應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討菟絲子治療多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗的可能機制*

歐余航 許榕倩 滕海英 王春梅

（1 福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院 福州 350108；2 福建中醫(yī)藥大學附屬康復(fù)醫(yī)院 福州 350003）

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome,PCOS）是育齡期女性不孕的主要因素之一，而胰島素抵抗（Insulin Resistance,IR）是其生理及病理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是發(fā)生糖脂代謝紊亂的重要因素，IR 會造成代償性的高胰島素血癥，增加雄激素分泌，阻礙卵泡發(fā)育[1～2]。一項Meta 分析結(jié)果顯示：PCOS 組女性胰島素敏感性比對照組女性低27%[3]。胰島素水平的持續(xù)升高會直接或間接刺激卵巢分泌雄激素，長期在雌激素和胰島素的刺激下容易發(fā)生子宮內(nèi)膜增生，導(dǎo)致PCOS 患者的妊娠率明顯下降[4～5]。因此，改善PCOS 患者的IR 情況，對于提高育齡期女性的排卵率以及懷孕率均具有重要的現(xiàn)實意義。PCOS及IR 均為現(xiàn)代醫(yī)學病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，與中醫(yī)中的“不孕癥、月經(jīng)后期、肥胖”等記載相似，且中醫(yī)認為其主要病機為腎虛痰濕，治療時以補腎化痰為主，兼顧活血、健脾、調(diào)肝等。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，在PCOS 不孕癥患者治療中加用滋腎育胎丸（君藥菟絲子）不但可以改善患者的中醫(yī)證候，而且可以提高妊娠率、降低流產(chǎn)率[6]。陳迪等[7]發(fā)現(xiàn)在防治PCOS過程中，菟絲子為使用頻率最高且配伍頻次最多的中藥之一。菟絲子為旋花科植物南方菟絲子或菟絲子的干燥成熟種子[8]，《本經(jīng)》將其列為上品，為補腎安胎之要藥。張錫純認為菟絲子是“千百味藥中最善治流產(chǎn)的藥”，據(jù)此創(chuàng)立名方壽胎丸，取其補養(yǎng)固胎之功效。羅元愷教授基于前人經(jīng)驗，在此基礎(chǔ)上制定了滋腎育胎丸，用于防治流產(chǎn)及治療腎虛型婦科疾病效果顯著。大量文獻報道提示：以菟絲子為主要藥味組成的中藥復(fù)方制劑治療IR 型PCOS 具有顯著療效，但目前對于該方面的研究多為動物實驗或臨床應(yīng)用，檢測時也局限于單個指標、靶點或單一通路，無法體現(xiàn)中藥的整體性和全面性。網(wǎng)絡(luò)藥理學在預(yù)測藥物與疾病之間的潛在相關(guān)性上具有一定前期指導(dǎo)意義，且其基于“疾病-基因-靶點-藥物”多層次的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建也與中藥多成分、多靶點的特點吻合，契合中醫(yī)整體觀的指導(dǎo)原則[9]。因此，本研究擬先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)對菟絲子改善PCOS 伴IR 的機制進行研究，后續(xù)將進行動物實驗及細胞實驗等進一步驗證其結(jié)果，旨在為后續(xù)臨床應(yīng)用中藥菟絲子及其相關(guān)中藥復(fù)方制劑防治PCOS-IR 提供前期數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 菟絲子活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https://tcmspe.com/）[10]，以“菟絲子”為關(guān)鍵詞進行檢索，參考ADME參數(shù)對菟絲子有效成分進行過濾，過濾條件限定為口服利用度（OB）＞30%；類藥性（DL）＞0.18[11]；結(jié)合已發(fā)表文獻對篩選結(jié)果進行查遺補漏，若化合物藥理作用明顯也予納入。在“target”項目下，對過濾后的活性成分潛在靶點進行預(yù)測。為規(guī)范靶點名稱，在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）[12]將以上靶點統(tǒng)一校準為基因簡稱。

1.2 PCOS 及IR 相關(guān)靶點搜集 以“Polycystic Ovary Syndrome、Insulin Resistance”為關(guān)鍵詞，從Genecards 疾病基因數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）[13]、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.omim.org/）[14]、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/home/）[15]中搜集PCOS-IR 疾病靶點。在Genecards 數(shù)據(jù)庫中，“Relevance score”表示疾病與靶點的關(guān)系值，通過設(shè)定該值，篩選PCOS 與IR 潛在的疾病靶點。將以上結(jié)果合并后除去重復(fù)值，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行基因簡稱校準。

