Z-沒藥甾酮基于PI3K/AKT通路化瘀解毒抗缺血性腦卒中的作用及機制

劉天龍，王文軍，陳 偉，藺發(fā)聰，劉 潤，席 寧，呂 靜，呂培霖

(1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院，陜西 西安 710032；3.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四四醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000)

缺血性腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點[1]。該病的首選急救措施是溶栓，但因治療窗口僅有4～6 h，嚴重制約了其應用[2]。中醫(yī)藥在缺血性腦卒中的防治中理論基礎雄厚、實踐經驗豐富，具有獨特優(yōu)勢。缺血性腦卒中屬“血瘀證”范疇，瘀血阻絡、毒損腦絡是其主要病機，故化瘀解毒是中醫(yī)藥對缺血性腦卒中的主要治則之一[3-5]?，F(xiàn)代生理病理學研究發(fā)現(xiàn)，磷酸肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可通過調控下游靶蛋白內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Nrf2，分別發(fā)揮調節(jié)血流變、減輕氧化應激損傷的腦保護作用[6-7]，這與中藥“化瘀解毒”功效不謀而合。沒藥(Myrrha)屬活血化瘀中藥，是防治缺血性腦卒中中藥方劑的常用組方藥物。Z-沒藥甾酮是沒藥的主要活性物質[8-9]，其是否可通過PI3K/Akt通路發(fā)揮化瘀解毒的作用尚不清楚。本研究分別從血管活性物質和氧化應激層面，研究了Z-沒藥甾酮對缺血性腦卒中大鼠的保護作用，旨在進一步揭示Z-沒藥甾酮保護腦缺血損傷的分子機制，豐富中醫(yī)藥化瘀解毒理論的現(xiàn)代科學內涵，為缺血性腦卒中提供新的藥物治療思路和理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠60只，體重(250±10)g，購于聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院實驗動物科，動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0047。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±2)℃，濕度(50±10)%，12 h照明,自由飲食。所有實驗程序已獲倫理委員會批準(2020KYLL058)并遵守國內外動物實驗相關規(guī)范。

1.2藥品與試劑 實驗用Z-沒藥甾酮(美國Santa Cruz公司，純度≥98 %)；線栓(美國Doccol公司)；TTC試劑(美國Sigma公司)；內皮素-1(ET-1)、血栓素B2(TXB2)、血栓調節(jié)蛋白(TM)、6-酮-前列環(huán)素1α(6-keto-PGF1α)試劑盒及二甲基亞砜(DMSO)溶劑(熱默爾生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；活性氧簇(ROS)試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Nrf2、磷酸化內皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)抗體(美國Abcam公司)。

1.3實驗方法 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、Z-沒藥甾酮低劑量組、Z-沒藥甾酮中劑量組、Z-沒藥甾酮高劑量組，每組12只。模型組和Z-沒藥甾酮各組大鼠采用經典的大腦中動脈阻閉法(MCAO)建立缺血性腦卒中模型：在頸正中處切口，暴露大鼠右側頸總動脈，分別結扎頸總和頸內外動脈，于頸內外動脈分叉下方剪開，從切口中緩緩插入線栓，進線約18 mm時到達腦中動脈。假手術組只暴露血管，不放入線栓。造模全過程中，通過肛溫監(jiān)測確保大鼠的體溫維持在37 ℃。Z-沒藥甾酮低、中、高劑量組大鼠分別于術前30 min給予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg Z-沒藥甾酮(用DMSO溶解，確保給藥時DMSO終濃度<5%)腹腔注射，其余組大鼠給予等量DMSO腹腔注射，術后均繼續(xù)干預3 d。

1.4檢測指標及方法

1.4.1神經功能評分 末次干預結束后，根據(jù)Longa評分方法對各組大鼠進行單盲評分。0分：無神經功能損傷；1分：左前肢不能完全伸展；2分：行走時大鼠向左側轉圈；3分：行走時大鼠向左側傾倒；4分：無自發(fā)活動，有意識障礙。評分越高提示神經功能損傷越嚴重。

1.4.2腦梗死體積和腦含水量 采用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血后斷頭處死。每組隨機取6只大鼠大腦，稱重獲得濕重后，將大腦放入預冷的腦槽中，從人字縫分叉處開始，切成2 mm厚冠狀切片。腦片在37 ℃下浸泡于2 % TTC溶液中約15 min，待腦片染成粉紅色后，用10%多聚甲醛固定24 h。染色后缺血區(qū)(腦梗死)顏色為白色，非缺血區(qū)為紅色，測量并計算總梗死體積。梗死體積的水腫校正通過以下公式計算：梗死體積比=(左側正常組織-右側正常組織)/左側正常組織。TTC染色結束后將所有大腦組織在110 ℃下干燥24 h，獲得干重，計算腦含水量，腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4.3全血黏度和凝血參數(shù) 用肝素鋰采血管采集2 mL腹主動血，用錐板黏度計在37 ℃下測1/s、5/s、30/s、200/s剪切率下的全血黏度。用3.8 %檸檬酸鈉采血管采集2 mL腹主動血，采用自動凝血儀測定凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)水平。所有檢測在采血后3 h內完成。

