歐洲型PRRSV競爭ELISA抗體檢測方法的建立及應用

許 滸，相麗潤，張文立，湯艷東，趙 靜，李 超，龔邦俊，李宛生，付 軍，彭金美，王 倩，周國輝，冷超糧，安同慶，蔡雪輝*，張洪亮*，田志軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點豬病實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.南陽師范學院，河南 南陽 473061）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and re-spiratory syndrome，PRRS）是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的以母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的高度傳染性疾病[1]。之前，PRRSV 被定義為動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬成員，根據(jù)地理分布及遺傳演化分析，PRRSV 被分為2 個基因型：PRRSV-1（歐洲型）和PRRSV-2（美洲型）[2]。2021 年3 月，國際微生物學會聯(lián)合會病毒學組設立的國際病毒分類委員會（ICTV）正式批準將PRRSV 歸于動脈炎病毒科，β-動脈炎病毒屬（Betaarterivirus）。PRRSV-1 是Eurpo-bartevirus亞 屬，Betaarterivirus suid 1種 成 員， 而PRRSV-2 是Ampobartevirus亞屬，Betaarterivirus suid 2種成員。在重新分類后PRRSV-1 和PRRSV-2 不再屬于同一種的兩個基因型，而是屬于不同的亞屬和種。我國于1997 年首次分離到PRRSV-1 株并命名為B1株[3]，自2011 年來，中國關于PRRSV-1 的報道逐漸增多，已有廣東、遼寧等6 個省份報道出現(xiàn)了PRRSV-1[4-8]。目前國內對PRRSV-1 的檢測主要是針對病原核酸，缺少特異性針對PRRSV-1 的血清學檢測方法。由于PRRSV-1 和PRRSV-2 不再屬于同一亞屬，因此建立針對PRRSV-1 的特異性血清學檢測方法，對了解PRRSV-1 在我國的流行情況和有效防控該病具有重要的意義。

在眾多血清學檢測方法中，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有操作簡便、試驗時間短、易于標準化的特點，適合用于大范圍流行病學調查。目前市場上常見的商品化抗體檢測試劑盒主要是PRRSV N 蛋白和膜蛋白（M 蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）間接ELISA 試劑盒[9]。大多數(shù)試劑盒均可檢測PRRSV-1 和PRRSV-2的抗體，僅有兩個未獲生產(chǎn)批號的PRRSV-1抗體試劑盒，它們分別以體外表達PRRSV-1 的GP5（試劑盒1）和部分膜蛋白（試劑盒2）為包被抗原，對試劑盒1 檢測PRRSV-1 的抗體情況尚未報道，而國外多篇報道均證實了試劑盒2 并不能特異性檢測PRRSV-1 抗體，且敏感性較差[10-11]。

本研究以特異性識別PRRSV-1 的單克隆抗體（MAb，EU-1）為競爭抗體，建立了一種快速檢測PRRSV-1 抗體的競爭ELISA（EU-C-ELISA）方法，為我國PRRSV-1 的流行病學調查提供方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清和抗體ZD-1株（PRRSV-1，經(jīng)分子篩 純 化 后 濃 度 為 455 ng/μL）[8]、 HNTZJ1341（NADC34-like）、HNTZJ1714（QYYZ-like）由本實驗室分離并保存；116 份PRRSV-1 陽性血清、10 份陰性 血 清（PRRSV-1 和PRRSV-2 雙 陰 性 血 清）、PRRSV-2 動物實驗陽性血清共273 份，其中170 份為HuN4-F112 免疫及HuN4（HP-PRRSV）攻毒血清；60份SD-R 免疫血清及SD（NADC30-like）攻毒血清；12份WK108（NADC30-like）攻毒血清；6 份DZD32-1901（NADC34-like）攻毒血清；8份SD192（ATCC VR2332-like）攻毒血清；14 份CH-1R（經(jīng)典PRRSV）免疫血清、PRRSV-1（DV 株）、副豬嗜血桿菌（HPS）、豬鏈球菌（SS）、胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）等豬常見病毒和細菌的陽性血清樣品均由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；432 份臨床血清于2020 年采自4 個省（黑龍江、遼寧、河北、山東）10 個豬場；PRRSV-1 MAb EU-1 及2C6、PRRSV-2 MAb 3F7 均由本實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基購自GIBCO 公司；胎牛血清購自CLARK 公司；FITC 標記山羊抗小鼠IgG（FITC-IgG）均購自Sigma 公司；山羊抗鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TMB 顯色液購自Sigma 公司；BCA 蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；ELISA 包被板購自JET Bio star公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma 公司；PRRSV抗體檢測試劑盒分別購自北京愛德士（IDEXX）、北京金諾百泰生物技術有限公司（金諾）、世紀元亨生物科技有限公司（試劑盒1）和北京天之泰生物科技有限公司（試劑盒2）。

