平喘顆粒對(duì)哮喘小鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路的影響

郅扶旻，李竹英，田春燕，徐洪濤

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是呼吸科常見和多發(fā)病之一，影響著全球3億多人健康[1]。我國(guó)是哮喘發(fā)病率較高的國(guó)家之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，在過(guò)去10年間14歲以上的人群哮喘患病率處于增高趨勢(shì)[2]，哮喘發(fā)病率升高而控制率較低是我國(guó)面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。哮喘是多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的最根本原因，與氣道重塑和氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)。近年多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，中藥在改善癥狀、減輕氣道炎癥及延長(zhǎng)發(fā)病時(shí)間方面有明顯優(yōu)勢(shì)。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科經(jīng)驗(yàn)方自制劑，前期研究證實(shí)該藥可降低Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子受體(CCR3)及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，可有效減輕哮喘氣道炎癥[3-6]。但研究的重點(diǎn)主要在受體蛋白、炎癥因子及趨化因子等方面，在通路機(jī)制方面研究較少。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)與哮喘炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)形成的關(guān)鍵通路，本研究從NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路著手，進(jìn)一步探討了平喘顆粒治療哮喘的可能機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性C57BL/6小鼠40只，體重(20±2)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、濕度(50±6)%的動(dòng)物房，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究嚴(yán)格遵守國(guó)家愛護(hù)動(dòng)物和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究的相關(guān)規(guī)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2藥物、試劑與儀器 平喘顆粒(由淫羊藿200 g、太子參150 g、黃芪150 g、五味子150 g、知母100 g、炙麻黃100 g、款冬花150 g、罌粟殼40 g、地龍100 g組成，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，10 g/袋，批號(hào)：20180723)，吸入用布地奈德混懸液(澳大利亞 Astia-zeneca PtyLtd，注冊(cè)證號(hào)H20140475)；卵蛋白(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：A5253)，氫氧化鋁佐劑(美國(guó)賽默飛公司，貨號(hào)：77161),HE染色試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：20181103)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-18(IL-18)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSB-E04639m，CSB-E04609m),SYBR Premix Ex Taq試劑盒和轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 Takara 公司，貨號(hào)：RR420，639503)；超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)：402AI)，組織包埋機(jī)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：TEC2800),石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，型號(hào)：RM2235)，電子顯微鏡(日本HITACHI，型號(hào)：Hitachi7180)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo，型號(hào)：Multiskan MK3),PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX96)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將40只健康雌性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、布地奈德及平喘顆粒組，每組10只。模型組、布地奈德組及平喘顆粒組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1，7，14天腹腔注射卵蛋白+氫氧化鋁混合液250 μL致敏，于第21天給予2%卵蛋白溶液進(jìn)行霧化激發(fā)，每次霧化30 min，每周持續(xù)5 d，連續(xù)激發(fā)6周。從致敏的前1 d開始，布地奈德組給予布地奈德混懸液0.5 mg/mL霧化吸入30 min，平喘顆粒組給予平喘顆粒藥液31.2 g/kg灌胃，空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃,均1次/d，連續(xù)干預(yù)4周。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.4.1肺組織HE染色 末次干預(yù)結(jié)束后，以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死小鼠，打開胸腔暴露肺組織，將右肺組織切塊后脫水，置于二甲苯和石蠟透明、包埋，將蠟塊切成5 μm的肺組織切片。將切片脫蠟，然后在蘇木精染色液中浸泡3 min，水洗后在伊紅染色液中浸泡3 min，酒精脫水至透明，然后封片置于顯微鏡下觀察染色情況。

1.4.2肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平 小鼠處死后仰臥位固定，分離主支氣管，打開胸腔暴露肺組織。結(jié)扎右主管，注射器抽取0.5 mL生理鹽水刺入主氣管，注入生理鹽水后回抽，以上操作進(jìn)行3次，共收取1.5 mL的肺泡灌洗液，然后離心收集上清液。按照ELISA試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平。

1.4.3肺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達(dá)量 采用RT-qPCR法檢測(cè)：按照提取試劑盒的步驟提取總RNA，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NLRP3引物：上游5’-CCAGATGGAGAAGGCAGATCACTTG-3’，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAGC-3’；Caspase-1引物：上游5’-TCTGTATTCACGCCCTGTTGGAAAG-3’，下游5’-CTCTTTGCCCTCAGGATCTTGTCAG-3’；IL-1β引物：上游5’-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3’，下游5’-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3’；β-actin引物: 上游5’-TGATGGGTGTGAACCACGAG-3’，下游5’-GCCCTTCCACAATGCCAAAG-3’。PCR的循環(huán)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s)×30個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔct計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn) 空白組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間隔水腫增厚；與模型組相比，布地奈德組及平喘顆粒組小鼠支氣管周圍及血管外周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 空白組和哮喘各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)

2.2各組小鼠肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平比較 模型組IL-6和IL-18水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；平喘顆粒組和布地奈德組IL-6和IL-18水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；平喘顆粒組IL-6水平明顯低于布地奈德組(P<0.05)，而IL-18水平明顯高于布地奈德組(P<0.05)。見表1。