1.4.4血清血管活性物質和氧化應激指標水平 腹主動脈取血，按照試劑盒操作說明檢測血管活性物質ET-1、TXB2、TM、6-keto-PGF1α和氧化應激指標SOD、GSH-Px、CAT、ROS、MDA水平。

1.4.5腦組織中PI3K、p-Akt、Nrf2和p-eNOS蛋白表達情況 采用免疫組化法檢測：取各組6只大鼠腦組織進行石蠟包埋并切片，依次用二甲苯和酒精脫蠟脫水，放入0.3 %甲醇-H2O2液中，室溫孵育30 min，消除內源性過氧化物酶活性。切片放入pH 6.0的枸櫞酸抗原修復液中，高壓鍋煮沸2 min，靜置18 min，自然冷卻至室溫。滴加山羊血清封閉液孵育30 min，輕輕甩去。加入相應一抗后放4 ℃冰箱過夜孵育，洗滌后加入二抗，室溫下孵育1 h。用DBA顯色后，加蘇木素復染。最后脫水、封片。單盲條件下觀察拍照，在各樣本切片中隨機選取5個視野，用Image Pro Plus 6.0軟件測量光密度值。

2 結 果

2.1各組大鼠神經功能評分比較 模型組及Z-沒藥甾酮低、中、高劑量組大鼠神經功能評分分別為(3.17±0.72)分、(2.50±0.67)分、(2.00±0.74)分、(1.92±0.67)分，Z-沒藥甾酮各劑量組大鼠神經功能評分均顯著低于模型組(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠腦梗死體積和腦含水量比較 模型組大鼠腦梗死體積和腦含水量均顯著高于假手術組(P均<0.05)。Z-沒藥甾酮中、高劑量組大鼠腦梗死體積、腦含水量均顯著低于模型組(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮中、高劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠腦梗死體積和腦含水量比較

2.3各組大鼠全血黏度比較 模型組大鼠不同切變率下全血黏度均顯著高于假手術組(P均<0.05)。Z-沒藥甾酮中、高劑量組大鼠不同切變率下全血黏度及Z-沒藥甾酮低劑量組1/s和30/s切變率下全血黏度均顯著低于模型組(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮中、高劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠全血黏度比較

2.4各組大鼠凝血參數(shù)比較 與假手術組比較，模型組大鼠TT、PT、APTT均顯著縮短(P均<0.05)，F(xiàn)IB水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，Z-沒藥甾酮中、高劑量組大鼠TT、PT、APTT及Z-沒藥甾酮低劑量組大鼠APTT均顯著延長(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮各劑量組大鼠FIB水平均顯著降低(P均<0.05)；Z-沒藥甾酮中、高劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠凝血參數(shù)比較

2.5各組大鼠血管活性物質水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清ET-1和TXB2水平均顯著升高(P均<0.05)，TM和6-keto-PGF1α水平均顯著降低(P均<0.05)。與模型組比較，Z-沒藥甾酮中、高劑量組大鼠血清ET-1和TXB2水平均顯著降低(P均<0.05)，TM和6-keto-PGF1α水平均顯著升高(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮低劑量組大鼠僅血清ET-1水平顯著降低(P<0.05)；Z-沒藥甾酮中、高劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠血清血管活性物質水平比較

2.6各組大鼠氧化應激指標水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT水平均顯著降低(P均<0.05)，ROS和MDA水平均顯著升高(P均<0.05)。與模型組比較，Z-沒藥甾酮中、高劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px、CAT水平及Z-沒藥甾酮低劑量組大鼠SOD水平均顯著升高(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮各劑量組大鼠ROS和MDA水平均顯著降低(P均<0.05)；Z-沒藥甾酮中、高劑量組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表5。

表5 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠血清氧化應激指標水平比較

2.7各組大鼠腦組織PI3K/Akt通路蛋白表達情況比較 免疫組化染色結果顯示，假手術組各蛋白在腦組織中呈現(xiàn)大面積棕黃色染色；相比于假手術組，模型組免疫組化染色深度降低，陽性染色細胞數(shù)量減少；Z-沒藥甾酮各劑量組各蛋白免疫組化染色較模型組加深。量化結果顯示，模型組大鼠腦組織中PI3K、p-Akt、Nrf2和p-eNOS蛋白表達光密度值均顯著低于假手術組(P均<0.05)，Z-沒藥甾酮各劑量組大鼠各蛋白表達光密度值均顯著高于模型組(P均<0.05)。見圖1及表6。

表6 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠腦組織中PI3K/Akt通路相關蛋白表達光密度值比較

圖1 假手術組和缺血性腦卒中各組大鼠腦組織中PI3K/Akt通路相關蛋白表達情況(免疫組化染色，×200)