1.3 PRRSV-1 MAb EU-1 特異性檢測將野毒株ZD-1、HNTZJ1341、HNTZJ1714 及疫苗株HBL、SD-R、HuN4-F112、CH-1R、RespPRRS MLV 和DV 接種Marc-145 細胞。以500 μL MAb EU-1 上清為一抗， 37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次，以300 μL 山羊抗小鼠IgG-FITC（1：200）為二抗，采用間接免疫熒光試驗（IFA）方 法 檢 測MAb EU-1 與 各 類 型PRRSV 的交叉反應性。分別以本實驗室已制備的MAb 2C6（PRRSV-1）和3F7（PRRSV-2）為IFA 方法的陽性對照。

1.4 EU-C-ELISA 方法的建立及反應條件的優(yōu)化將純化后的ZD-1 株全病毒分別用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、Tris-HCL 緩沖液（pH8.5）和碳酸鹽包被液（pH9.6）稀釋（910 ng/孔、455 ng/孔、227.5 ng/孔），確定最優(yōu)條件后100 μL/孔加樣后置4 ℃包被，利用方陣法，對包被時間（8 h、12 h、15 h），300 μL BSA濃度（1%、2%、3%），37 ℃封閉時間（1 h、2 h、3 h），PRRSV-1 MAb EU-1 稀釋倍數(shù)（1：2～1：16），37 ℃孵育時間（20 min、30 min、60 min），100 μL 山羊抗鼠IgG-HRP 抗稀釋倍數(shù)（1：5 000、1：10 000、1：20 000），顯色時間（10 min、15 min、20 min）進行優(yōu)化。測定OD450nm值，計算抑制率（Percentage inhibition，PI），PI（%）=（陰性血清OD450nm值-陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值）×100%，選取PI值最大的反應條件為最優(yōu)。

1.5 陰陽性臨界值的確定將10 份陰性血清、273份PRRSV-2 陽 性 血 清（PRRSV-1 陰 性）、116 份PRRSV-1 陽性血清，按照優(yōu)化的EU-C-ELISA 方法檢測，測定OD450nm值后按PI（%）=（陰性血清OD450nm值-樣品血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值）×100 %轉換為PI，用MedCalcv15.8 軟件進行交互式點圖分析，確定臨界值。

1.6 特異性試驗按照優(yōu)化的EU-C-ELISA 條件檢測HPS、SS、APP、TGEV、PEDV、PRV、CSFV、FMDV、PRRSV-2 NADC30-like 疫苗候選株SD-R、高致病性株HuN4-F112、NADC30-like 株WK108、ATCC VR2332-like 株SD192、NADC34-like 株DZD32、經(jīng)典株CH-1R、PRRSV-1 株ZD-1、PRRSV-1 株WK14、PRRSV-1 株WG9 陽性血清，根據(jù)臨界值判定檢測血清樣品的陰陽性；利用本研究建立的EU-C-ELISA方法和兩種市售PRRSV-1 抗體試劑盒檢測18 份PRRSV-2 實驗動物血清（在各譜系實驗動物血清中隨機選取）。評估以上方法與PRRSV-2 抗體的交叉反應性。