1.3 菟絲子“活性成分-PCOS-IR”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Jvenn 在 線 工 具（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html/）[16]繪制韋恩圖，獲得菟絲子活性成分靶點與PCOS-IR 疾病靶點的交集基因，并通過Cytoscape 3.8.2[17]進行可視化。應(yīng)用Network Analyzer 插件分析“活性成分-PCOS-IR”網(wǎng)絡(luò)的特征，通過設(shè)定參數(shù)來過濾菟絲子中重要成分及靶點，并分析兩者的相互關(guān)系。

1.4 菟絲子活性成分與PCOS-IR 靶點蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Biso Genet 插件創(chuàng)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并應(yīng)用CytoNCA[18]插件對PPI 進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析進而篩選核心基因。

1.5 菟絲子活性成分與PCOS-IR 靶點的基因本體論（GO）分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 在Metascape[19]平臺進行GO 及KEGG 分析，物種選擇“智人”，設(shè)置Min Overlap 為3、P＜0.01、Min Enrichment 為1.5，對其主要的生物學進程、分子功能、信號通路等進行富集分析的研究。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子主要活性成分及靶點結(jié)果 共獲得菟絲子成分29個，根據(jù)OB 和DL 設(shè)定閾值結(jié)合文獻補充，過濾后獲得13個活性成分。分別對13個成分進行潛在靶點的預(yù)測分析，合并結(jié)果后去掉重復(fù)靶點，最后預(yù)測到243個潛在靶點。見表1。

表1 菟絲子主要活性成分及靶點結(jié)果

2.2 PCOS-IR 靶點搜集 通過Genecards 數(shù)據(jù)庫共篩選得到PCOS、IR 相關(guān)靶點基因8 708個，設(shè)定Relevance score＞10 的靶點為潛在靶點，結(jié)合其他兩個數(shù)據(jù)庫結(jié)果，去除重復(fù)靶點后共獲得PCOS-IR靶點764個。

2.3 菟絲子“活性成分-PCOS-IR”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 制作韋恩圖，共得到交集基因104個，以此創(chuàng)建菟絲子“活性成分-PCOS-IR”網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含117個節(jié)點（Node），即成分與靶點名稱；214個邊線（Edge），即相互關(guān)系。其中槲皮素為貢獻最大的活性成分。PCOS-IR 靶點根據(jù)Degree 值取中位數(shù)，Node 的Degree 最大為84，最小為1，計算中位數(shù)為2，篩選Degree＞2 的為關(guān)鍵靶點。見圖1、圖2。

圖1 菟絲子“成分靶點”與“PCOS-IR 疾病靶點”韋恩圖

圖2 菟絲子“活性成分-PCOS 伴IR”網(wǎng)絡(luò)

2.4 菟絲子活性成分與PCOS-IR 靶點PPI 創(chuàng)建與Module 篩選 利用BisoGenet 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，由菟絲子活性成分靶點與PCOS 伴IR 靶點提取到的交集基因可得到5 458個節(jié)點和133 611個關(guān)系線，計算網(wǎng)絡(luò)拓撲學特征屬性值，設(shè)定參數(shù)閾值進行核心基因篩選。根據(jù)篩選提取到228個關(guān)鍵節(jié)點并7 129個關(guān)系線。通過分子復(fù)合物檢測（MCODE）算法分析PPI 網(wǎng)絡(luò)中Node 之間潛在的相互關(guān)系，功能相似Node 會富集成功能團即Module。見圖3、圖4。

圖3 關(guān)鍵靶點的篩選策略

圖4 菟絲子治療IR 核心網(wǎng)絡(luò)

2.5 菟絲子成分與PCOS-IR 靶點GO 和KEGG 通路富集分析 應(yīng)用Metascape 對交集基因進行GO分析與KEGG 通路富集分析，GO 分析包括三大類：生物過程（Biological Process, BP）、細胞組分（Cellular Component, CC）、分子功能（Molecular Function,MF）[19]。KEGG 富集結(jié)果選取Log10（P）值排名前20 的結(jié)果將其進行可視化。BP、CC、MF 分別選取Z-score 值排名前10 的結(jié)果繪制條形圖，條形顏色由黃到棕代表Log10（P）值從小到大，縱軸代表富集的通路；BP、CC、MF 三合一柱狀圖使用在線工具進行處理（http://www.bioinformatics.com.cn/）。見圖5。

