沙棘果汁對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲(chóng)作用效果研究*

劉思凡 楊津仲 楊雯 劉君

（海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)教研室，海南 ?？?571199）

陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis）是全球最常見(jiàn)的非病毒性性傳播疾病的病原，可感染人體泌尿生殖系統(tǒng)，多數(shù)感染者不會(huì)呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀，甚至沒(méi)有癥狀而呈帶蟲(chóng)狀態(tài)，但感染后可引起非典型性盆腔炎、受精率降低、早產(chǎn)、新生兒體質(zhì)量偏低，罹患前列腺癌和宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加及感染HIV 等病原體的感染幾率上升[1-3]，是一種不容忽視的寄生蟲(chóng)。陰道毛滴蟲(chóng)對(duì)臨床常用的藥物甲硝唑產(chǎn)生抗藥現(xiàn)象被廣泛報(bào)道[4]，需要尋找其他有效的藥物進(jìn)行治療。

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）隸屬胡頹子科沙棘屬，主要分布在中國(guó)、印度等，是種富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的藥食兩用植物[5,6]，它的果實(shí)、種子、葉片及其提取物均可入藥，含有多種維生素、脂類、酚類化合物、類胡蘿卜素、生育酚和植物甾醇等藥用成分[7]，種子和漿果油可用于預(yù)防和治療胃潰瘍[8]、心血管疾病[9]、特應(yīng)性皮炎[10]和抗抑郁[11]等，沙棘果粉[12]及沙棘油[13]已被證實(shí)對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)具有殺滅作用，但尚無(wú)沙棘果汁的相關(guān)研究，本文旨在研究沙棘果汁對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲(chóng)的殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙棘本研究所用的沙棘果實(shí)采摘于新疆伊犁天山峽谷野生沙棘林，經(jīng)鑒定該沙棘種類為中亞沙棘[14]。據(jù)其果實(shí)的成熟程度將其分為成熟組和未成熟組2 組。

1.1.2 陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)株實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)株為陰道毛滴蟲(chóng)臨床分離株，經(jīng)藥敏檢測(cè)為甲硝唑敏感株。

1.1.3 主要儀器和試劑GHP9050 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（OLYMPUS）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone）；小牛血清（四季青）；甲苯胺藍(lán)（上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠）；血球計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)管；臺(tái)式低速離心機(jī)（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；青鏈霉素雙抗（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 沙棘果汁的制備沙棘果實(shí)采摘后經(jīng)挑選，除去破損變質(zhì)的果實(shí)及葉片、果梗等雜質(zhì)，流水沖洗后晾干表面水分，用榨汁機(jī)將其果汁榨出，經(jīng)濾紙過(guò)濾，制得沙棘果汁的原汁，保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 陰道毛滴蟲(chóng)的體外培養(yǎng)將陰道分泌物中分離的蟲(chóng)株接種至RPMI-1640 培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)，待蟲(chóng)體密度達(dá)到一定密度時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 蟲(chóng)體死活的鑒定以甲苯胺藍(lán)染液作為指示劑，在顯微鏡下可觀察到活蟲(chóng)不被著色，死蟲(chóng)被染成藍(lán)色。

1.2.4 沙棘果汁作用部位將純的沙棘果汁與陰道毛滴蟲(chóng)按一定比例混合至果汁終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%，滴加50 μL混合液與1 μL 5%的甲苯胺藍(lán)染液迅速混勻，鏡下觀察，計(jì)時(shí)，重復(fù)3 次。對(duì)死亡的蟲(chóng)體進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡觀察從而判斷沙棘果汁作用部位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)GraphPad.Prism（V8，GraphPad Software Inc，Califonia，http://www.graphpad.com）作圖，分析采用F檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度、不同成熟度的沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)體外殺滅效果不論是成熟組的還是未成熟組的沙棘果汁，對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲(chóng)致死時(shí)間均隨著濃度的升高而降低（見(jiàn)圖1）。成熟組內(nèi)不同濃度的沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)的殺滅時(shí)間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=57.73，R2=0.9665），未成熟組內(nèi)對(duì)應(yīng)濃度殺滅陰道毛滴蟲(chóng)的時(shí)間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=163.3，R2=0.9879）；成熟組與未成熟組殺滅陰道毛滴蟲(chóng)的時(shí)間長(zhǎng)短差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001，F(xiàn)=776.9，R2=0.9974）。

