，通過MTT實(shí)驗(yàn)測試細(xì)胞的增殖活性。避光條件下，將5 mg/mL MTT溶液加入接種細(xì)胞的樣品中孵育4 h后，先將MTT溶液吸出棄掉后再加入DMSO溶液，在脫色搖床上使得細(xì)胞中生成的藍(lán)紫色結(jié)晶——甲瓚(Formazan)完全溶解，然后吸取甲瓚/DMSO溶液置于96孔板中，于Infinite M Nano型酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。每組樣品每個時間節(jié)點(diǎn)分別設(shè)置5組對照樣，用吸光度值定量表征細(xì)胞在樣品上隨著時間增加的生長和增殖情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌腱補(bǔ)片的形貌結(jié)構(gòu)

圖1示出4種不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片及其內(nèi)部納米纖維紗線和納米纖維的電鏡照片。可知：4種肌腱補(bǔ)片均由納米纖維紗線和微米纖維紗線交織而成，紗線之間構(gòu)成明顯的孔隙；4種SF/PLLA納米纖維紗線表面光滑且無雜絲；納米纖維連續(xù)分布無斷裂點(diǎn)，縱向分布均勻，取向度較高。

圖1 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 SEM images of nanofiber yarns-based tendon patches with different SF/PLLA mass ratios

圖2示出4種SF/PLLA紗線內(nèi)部納米纖維的直徑分布直方圖。可知，質(zhì)量比為0∶100、20∶80、35∶65和50∶50的SF/PLLA納米纖維的平均直徑分別為(477±226)、(421±132)、(336±115)、(281±129) nm，即隨著SF占比的增加，納米纖維直徑逐漸變細(xì)。這是由于在靜電紡絲過程中，SF的添加導(dǎo)致紡絲液電導(dǎo)率增加，從而提高了射流的牽伸程度，致使最終獲得的纖維直徑變小[14-15]。以橫軸為基準(zhǔn)，取垂直于橫軸逆時針方向的角度為納米纖維取向度，測試結(jié)果如圖3所示。可知，4種納米纖維的取向度均集中分布在75°～105°之間，分布頻率分別為94%、84%、88%、70%，說明4種納米纖維均具有較高的取向度，這得益于較低的成紗捻度以及熱牽伸的牽伸作用[8]。

圖2 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片納米纖維直徑Fig.2 Nanofiber diameter of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

圖3 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片納米纖維取向度分布Fig.3 Orientation distribution of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.2 肌腱補(bǔ)片的分子基團(tuán)及結(jié)晶結(jié)構(gòu)

圖4 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片F(xiàn)T-IR和XRD曲線Fig.4 FT-IR (a) and XRD (b) curves of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的X射線衍射光譜曲線如圖4(b)所示?？芍琒F/PLLA納米纖維肌腱補(bǔ)片均在約16.4°附近出現(xiàn)細(xì)而高的衍射峰，對應(yīng)著PLLA晶型中α′晶體的衍射峰(110)/(200)；隨著SF占比的增加，衍射峰的強(qiáng)度逐漸變?nèi)?。由于熱牽伸過程中的處理溫度(80 ℃)高于PLLA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，致使PLLA內(nèi)部雜亂排列的晶體開始滑移，牽伸作用導(dǎo)致晶體取向排列轉(zhuǎn)變?yōu)槿∠颚痢渚w，取向排列的α′晶體的出現(xiàn)致使紗線的結(jié)晶衍射峰強(qiáng)度增加[17-18]。然而，SF的添加會抑制晶體在熱處理過程中的取向排列[19]，且隨著SF占比的增加，抑制作用增強(qiáng)，導(dǎo)致PLLA晶型中α′晶體結(jié)晶能力變?nèi)?，衍射峰?qiáng)度變低。

2.3 肌腱補(bǔ)片的拉伸力學(xué)性能

4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片縱向的載荷-伸長曲線如圖5所示，相關(guān)力學(xué)性能指標(biāo)計算結(jié)果見表1。從圖5可以看出，4種肌腱補(bǔ)片的載荷-伸長曲線具有相似的拉伸變形過程。在拉伸起始階段，經(jīng)歷了微弱的腳趾區(qū)(toe)后，進(jìn)入線性彈性階段，緊接著經(jīng)過非彈性變形直至拉伸至斷裂。由表1可以看出，斷裂載荷隨著SF占比增加呈現(xiàn)出逐漸減小的趨勢，但均高于100 N；其中SF與PLLA質(zhì)量比為0∶100和20∶80的納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的斷裂載荷甚至能達(dá)到200 N以上，滿足組織再生所需的力學(xué)性能要求[2]。與此同時，肌腱補(bǔ)片的斷裂強(qiáng)度和初始模量也均隨著SF占比增加呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，這與X射線衍射光譜圖的變化趨勢具有一致性，主要是由于SF的增加抑制了PLLA內(nèi)部取向排列α′晶體的形成，從而導(dǎo)致力學(xué)性能逐漸下降。

圖5 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片載荷-伸長曲線Fig.5 Load-elongation curves of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

