黃芪桂枝五物湯不同劑量治療糖尿病周圍神經(jīng)病變量效關(guān)系及對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的影響

劉曼曼,馮珍鳳,姜 健,高俊鳳,陳見紡,胡春平,嚴(yán) 軍

(1.上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201899；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，在新診斷以及病程較長(zhǎng)的糖尿病患者中其發(fā)病率分別高達(dá)8%和53%[1]。目前DPN的發(fā)病機(jī)制尚未明了，已證實(shí)的病理變化包括軸突萎縮、脫髓鞘、神經(jīng)纖維喪失及神經(jīng)再生障礙[2]。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，在神經(jīng)管的形成、背根神經(jīng)節(jié)及中腦的發(fā)育中有重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路有影響，而信號(hào)通路的失調(diào)又會(huì)進(jìn)一步加重代謝紊亂[4]。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腹腔注射Wnt信號(hào)通路激活劑可以激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)髓鞘再生和軸突再生，有利于糖尿病小鼠潰瘍愈合[5]。因此推測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可能在DPN受損神經(jīng)修復(fù)方面可能發(fā)揮重要作用。近年來，中醫(yī)藥治療DPN顯示出一定優(yōu)勢(shì)。黃芪桂枝五物湯源于漢代名醫(yī)張仲景撰著《傷寒雜病論》，后記載于《金匱要略》治療血痹病，原著認(rèn)為該病本在“陰陽俱微”，標(biāo)在“加被微風(fēng)”，病在血脈，氣血兩虧，經(jīng)血遲滯難行，肌表失營(yíng)，遂見“外證身體不仁”，治當(dāng)扶正以祛邪，溫經(jīng)而通脈，表現(xiàn)與DPN臨床表現(xiàn)相符，為治療糖尿病慢性并發(fā)癥的名方、經(jīng)方。大量研究證實(shí)，黃芪桂枝五物湯治療DPN的療效滿意[6-8]，但是多為基于原方基礎(chǔ)上化裁加減的研究，且對(duì)本方量效、藥效深入研究少見。因此本研究以《金匱要略》中黃芪桂枝五物湯原方比例為正常劑量、0.5倍正常劑量為低劑量、1.5倍正常劑量為高劑量干預(yù)DNP患者，并以經(jīng)典Wnt信號(hào)通路為核心，探討不同劑量黃芪桂枝五物湯治療DPN的量效關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合《中國(guó)糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中DPN的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②中醫(yī)辨證參考《糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)臨床診療指南(2016 年版)》[10]屬于氣虛血瘀證；③年齡≥18歲，近3個(gè)月血糖控制平穩(wěn)，糖化血紅蛋白(HbA1c)≤7.5%；④患者對(duì)本研究知情和同意。

1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 伴嚴(yán)重心肝腎功能異常者；伴免疫系統(tǒng)疾病者；伴急慢性感染者。

1.3一般資料 選取2018年4月—2020年12月嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治且符合上述標(biāo)準(zhǔn)的120例DPN患者進(jìn)行研究，研究方案經(jīng)嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理審查(006號(hào))通過。納入者血糖穩(wěn)定后，按SAS V9.0軟件編制隨機(jī)安排表分為甲鈷胺組、中藥低劑量組、中藥正常劑量組、中藥高劑量組，每組30例，4組患者基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者性別、年齡、病程比較

1.4治療方法 甲鈷胺組給予甲鈷胺片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052325，規(guī)格：0.5 mg×20片)口服，0.5 mg/次，3 次/d，持續(xù)治療12周。中藥正常劑量組給予正常劑量黃芪桂枝五物湯口服，即黃芪15 g、白芍15 g、桂枝15 g、生姜30 g、大棗4枚，黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗比例為1∶1∶1∶2∶1.5；中藥低劑量組給予0.5倍正常劑量黃芪桂枝五物湯口服；中藥高劑量組給予1.5倍正常劑量黃芪桂枝五物湯口服；中藥由嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一煎制，1劑取汁450 mL，150 mL/包，三餐后30 min各服1包，持續(xù)治療12周。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1糖代謝指標(biāo) 治療前后取4組患者靜脈血，檢測(cè)空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPG)、HbA1c。