表1 空白組和哮喘各組小鼠肺泡灌洗液中IL-6和IL-18水平比較

2.3各組小鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)；平喘顆粒組和布地奈德組NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)；平喘顆粒組NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于布地奈德組(P<0.05)，Caspase-1和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量與布地奈德組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

3 討 論

氣道炎癥是哮喘發(fā)作的病理基礎(chǔ),是哮喘出現(xiàn)臨床癥狀的重要原因，通過(guò)抑制氣道炎癥能夠有效減輕氣道高反應(yīng)性，達(dá)到并維持哮喘的臨床控制，改善肺通氣功能，降低急性發(fā)作頻率，提高患者生活質(zhì)量，最終降低病死率[7-8]。然而氣道炎癥作為呼吸系統(tǒng)疾病的常見致病因素，其病機(jī)研究尚未清晰，尚無(wú)有效治愈手段，故尋找治療的新思路、新靶點(diǎn)刻不容緩[9]。哮喘的發(fā)生與發(fā)展由多種炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞參與，各種損傷和病原體侵犯呼吸系統(tǒng)的第一道防御屏障是氣道上皮細(xì)胞，而哮喘患者氣道上皮細(xì)胞內(nèi)外皆有炎癥小體的不同程度表達(dá)[10]。

炎癥小體作為固有免疫的重要組成，在機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥性疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[11]。NLRP3炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)傳感器，參與固有免疫，在多種免疫細(xì)胞觸發(fā)下產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，參與哮喘慢性氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展[12-15]。Ather等[16]研究顯示，卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠血清淀粉樣蛋白A水平顯著升高，可直接激活NLRP3炎癥小體，加重哮喘癥狀。另外NLRP3可通過(guò)感知信號(hào)刺激并作為支架蛋白結(jié)合ASC，ASC招募并水解前體pro-caspase-1，形成具有酶活性效應(yīng)蛋白酶Caspase-1，然后導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子如pro-IL-1β裂解和成熟為其活性物質(zhì)IL-1β，以及下游炎癥因子IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素和白三烯等表達(dá)升高，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，參與哮喘發(fā)作[17-18]。樸藝花等[19]在亂蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)NLRP3的激活可誘導(dǎo)IL-1β、IL-18、IL-6呈高表達(dá)，NLRP3不僅可以誘發(fā)哮喘，還可以協(xié)同Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路進(jìn)一步加重氣道炎癥。IL-1β作為NLRP3炎癥小體的效應(yīng)物，是一種多能促炎因子，參與氣道炎癥，并在肺部炎癥發(fā)病中起關(guān)鍵作用[20]。Rincon等[21]研究表明，活動(dòng)性哮喘患者肺泡灌洗液中IL-6水平明顯升高。上述研究顯示，NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活參與了哮喘氣道炎癥的發(fā)生，故本研究認(rèn)為通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路可減輕哮喘氣道炎癥以及氣道高反應(yīng)性。平喘顆粒組方中淫羊藿、炙麻黃為君藥，共同發(fā)揮溫補(bǔ)肺腎二臟陽(yáng)氣之功，以達(dá)溫陽(yáng)平喘之效。太子參、黃芪補(bǔ)氣同時(shí)亦能生津，在助君藥溫陽(yáng)的同時(shí)又防止津液耗傷太過(guò)；五味子、款冬花、地龍斂肺止咳、化痰平喘，以上5味共為臣藥。罌粟殼酸澀收斂，斂肺止咳的同時(shí)助君藥斂久耗之肺氣，用為佐藥。知母潤(rùn)肺止咳，引藥入肺腎二經(jīng)，為方中之使藥。諸藥合用，腎陽(yáng)得補(bǔ)、脾氣得健、肺氣得宣，從而達(dá)到益氣溫陽(yáng)、化痰平喘之功。Tian等[22]研究證實(shí)，淫羊藿中的主要活性化合物淫羊藿苷能夠通過(guò)調(diào)控NF-κB和STAT3信號(hào)通路抑制嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道重塑。王玨等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)平喘顆粒能夠通過(guò)調(diào)控TLR2、TLR4表達(dá)抑制Th2細(xì)胞活化，進(jìn)而改善氣道炎癥，同時(shí)可通過(guò)抑制miR-21的表達(dá)降低嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá)，從而減輕氣道炎癥。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織HE染色顯示氣道炎癥浸潤(rùn)明顯，肺泡灌洗液中 IL-6、IL-18水平和肺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高；而平喘顆粒組小鼠氣道炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，肺泡灌洗液中 IL-6、IL-18水平和肺組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低。提示平喘顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活，從而抑制Caspase-1、IL-1β轉(zhuǎn)化為活性生物物質(zhì)，進(jìn)而下調(diào)IL-6和IL-18的表達(dá)，起到減輕氣道炎癥、控制疾病發(fā)展的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。