表1 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片力學(xué)性能Tab.1 Mechanical properties of SF/PLLA nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.4 細(xì)胞在肌腱補(bǔ)片上的鬼筆環(huán)肽染色

將人的跟腱細(xì)胞分別在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片上培養(yǎng)7 d后，其細(xì)胞核(Nuclei)-細(xì)胞骨架蛋白(F-actin)熒光照片如圖6所示?？煽闯觯杭?xì)胞核均較大，呈現(xiàn)圓形或橢圓狀，表明所制備的肌腱補(bǔ)片無毒且有利于細(xì)胞生長；細(xì)胞骨架沿著纖維取向方向生長并幾乎覆蓋了整個肌腱補(bǔ)片，表明所制備的肌腱補(bǔ)片具有良好的生物相容性，有利于細(xì)胞黏附和生長。此外，添加SF的肌腱補(bǔ)片相較于未添加SF的肌腱補(bǔ)片具有更多的細(xì)胞，且隨著SF占比增加，細(xì)胞骨架覆蓋的面積更多，這表明SF有利于促進(jìn)細(xì)胞的黏附和生長。

圖6 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片鬼筆環(huán)肽染色照片F(xiàn)ig.6 Phalloidin staining images of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.5 細(xì)胞在肌腱補(bǔ)片上的黏附圖像

將人的跟腱細(xì)胞分別在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片上培養(yǎng)7 d，其細(xì)胞黏附掃描電鏡照片如圖7所示?？梢杂^察到，細(xì)胞均能在4種肌腱補(bǔ)片上黏附生長，并且細(xì)胞幾乎覆蓋了整根納米纖維紗線。

圖7 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片細(xì)胞黏附掃描電鏡照片F(xiàn)ig.7 Cell adhesion SEM images of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

2.6 細(xì)胞在肌腱補(bǔ)片上的增殖活性

將人的跟腱細(xì)胞在4種SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片上分別培養(yǎng)1、3和7 d，其細(xì)胞增殖情況如圖8所示?？煽闯?，隨著培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞在肌腱補(bǔ)片上的吸光度值逐漸增加，表明細(xì)胞逐漸增殖。同時，采用Scheffé 事后檢驗(yàn)對比分析了不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線基肌腱補(bǔ)片的增殖活性。結(jié)果表明：隨著SF占比的增加，肌腱補(bǔ)片的吸光度值呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時，50∶50肌腱補(bǔ)片相較于0∶100和20∶80肌腱補(bǔ)片，呈現(xiàn)出顯著性增殖；培養(yǎng)至第7 天時，50∶50肌腱補(bǔ)片相較于0∶100和20∶80肌腱補(bǔ)片進(jìn)一步呈現(xiàn)出顯著性差異，35∶65肌腱補(bǔ)片相較于0∶100和20∶80肌腱補(bǔ)片也呈現(xiàn)出顯著性增殖。

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。圖8 不同質(zhì)量比SF/PLLA納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片的吸光度Fig.8 Absorbance values of nanofiber yarns-based tendon patches with diverse SF/PLLA mass ratios

3 結(jié) 論

本文利用靜電紡紗結(jié)合機(jī)織工藝共制備了0∶100、20∶80、35∶65、50∶50質(zhì)量比的絲素蛋白/聚左旋乳酸(SF/PLLA)納米纖維紗線肌腱補(bǔ)片，研究了SF和PLLA質(zhì)量比對補(bǔ)片形態(tài)結(jié)構(gòu)、理化性能以及生物性能的影響。結(jié)果表明：隨著SF占比增加，肌腱補(bǔ)片中紗線內(nèi)部納米纖維的平均直徑逐漸減小，納米纖維取向度均集中分布在75°～105°之間，呈現(xiàn)出較高的取向度；肌腱補(bǔ)片均在16.4°附近出現(xiàn)了結(jié)晶衍射峰，且隨著SF占比增加，結(jié)晶衍射峰的強(qiáng)度逐漸降低；斷裂載荷、斷裂強(qiáng)度、初始模量也均隨著SF占比的增加逐漸降低，但4種肌腱補(bǔ)片的斷裂載荷均在100 N以上，能夠滿足組織再生所需的力學(xué)性能要求，其中0∶100和20∶80肌腱補(bǔ)片的斷裂載荷甚至達(dá)到200 N以上。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，人的跟腱細(xì)胞能夠在4種肌腱補(bǔ)片上黏附、生長并增殖，細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間的增加而逐漸增多；此外，細(xì)胞數(shù)量隨著SF占比的增加而逐漸增加，表明肌腱補(bǔ)片能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖。

本文以納米纖維紗線代替?zhèn)鹘y(tǒng)用微米纖維紗線制備的可生物吸收納米結(jié)構(gòu)肌腱補(bǔ)片，具有較高的取向度，較強(qiáng)的力學(xué)性能以及促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖的能力，從而有利于受損肌腱的組織再生與功能重建，為未來人工肌腱的性能優(yōu)化以及臨床應(yīng)用提供一定的參考。

FZXB