1.5.2多倫多臨床神經(jīng)病變?cè)u(píng)分量表(TCSS)評(píng)分 TCSS量表包括神經(jīng)癥狀6項(xiàng)(下肢麻木、疼痛、針刺樣感覺、乏力、走路不穩(wěn)及上肢相似癥狀)、神經(jīng)感覺5項(xiàng)(刺痛覺、溫度覺、觸壓覺、振動(dòng)覺、位置覺)、神經(jīng)反射2項(xiàng)(踝反射及膝反射)[11]。神經(jīng)癥狀：正常計(jì)0分，存在相應(yīng)癥狀計(jì)1分，共 6 分；神經(jīng)感覺：正常計(jì)0分，異常計(jì)1分，共5分；神經(jīng)反射：雙側(cè)均計(jì)分正常計(jì)0 分，減弱計(jì)1分，消失計(jì)2分，共8分。治療前后各評(píng)定1次，評(píng)分越低表示病變?cè)捷p。

1.5.3中醫(yī)癥狀積分 主癥包括足麻木，如有蟻行，肢末時(shí)痛，多呈刺痛，下肢為主，入夜痛甚，神疲倦怠，按癥狀無、輕、重，每項(xiàng)計(jì)0，2，4 分；次癥包括氣短懶言，腰腿酸軟，或面色白，自汗畏風(fēng)，易于感冒，腹瀉或便秘，按無、輕、重，每項(xiàng)計(jì)0，1，2 分[10，12]。治療前后各評(píng)定1次，評(píng)分越低表示癥狀越輕。

1.5.4神經(jīng)傳導(dǎo)速度 治療前后采用RTH861 型數(shù)字心腦肌電圖儀(德國(guó)Merck 公司)檢測(cè)4組患者腓總神經(jīng)、正中神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MNVC)及感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNVC)。

1.5.5血清中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1 mRNA表達(dá)量 利用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)：治療前后分別取4組患者清晨空腹靜脈血3 mL于惰性膠促凝管中，1 000 r/min離心(離心半徑95 mm)10 min，將上層血清分裝至RNaseEP管中，冰盒運(yùn)送，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用Trizol試劑提取RNA，按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，以β-actin為內(nèi)參基因，校正目標(biāo)基因的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出mRNA相關(guān)表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。上海東寰生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成研究所需引物，見表2。每個(gè)血樣按照HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作提取的mRNA，以β-actin為內(nèi)參基因，校正目標(biāo)基因的熒光強(qiáng)度，計(jì)算目標(biāo)基因/β-actin數(shù)值。

表2 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1引物序列

1.5.6臨床療效 治療12周后評(píng)估4組療效，并記錄達(dá)到顯效、有效的時(shí)間。參考《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[13]和《糖尿病中醫(yī)防治指南》[14]制定療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，顯效：臨床癥狀體征基本消失，神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快超過5 m/s和(或)中醫(yī)癥狀積分減少≥90%；有效：癥狀和體征明顯改善，神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快3～5 m/s和(或)中醫(yī)癥狀積分減少30%～90%；無效：癥狀和體征未見改善或明顯加重，神經(jīng)傳導(dǎo)速度無改善。

2 結(jié) 果

2.1糖代謝指標(biāo)比較 治療12周后，4組FPG、2hPG、HbA1c均明顯降低(P均<0.05)；治療后組間比較，中藥正常劑量組和中藥高劑量組FPG、2hPG、HbA1c均明顯低于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組與甲鈷胺組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者糖代謝指標(biāo)比較