圖5 GO 富集（A）和KEGG 通路（B）分析菟絲子成分對PCOS-IR 靶點

3 討論

PCOS 是一種復(fù)雜的多因素疾病，可影響育齡期女性和絕經(jīng)后女性的內(nèi)分泌水平，臨床常見癥狀有不孕癥、多毛癥、月經(jīng)紊亂、肥胖等，IR 及高胰島素血癥是導(dǎo)致PCOS 的關(guān)鍵性特征[20]。在臨床治療PCOS 中藥復(fù)方中，中藥菟絲子作為復(fù)方中使用頻率最多的中藥之一，且大部分作為君藥存在，其功效毋庸置疑。岑怡等[21]以淫羊藿、菟絲子、虎杖等9 味中藥組成促排湯，該方能降低IR 型PCOS 患者氧化應(yīng)激水平，有效治療PCOS-IR；田璐等[22]以菟絲子、覆盆子、淫羊藿等12 味中藥組成補腎化痰湯，該方能夠顯著抑制PCOS 大鼠模型血清胰島素、胰島素受體基因及蛋白表達水平；黃映紅等[23]以菟絲子、覆盆子、桑葚子等10 味中藥組成五子蒼附導(dǎo)痰湯，該方可降低肥胖型PCOS 大鼠空腹血糖及胰島素、IR指數(shù)，提高卵巢組織脂聯(lián)素受體1 和磷酸化蛋白激酶表達，并通過APN/AMPK 信號通路調(diào)節(jié)模型大鼠IR、增加卵巢組織胰島素敏感性以及恢復(fù)排卵。菟絲子治療PCOS 的物質(zhì)基礎(chǔ)研究最多的為菟絲子黃酮類成分，研究證實，菟絲子黃酮類成分在生殖系統(tǒng)方面具有類雌激素樣作用，可雙向調(diào)節(jié)體內(nèi)雌激素水平，使之趨于正常[24]。但其能否改善PCOS-IR尚未有研究。

由表1 和圖2 可知，菟絲子中治療PCOS 伴IR的主要貢獻成分依次為：槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、β-谷甾醇、芝麻素、苦參堿、紫云英苷、金絲桃苷等。研究證明，槲皮素可改善PCOS 引起的激素代謝異常及排卵障礙[25]，Asma Neisy 等[26]發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著升高脫氫表雄酮誘導(dǎo)PCOS 模型小鼠子宮內(nèi)雌激素受體α（Oestrogen Receptor α,ERα）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（Glucose Transporter 4, GLUT4）的表達，降低肝臟己糖激酶和葡萄糖激酶活性，減小卵巢體積，改善PCOS 小鼠的IR 狀態(tài)。Wang ZZ 等[27]通過實驗證實槲皮素可改善IR 并對PCOS 大鼠表現(xiàn)出良好的治療效果，其機制可能為抑制Toll 樣受體4（TLR4）/ 核因子-κB（NF-κB）信號通路進而改善PCOS 大鼠卵巢組織的炎癥微環(huán)境來起到治療作用。芹菜素可通過降低炎癥介質(zhì)水平來抗炎抗氧化進而改善PCOS[28]；還可通過Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）途徑改善IR[29]。蔡紅蝶等[30]采用高糖誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞進而建立IR 細胞模型，結(jié)果證實金絲桃苷可通過調(diào)控糖脂代謝及IR 相關(guān)基因如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等mRNA的表達進而改善IR。以上成分可能是菟絲子治療PCOS 伴IR 的物質(zhì)基礎(chǔ)，但大部分藥效成分的作用機制尚未明確，是臨床進一步研究的目標。

經(jīng)篩選后共得到與PCOS-IR 相關(guān)的23個潛在關(guān)鍵疾病靶點。根據(jù)Degree 值排序，其中較為重要靶點的為孕酮受體（PGR）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯-3-激酶（PIK3CG）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶-2（PTGS2）、絲氨酸蛋白酶-1（PRSS1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（CASP3）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARGγ）、雄激素受體（AR）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1（AKT1），菟絲子可能通過上述靶點發(fā)揮治療PCOS 伴IR 的作用。

通過GO 分析，共得到生物進程215 條，細胞組分78個，分子功能125 條，主要涉及脂質(zhì)反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、凋亡、類固醇激素受體活性、平滑肌細胞增殖等生物進程，它們的分子功能主要與核受體活性、BH3 結(jié)構(gòu)域結(jié)合、參與細胞凋亡執(zhí)行階段的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、IR 結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合等相關(guān)，并且主要富集在膜筏、囊泡腔、細胞器外膜、蛋白激酶復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體等部位。