1.7 敏感性試驗將PRRSV-1 標準陽性血清2 倍倍比（1：1～1：64）稀釋，按優(yōu)化的EU-C-ELISA 條件進行檢測，根據(jù)臨界值判定陰陽性，評估該方法的敏感性。同時利用4 種試劑盒：IDEXX、金諾及市售兩種PRRSV-1 抗體試劑盒對上述血清進行檢測，比較5 種方法敏感性差異。

1.8 抗體產(chǎn)生時間檢測將PRRSV-1 ZD-1 株以1×105.0TCID50/mL 感染5 頭PRRSV 抗原抗體雙陰性豬，感染后0、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d采集豬血清樣品，按照建立的EU-C-ELISA 進行檢測，并與IDEXX試劑盒的檢測結果進行比較，分析兩種方法對PRRSV-1 感染豬后血清抗體陽轉時間的差異。

1.9 重復性試驗按照優(yōu)化的EU-C-ELISA 方法，從同一批次包被的ELISA 板挑取3 塊，分別檢測上述5 份血清樣品，進行批內重復性試驗，對結果進行統(tǒng)計學分析。另外，按照優(yōu)化的EU-C-ELISA 方法，從不同批次包被的ELISA 板中挑取3 塊，分別檢測上述5 份血清樣品，進行批間重復性試驗，對結果進行統(tǒng)計學分析。

1.10 臨床樣品的檢測 采用本研究建立的EU-CELISA 方法對2020 年我國4 個省份10 個豬場收集的432 份豬血清樣品進行檢測，初步確定PRRSV-1 在我國部分地區(qū)的流行情況。

2 結 果

2.1 MAb EU-1 特異性檢測結果EU-1 特異性檢測結果顯示，EU-1 與PRRSV-2 HuN4-F112、CH-1R、SD-R、 RespPRRS MLV、 HNTZJ1714、 HNTZJ1341 株均不反應，與PRRSV-1 ZD-1、DV 和HBL 株均反應良好（圖1）。表明EU-1 僅與PRRSV-1 反應，而不與PRRSV-2 反應，特異性較強。

圖1 MAb EU-1與各類型PRRSV的IFA結果Fig.1 IFA results between MAb EU-1 agains various types of PRRSV

2.2 EU-C-ELISA 方法的建立及反應條件的確定經(jīng)方陣滴定法優(yōu)化的EU-C-ELISA 方法的最佳包被液為碳酸鹽緩沖液，其他最佳反應條件見表1。

表1 EU-C-ELISA 檢測方法反應條件的優(yōu)化結果Table 1 The optimized conditions of EU-C-ELISA

2.3 EU-C-ELISA 臨界值的確定利用優(yōu)化后的EU-C-ELISA 方法檢測10 份陰性血清、 273 份PRRSV-2陽性血清（PRRSV-1陰性）及116份PRRSV-1陽性血清（PRRSV-2 陰性），經(jīng)MedCalcv15.8 軟件分析結果顯示，當敏感性為97.7%，特異性為100%時，其最優(yōu)的cut-off 值為45（圖2）。因此，當血清樣品的PI ≥45%時，判定結果為陽性，當血清樣品的PI<45%時，判定為陰性。

圖2 EU-C-ELISA 臨界值確定Fig.2 Determination of the critical value of EU-C-ELISA

2.4 特異性試驗結果利用該EU-C-ELISA 方法檢測HPS、SS、APP、TGEV、PEDV、PRV、CSFV、FM-DV、PRRSV-2 NADC30-like 疫苗候選株SD-R、高致病性株HuN4-F112、NADC30-like 株WK108、ATCC VR2332-like 株SD192、NADC34-like 株DZD32、經(jīng)典株CH-1R 、PRRSV-1 株ZD-1、PRRSV-1 株WK14、PRRSV-1 株WG9 陽性血清，結果顯示該方法僅能與PRRSV-1 陽性血清特異性競爭包被抗原，PRRSV-2各譜系病毒株及其他豬常見豬病毒和細菌陽性血清PI 值均遠低于臨界值（圖3），結果表明本研究建立的EU-C-ELISA 方法能夠特異性識別PRRSV-1 抗體，特異性較強。