3 討 論

腦卒中是指由于腦血流紊亂引起的急性缺血性或出血性腦病。缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，約占臨床卒中總發(fā)病率的87%，其特點是血栓形成或栓塞導致血流突然喪失，阻塞供應大腦特定區(qū)域的腦血管[10]。缺血性腦卒中是永久性殘疾的主要原因，給患者家庭和社會帶來沉重負擔。近些年中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展成果矚目，在心腦血管疾病的臨床治療中受到國內外的重視和認可[11]。

根據(jù)中醫(yī)理論，缺血性腦卒中屬“血瘀證”范疇，活血化瘀的治療思想最早見于《黃帝內經》。經過歷代醫(yī)家的實踐探索，該理論思想不斷豐富和發(fā)展，逐漸形成了系統(tǒng)、全面的理法方藥診療體系[12]。有諸多中醫(yī)藥理論研究認為，“瘀血阻絡”和“毒損腦絡”是腦血管栓塞疾病的主要病機?！梆觥焙汀岸尽痹跈C體發(fā)生復雜的交互作用，既是病證的病理產物，同時也繼發(fā)成為病證的重要誘因?！把觥笔侵覆∽儥C體的血液在體內外誘因的影響下，發(fā)生“黏、濃、凝、聚”，若瘀聚集于頭則誘發(fā)缺血性腦卒中?，F(xiàn)代中醫(yī)研究將“血瘀”劃分為“有形”和“無形”兩類，其中血液黏度增高、血流動力學失常為“無形之瘀”。因此，改善血流變及調節(jié)血管收縮活性物質水平與“化瘀”功效是內在統(tǒng)一的。本實驗中，大鼠造模后血液黏度增高，凝血時間縮短，ET-1和TXB2水平顯著升高，TM和6-keto-PGF1α水平顯著降低，表明造模誘導了大鼠“血瘀”狀態(tài)；Z-沒藥甾酮給藥后，以上指標均不同程度恢復，體現(xiàn)了Z-沒藥甾酮的“化瘀”功效。另一方面，“瘀”導致組織灌注減少，會誘發(fā)體內的“毒”。王永炎院士認為，在缺血性腦卒中病理機制中，“毒邪”發(fā)揮重要作用，在此基礎上提出了缺血性腦卒中“毒損腦絡”的病機假說[13]。體現(xiàn)在微觀層面，“毒損腦絡”與機體氧化應激反應導致腦損傷是一致的。而諸多中藥可通過抗氧化應激改善腦缺血損傷[14]。因此，抗氧化應激與“解毒”功效是內在統(tǒng)一的。本實驗中，大鼠造模后血清SOD、GSH-Px、CAT水平顯著降低，ROS和MDA水平顯著升高，提示缺血性腦卒中大鼠體內“毒邪”滋生；Z-沒藥甾酮給藥后，血清SOD、GSH-Px、CAT水平升高，ROS和MDA水平降低，表明Z-沒藥甾酮可通過“解毒”發(fā)揮保護作用。

PI3K/Akt是經典的抗凋亡、促存活信號通路，在腦梗死等血管性疾病中發(fā)揮重要調節(jié)作用。生理狀況下，PI3K的活化和鈍化處于平衡狀態(tài)，活化的PI3K可使Akt發(fā)生磷酸化，p-Akt進一步調節(jié)下游靶蛋白eNOS和Nrf2的激活，參與細胞發(fā)育、生長和分化[15]。研究發(fā)現(xiàn)，MCAO大鼠腦組織中p-Akt表達減少，而中藥可通過激活PI3K/Akt通路緩解缺血性腦損傷[16]。在PI3K-/-小鼠MCAO模型和siRNA-PI3K轉染的皮質神經元氧糖剝奪模型中，腦梗死體積增大，細胞凋亡增加，表明PI3K/Akt是腦缺血損傷中的重要調節(jié)通路[17]。eNOS主要存在于內皮細胞中，是NO的限速酶，其可通過調節(jié)血管張力和血流分布，對心腦血管疾病產生直接影響[18]。通過激活eNOS通路，可顯著減輕血管內皮損傷[19]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在血瘀證大鼠模型中，腸系膜動脈舒張功能減弱，血管內皮受損，同時伴隨p-eNOS和NO水平降低[20]。Nrf2是存在于各種細胞類型中的一種轉錄因子，機體在穩(wěn)態(tài)條件下，Nrf2與過Keap1在細胞內以非活性形式存在[21]；在應激條件下，Nrf2與Keap1解離并易位到細胞核中，結合到DNA上的抗氧化反應原件區(qū)，調控其下游靶基因抗氧化酶的轉錄，從而發(fā)揮抗氧化應激作用[22]。本實驗免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Z-沒藥甾酮給藥可上調缺血性腦卒中大鼠腦組織中PI3K、p-Akt、Nrf2和p-eNOS蛋白表達，提示Z-沒藥甾酮發(fā)揮腦保護作用是通過PI3K/Akt通路及其介導的Nrf2和eNOS途徑實現(xiàn)的。

綜上所述，Z-沒藥甾酮可通過活化PI3K/Akt通路及其下游Nrf2和eNOS途徑，分別從血管活性物質和氧化應激兩個層面發(fā)揮“化瘀解毒”的腦缺血損傷保護作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。