圖1 不同濃度不同成熟度的沙棘果汁體外殺滅陰道毛滴蟲(chóng)的時(shí)間

2.2 沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)作用部位的研究通過(guò)對(duì)沙棘果汁作用后的陰道毛滴蟲(chóng)進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡觀察，電鏡圖像顯示，在陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)體表面出現(xiàn)大量的孔洞，而內(nèi)部細(xì)胞器、食物泡及細(xì)胞核等的膜則完好無(wú)損，這說(shuō)明沙棘果汁主要是通過(guò)破壞蟲(chóng)體表面細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)外溢引起蟲(chóng)體的死亡（見(jiàn)圖2）。

圖2 電鏡下的沙棘果汁殺滅的陰道毛滴蟲(chóng)

3 討論

1837 年人們發(fā)現(xiàn)并命名了陰道毛滴蟲(chóng)，長(zhǎng)期以來(lái)由于這種寄生蟲(chóng)是單細(xì)胞生物且個(gè)體小不易被檢獲，并且大多數(shù)感染者并不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此導(dǎo)致它對(duì)人類的危害被忽視[15]。雖然1959 年甲硝唑便開(kāi)始在臨床上用于治療滴蟲(chóng)病[16]，但WHO 在1990 年才推薦其為治療陰道毛滴蟲(chóng)病的首選藥物，這種藥物具有使用方便、價(jià)格低廉、療效顯著等特點(diǎn)。然而在1962 年就開(kāi)始出現(xiàn)臨床治療陰道毛滴蟲(chóng)失敗的報(bào)道[17]。除此之外，在臨床上使用的藥物還包括奧硝唑、替硝唑等硝唑咪唑類藥物，但因?yàn)? 種藥物均為咪唑類藥物，對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)殺滅機(jī)制及對(duì)人體的毒副作用相似，因此人們一直都在尋找高效低毒的有效藥物以防治滴蟲(chóng)病。目前已有多種植物及其產(chǎn)物，如植物的根、莖、花、葉的浸出液或提取物等，及人工合成半合成的化合物用于研究殺滅陰道毛滴蟲(chóng)，包括小檗屬、小葉木屬、毛竹屬、毛竹屬、南竹屬、白屈菜屬、延胡索屬和血根屬[18]等。

沙棘在我國(guó)分布廣泛，不僅起到水土保護(hù)、防治風(fēng)沙的作用，并且沙棘植物本身的食用及醫(yī)用價(jià)值大。沙棘葉、沙棘果、沙棘油等被人們用來(lái)治療各種疾病的歷史悠久，在婦科方面沙棘油被用以治療宮頸糜爛，且效果較好，而沙棘籽油栓單用或聯(lián)合其他藥物用以治療滴蟲(chóng)性陰道炎效果較好[19]，但沙棘油在提煉的過(guò)程中因工藝復(fù)雜、成本高，被稱為植物黃金，并且其成分復(fù)雜，分離提純難，因此在目前工藝下沙棘油在臨床上運(yùn)用受到制約。

在本研究中，采用沙棘果汁對(duì)體外培養(yǎng)的陰道毛滴蟲(chóng)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明高濃度的成熟沙棘果汁對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)具有明顯的殺滅作用，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道中沙棘果粉對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)具有殺滅作用的定論一致，然而，在其報(bào)道中[12]觀察到死亡的陰道毛滴蟲(chóng)細(xì)胞碎片，在本研究中并未觀察到陰道毛滴蟲(chóng)的碎片，并通過(guò)對(duì)殺滅的陰道毛滴蟲(chóng)做掃描電鏡和透射電鏡，圖像顯示陰道毛滴蟲(chóng)的表面出現(xiàn)了大量的細(xì)胞孔洞，而蟲(chóng)體內(nèi)部的細(xì)胞器、食物泡、細(xì)胞核等膜結(jié)構(gòu)完整，因此沙棘果汁確實(shí)是通過(guò)破壞陰道毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來(lái)殺滅陰道毛滴蟲(chóng)。通過(guò)果粉與果汁2 種不同狀態(tài)的沙棘果實(shí)在體外作用于陰道毛滴蟲(chóng)，證明果粉效果要優(yōu)于果汁，并且果粉在儲(chǔ)備、運(yùn)輸、貯藏、除菌等方面更優(yōu)于果汁，因此可為未來(lái)臨床上防治陰道毛滴蟲(chóng)提供理論依據(jù)及治療選擇。