圖3 EU-C-ELISA 特異性試驗結果Fig.3 Specificity test results of EU-C-ELISA

將建立的EU-C-ELISA 方法與市售兩種PRRSV-1 ELISA 抗體檢測試劑盒進行比較，在273 份PRRSV-2各譜系動物實驗陽性血清中隨機選取18 份檢測，結果顯示兩種市售試劑盒均與PRRSV-2 抗體存在明顯交叉反應，試劑盒1 陽性率為44.4%，試劑盒2 陽性率為27.8%，而本研究建立的EU-C-ELISA 方法檢測均為陰性（圖4），結果表明本研究建立的EU-C-ELI-SA 特異性明顯優(yōu)于其他兩種市售PRRSV-1 ELISA 抗體試劑盒。

圖4 EU-C-ELISA 與其他PRRSV-1 ELISA抗體檢測方法特異性的比較Fig.4 Specificity comparison between EU-C-ELISA and other PRRSV-1 ELISA antibody detection kits

2.5 敏感性試驗結果利用建立的EU-C-ELISA 方法檢測2 倍倍比稀釋的PRRSV-1 ZD-1 株陽性血清，結果顯示PRRSV 陽性血清稀釋倍數(shù)為1：16 時PI 仍大于臨界值；市售PRRSV-1 試劑盒1、2 分別能檢出最高4 倍和2 倍稀釋的PRRSV-1 標準陽性血清，IDEXX 試劑盒和金諾試劑盒分別能檢出最高8 倍和2 倍稀釋的PRRSV-1 標準陽性血清（圖5），以上結果表明本研究建立的EU-C-ELISA 方法的敏感性更高。

圖5 EU-C-ELISA 與其他PRRSV抗體檢測試劑盒敏感性的比較Fig.5 Sensitivity comparison between EU-C-ELISA and other PRRSV antibody detection kits

2.6 抗體產(chǎn)生時間的檢測結果利用建立的EU-CELISA 方法及IDEXX 試劑盒檢測了ZD-1 株感染后0、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d 的血清，結果顯示，EU-C-ELISA 及IDEXX 試劑盒均在豬感染后10 d檢測出血清陽轉（圖6），因此本研究建立的EU-CELISA 方法可以在豬感染PRRSV-1 早期檢測出抗體陽性，豬抗體的陽轉時間與IDEXX 試劑盒檢測的結果基本一致。

圖6 EU-C-ELISA 與IDEXX試劑盒檢測PRRSV-1抗體陽轉時間的比較Fig.6 Comparison of PRRSV-1 antibody conversion time between EU-C-ELISA and IDEXX kit

2.7 重復性試驗結果利用建立的EU-C-ELISA 方法進行重復性試驗，結果顯示批內和批間重復試驗變異系數(shù)均小于5%（表2），表明該方法的重復性較好。

表2 EU-C-ELISA 方法批內和批間重復性試驗結果（n=5）Table 2 The results of intra-and inter repeatability test by EU-C-ELISA(n=5)

2.8 臨床樣品的檢測結果利用該EU-C-ELISA 方法對2020 年從黑龍江（3）、遼寧（3）、河北（2）、山東（2）省10 個豬場采集的432 份臨床血清樣品進行檢測，結果顯示共有2 個豬場檢出PRRSV 陽性，豬場陽性率為20%，樣品陽性率為15.0%。其中黑龍江省和河北省各有1 個豬場存在陽性樣品，陽性率分別為45.5%和62.5%，其余8個豬場血清樣品則均為陰性（圖7）。以上結果表明PRRSV-1可能已在我國部分地區(qū)呈現(xiàn)一定的流行。

圖7 EU-C-ELISA 檢測部分地區(qū)豬場臨床樣品的結果Fig.7 The results of clinical samples in pig farms of some partial regions detected by EU-C-ELISA