通過KEGG 分析富集到信號通路共193 條，富集結(jié)果提示，菟絲子用于防治PCOS 伴IR 主要作用機制可能涉及以下幾個信號通路：AGE-RAGE、PI3K-AKT、HIF-1、JAK-STAT、ErbB、VEGF、NF-κB、Apelin、AMPK、Wnt 等。AGE/RAGE 信號通路可介導(dǎo)IR 并誘導(dǎo)多囊卵巢中炎癥反應(yīng)[31]。高糖、肥胖等因素會使體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA 發(fā)生非酶糖基化，糖基化終末產(chǎn)物（AGE）生成增加，并與細胞膜上受體RAGE 結(jié)合，引發(fā)IR、PCOS 等代謝綜合征[32]。PI3K/AKT信號途徑異常會造成糖脂代謝紊亂，造成IR。胰島素等因素的刺激，會使PI3K 和AKT蛋白表達上調(diào)，激活PI3K/AKT信號通路，通過信號傳導(dǎo)作用于糖原合酶激酶-3、GLUT4、叉頭框蛋白-O1（FoxO1）等，以上底物受體分子通過介導(dǎo)葡萄糖運入細胞、抑制肝糖原合成、減少葡萄糖生成并增加葡萄糖攝取、提高脂質(zhì)代謝等方面改善IR[33]。AMPK可以通過多種方式調(diào)控下游信號通路來改善IR。活化的AMPK 一方面可以磷酸化AKT的Ser473 位點和Thr308 位點，另一方面能激活胰島素受體、胰島素受體底物蛋白，還可以下調(diào)mTOR Ser2448 位點的靶蛋白表達，增加GLUT4 表達等發(fā)揮調(diào)控作用[34～35]。NF-κB 包括三種信號分子：NF-κB、IκB、IKK。當細胞受到外界信號刺激時，IKK 會發(fā)生磷酸化，進而使IκB 磷酸化并與NF-κB 解離，NF-κB 與下游靶基因結(jié)合，并調(diào)節(jié)一系列炎癥介質(zhì)的表達，引起炎癥信號的正反饋機制，最終導(dǎo)致IR 的發(fā)生[36]。正常情況下，瘦素與胰島素可雙向反饋作用，當脂肪-胰島素軸失衡，瘦素會抑制胰島素分泌、促進葡萄糖轉(zhuǎn)運、糖原合成等，從而干擾胰島素與受體結(jié)合，出現(xiàn)IR[37]。JAK-STAT 信號通路是參與瘦素分子胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)控通路之一。IR 發(fā)生時，炎癥介質(zhì)與受體結(jié)合，刺激酪氨酸激酶-2（JAK2）磷酸化啟動，活化下游胞漿蛋白（STAT3），進一步誘導(dǎo)細胞因子信號抑制劑3（SOCS3）的表達，同時，SOCS-3 可以負反饋調(diào)控JAK2/STAT3 信號通路，進一步介導(dǎo)IR 的發(fā)生[38]。PPARγ 是調(diào)控脂肪細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，其基因多態(tài)性與IR 密切相關(guān)，也是我們這次篩選到的關(guān)鍵靶點之一，同時也是Wnt 信號通路的靶基因，PPARγ 可與激動劑結(jié)合上調(diào)β-catenin 基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控脂細胞分化相關(guān)因子表達從而調(diào)節(jié)脂代謝，改善IR[39]。近年研究發(fā)現(xiàn)，肥胖或IR 的PCOS 患者體內(nèi)脂肪因子愛帕琳肽（Apelin/APLN）含量比單純PCOS 患者體內(nèi)含量高[40]。Apelin 通過與血管緊張素受體AT1 相關(guān)受體蛋白受體（APJ）結(jié)合，激活絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶3/1 （MAPK3/1）、AKT 及AMPK 等信號通路共同參與IR 過程[41]。而缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）也均有實驗證實可能是PCOS 患者發(fā)生IR 的檢測指標[42]。

綜上所述，菟絲子用于防治PCOS-IR 的主要藥效物質(zhì)可能是槲皮素、山奈酚、金絲桃苷等，主要作用機制可能涉及的信號通包括AGE/RAGE、PI3K/AKT、JAK/STAT 等，該作用機制涉及的生物過程主要與脂質(zhì)反應(yīng)、平滑肌細胞增殖、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、類固醇激素反應(yīng)等相關(guān)。本研究借構(gòu)建可視化的網(wǎng)絡(luò)圖，能夠更加直觀以及全面地顯示出菟絲子通過多成分多途徑共同作用的中醫(yī)中藥治療特色，比西藥的單一靶點相對有更明顯的優(yōu)勢，后續(xù)將開展進一步的動物實驗驗證，深入闡明中藥菟絲子防治PCOS-IR 的作用機制。