2.2TCSS評(píng)分和中醫(yī)癥狀積分比較 治療12周后，4組TCSS評(píng)分(神經(jīng)癥狀、神經(jīng)感覺、神經(jīng)反射)和中醫(yī)癥狀積分均明顯降低(P均<0.05)；治療后組間比較，中藥正常劑量組和中藥高劑量組TCSS評(píng)分(神經(jīng)癥狀、神經(jīng)感覺、神經(jīng)反射)和中醫(yī)癥狀積分均明顯低于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組與甲鈷胺組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者TCSS評(píng)分和中醫(yī)癥狀積分比較分)

2.3腓總神經(jīng)和正中神經(jīng)MNVC及SNVC比較 治療12周后，4組腓總神經(jīng)和正中神經(jīng)的MNVC及SNVC均明顯加快(P均<0.05)；治療后組間比較，中藥正常劑量組和中藥高劑量組腓總神經(jīng)、正中神經(jīng)的MNVC及SNVC均明顯快于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組與甲鈷胺組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表5。

表5 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者腓總神經(jīng)、正中神經(jīng)MNVC及SNVC比較

2.4經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 治療12周后，4組血清中β-catenin、cyclinD1、c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，DKK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；治療后組間比較，中藥正常劑量組和中藥高劑量組血清中β-catenin、cyclinD1、c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于甲鈷胺組(P均<0.05)，DKK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組β-catenin、cyclinD1、c-myc、DKK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與甲鈷胺組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表6。

表6 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.5臨床療效比較 甲鈷胺組總有效率為63.3%，中藥低劑量組總有效率為66.7%，中藥正常劑量組總有效率為90.0%，中藥高劑量組總有效率為93.3%，中藥正常劑量組和中藥高劑量組總有效率均明顯高于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組與甲鈷胺組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者治療12周后臨床療效比較 例(%)

2.6達(dá)到顯效、有效時(shí)間比較 中藥正常劑量組、中藥高劑量組達(dá)到顯效、有效時(shí)間均明顯短于甲鈷胺組(P均<0.05)，中藥低劑量組達(dá)到顯效、有效時(shí)間與甲鈷胺組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表8。

表8 4組糖尿病周圍神經(jīng)病變患者達(dá)到顯效、有效時(shí)間比較

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，DPN的發(fā)病主要與代謝紊亂、免疫炎癥、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、神經(jīng)損傷再生障礙等相關(guān)[2]。隨著病情發(fā)展，DPN可導(dǎo)致足部潰瘍、壞疽，甚至截肢，給患者帶來巨大痛苦，故早期診治是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前西醫(yī)藥治療DPN方法有限。

DPN屬于中醫(yī)“消渴”和“痹證”范疇，因糖尿病日久，耗傷氣陰，陰陽氣血虧虛，血行瘀滯，脈絡(luò)痹阻所致，屬本虛標(biāo)實(shí)證。病位在肢體脈絡(luò)，所涉臟腑為肝、脾、腎等，以氣血虧虛為本，瘀血阻絡(luò)為標(biāo)[15]。黃芪桂枝五物湯具有益氣溫補(bǔ)經(jīng)絡(luò)、活血通痹之效，正中DNP發(fā)病病機(jī)，治療DNP效果突出。該方首載于仲景《金匱要略·血痹虛勞脈證并治篇》：“黃芪三兩、桂枝三兩、芍藥三兩、生姜六兩、大棗十二枚，以上五味，以水六升，煮取二升，溫服七合，日三服?！卑礉h代計(jì)量換算為現(xiàn)代劑量為黃芪45 g、桂枝45 g、白芍45 g、生姜90 g、大棗60 g(12枚)。方中黃芪為君藥益氣培本，補(bǔ)而兼升，補(bǔ)而兼行，善走肌表，氣為血母，又為血帥，補(bǔ)氣以養(yǎng)血，補(bǔ)氣以行血。桂枝色赤，專入營(yíng)血之分，性溫擅通，鼓舞氣血，正旺自可祛邪。芍藥酸甘養(yǎng)血，姜棗入脾胃，健中促運(yùn)，滋氣血生化之源。藥僅五味，專謀氣血，氣血旺則血脈通，氣血足則頑麻除。目前的臨床研究中該方劑用量多為在原方基礎(chǔ)上進(jìn)行藥味、劑量加減后形成處方，對(duì)其具體每日用量無相關(guān)醫(yī)家進(jìn)行整理研究。而中醫(yī)藥治療優(yōu)勢(shì)在于辨證論治，藥物劑量配伍是重要因素。仝小林院士曾在“理-法-方-藥”基礎(chǔ)上提出“量效”理論，但目前關(guān)于該方面的臨床標(biāo)準(zhǔn)化研究報(bào)道較少，大多應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，故對(duì)經(jīng)方、名方的經(jīng)典劑量配伍的傳承研究具有重要意義。