3 討 論

本實驗室多年以來一直對我國PRRSV 進行監(jiān)測，近5 年以來PRRSV-1 的檢出數(shù)量明顯增加[8]。由于抗原檢測樣品多為流產(chǎn)或死亡豬的組織病料，而我國流行的PRRSV-1 致病性普遍較低，抗原檢測可能出現(xiàn)大量漏檢情況。在中和試驗（SN）、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、IFA 及多種ELISA 抗體檢測方法中，ELISA 是最為常用的PRRSV 抗體檢測方法。IDEXX 間接ELISA 試劑盒，由于其高靈敏度、特異性和重復性，被作為檢測抗PRRSV 抗體的行業(yè)標準[12]，但其不能區(qū)分PRRSV-1 和PRRSV-2 的抗體。因此，為了了解PRRSV-1 在我國的流行情況，有必要建立一種能夠特異性識別PRRSV-1 抗體的ELISA 試劑盒。

本研究通過超離純化獲得的PRRSV-1 型ZD-1 株全病毒作為包被抗原，相比于人工表達的抗原蛋白，其保留了抗原表位的天然構象，提高了抗體的結合準確度；以PRRSV-1 型MAb EU-1 為競爭抗體，特異性的PRRSV MAb 與陽性豬血清中PRRSV-1 抗體競爭結合抗原蛋白，比阻斷ELISA 方法更簡便省時，相比于市售大多數(shù)間接ELISA 方法可以明顯減少假陽性的出現(xiàn)。該方法與我國流行的各譜系PRRSV-2陽性血清均無交叉反應，結果明顯優(yōu)于兩種市售PRRSV-1 間接ELISA 試劑盒，特異性可以達到100%。 也印證了現(xiàn)有市售ELISA 方法無法對PRRSV-1 抗體進行鑒別檢測的事實。通常間接ELI-SA 方法相比于C-ELISA 的敏感性更高，但在敏感性試驗中，該方法能檢測出16 倍稀釋的標準陽性血清，在與4 種市售間接ELISA 比較時，不僅優(yōu)于PRRSV-1 抗體試劑盒的4 倍和2 倍，甚至比檢測N 蛋白抗體的IDEXX 及金諾ELISA 試劑盒敏感性更高。同時該方法最早可在豬感染后10 d 檢測到PRRSV-1抗體，結果與IDEXX 方法一致，可以較早的檢測到感染PRRSV-1 豬血清樣品中的抗體。

采用建立的EU-C-ELISA 方法對我國PRRSV-1進行初步的流行病學調查，對2020 年采自黑龍江（3）、遼寧（3）、河北（2）、山東（2）省10 個豬場采集的432 份臨床血清樣品進行檢測。有2 個豬場檢出PRRSV-1 抗體為陽性，豬場陽性率達20%；兩個陽性豬場的樣品陽性率分別為45.5%和62.5%；10 豬場樣品總陽性率為15.0%。同時利用本實驗室建立的PRRSV-2 M 蛋白抗體C-ELISA 方法對65 份PRRSV-1陽性臨床樣品進行了檢測[9]，該方法可以特異性檢測PRRSV-2 抗體，其中PRRSV-2 陽性樣品為61 份，陽性率高達93.8%，這可能與部分豬場免疫PRRSV-2疫苗有關，也可能與PRRSV-2 在我國流行范圍較廣相關。雖然本研究中血清樣品數(shù)量和采集范圍有限，但現(xiàn)有結果表明我國部分地區(qū)的豬群中已存在PRRSV-1 抗體。下一步本研究室將增大對被檢臨床樣品的數(shù)量及樣品具體背景信息的了解，以便進一步明確PRRSV-1 在我國的具體流行狀況。

綜上所述，本研究建立了一種快速檢測PRRSV-1 抗體的EU-C-ELISA 方法，具有良好的特異性、敏感性和重復性。為PRRSV-1 的流行病學調查供了一種簡便、快速、特異的血清學抗體檢測方法，初步流行病學調查顯示，PRRSV-1 抗體已經(jīng)存在于我國部分地區(qū)豬群中。長期以來PRRSV-1 和PRRSV-2 被視為同一種病原，無法了解兩種病原在我國具體流行狀況，導致我國對PRRSV-1的檢測手段十分匱乏，也不利于針對性防控，面對PRRSV-1 與PRRSV-2 分為不同亞屬的新局勢，加大對我國豬場PRRSV-1 抗體的監(jiān)測已十分必要。