本課題組查閱大量古籍有關(guān)劑量研究，根據(jù)《后漢書·律歷志上》中記載用藥劑量“量者，龠、合、以量多少也。合龠為合，十合為升，十升為斗，十斗為斛，而五量嘉矣”，推算黃芪桂枝五物湯古籍中一日用量為黃芪三兩、桂枝三兩、芍藥三兩、生姜六兩、大棗十二枚藥量的7/20，因?yàn)槁圆?，故日三服，每次用量?/20再等分為三，故本研究中延用原方劑量取一日劑量的7/20為正常劑量，約等于黃芪15 g、白芍15 g、桂枝15 g、生姜30 g、大棗4枚，同時(shí)以1.5倍正常劑量為高劑量，以0.5倍正常劑量為低劑量。結(jié)果顯示，治療12周后，中藥各組FPG、2hPG、HbA1c及神經(jīng)癥狀、神經(jīng)感覺、神經(jīng)反射積分均明顯降低，肢體麻、涼、痛等癥狀均明顯改善，腓總神經(jīng)、正中神經(jīng)的MNVC及SNVC均明顯加快；且與甲鈷胺組比較，中藥正常劑量組和中藥高劑量組各指標(biāo)改善更明顯，治療總有效率更高，達(dá)到顯效、有效的時(shí)間更短。提示黃芪桂枝五物湯原方配伍比例可修復(fù)DPN患者的運(yùn)動(dòng)及感覺神經(jīng)功能，并在一定劑量范圍內(nèi)隨著劑量增大作用越明顯。

近年研究表明，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的相關(guān)基因表達(dá)在高糖環(huán)境下會(huì)發(fā)生變化，而信號(hào)通路的失調(diào)又會(huì)進(jìn)一步加重糖脂代謝紊亂，形成惡性循環(huán)[4]。趙亞男等[16]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，并導(dǎo)致了糖尿病潰瘍難以愈合。張珍等[17]給予DNP小鼠注射Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV-939，發(fā)現(xiàn)DNP小鼠經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因 β-catenin、c-myc、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)mRNA的表達(dá)量較模型組降低，因此推斷經(jīng)典Wnt信號(hào)通路受到抑制后會(huì)加重DNP。張珍[18]另一項(xiàng)研究顯示，相較于正常人，2型糖尿病及DPN 患者經(jīng)典Wnt通路下游基因 β-catenin、cyclinD1、c-myc表達(dá)量明顯降低，負(fù)性調(diào)控分子DKK1表達(dá)量明顯升高，提示經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路功能降低可能促進(jìn) DPN的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪桂枝五物湯可上調(diào)β-catenin、cyclinD1、c-cmyc mRNA表達(dá)，下調(diào)DKK1 mRNA表達(dá)，且正常劑量和高劑量調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于甲鈷胺。提示黃芪桂枝五物湯可能通過激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)纖維修復(fù)及再生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯在一定劑量范圍內(nèi)可明顯減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變氣虛血瘀證患者癥狀，改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能，修復(fù)周圍神經(jīng)，且療效呈劑量依賴性提高，其作用機(jī)制可能與激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路有關(guān)。但黃芪桂枝五物湯中不同的量效配伍關(guān)系及分子生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。