大黃素對慢性腎衰患犬腸道菌群及其代謝產物的影響

高巖松 朱道仙施潔 徐小琴

（江蘇農牧科技職業(yè)學院動物醫(yī)學院 225300)

近年來，我國寵物犬慢性腎衰病例越來越多，該病治療成本高、周期長、并發(fā)癥多，對寵物診療提出了嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。因此，如何延緩CRF 進程，提高患犬的生活質量成為寵物臨床上的一個難題。研究表明，腸道菌群紊亂可促進慢性腎臟疾病的發(fā)展[2]，慢性腎病患者服用產短鏈脂肪酸（SCFAs）的益生菌或攝入SCFAs 能降低尿毒素和氧化應激水平、保護殘腎功能和提高生活質量[3,4]。陸江等發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰犬腸道菌群發(fā)生改變，且會促進慢性腎衰發(fā)生發(fā)展，提示腸道菌群可能成為犬慢性腎衰治療的潛在新靶點[5]。大黃素是中藥大黃的主要成分，臨床實踐發(fā)現(xiàn)，中藥大黃灌腸能減少尿毒癥毒素并改善腎臟功能。但其作用機制仍不清楚。因此，本試驗從腸道菌群及其代謝物角度研究大黃素對犬慢性腎衰的治療效果及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設計

試驗選擇16 條5 歲左右體重（5kg±1）kg 的犬，試驗前飼喂基礎日糧7d 后，各犬按照20mg/kg 體重肌肉注射慶大霉素，連續(xù)10d，若血清肌酐（Cr）及臨床癥狀無明顯變化，則按40mg/kg 體重間隔12h 重復給藥，直至血清Cr＞270μmol/L，尿素氮（UN）升高，停止用藥。隨機等分為2 組：慢性腎衰對照組和試驗組。試驗期間所有犬環(huán)境條件、基礎日糧、飼養(yǎng)管理相同，試驗組在飼喂基礎日糧的基礎上，按30mg/kg 體重口服給予大黃素，試驗期30d。

1.2 生產性能觀察

每天記錄采食量、體溫、心率、腹瀉情況、體重等生理活動變化。

1.3 菌群結構及代謝產物檢測

分別在試驗第10、20、30d 經(jīng)直腸采集無菌糞便，通過RT-PCR 技術檢測各組犬腸道菌群中細菌種類及數(shù)量。采用糞樣細菌DNA 提取試劑盒提取糞樣細菌總DNA，吸取2μL 作為擴增樣本，分別加入各目標細菌引物進行PCR 擴增，回收各細菌電泳條帶作為陽性模板，采用RT-PCR 法檢測各目標腸道細菌的拷貝數(shù)，使用Log (copies) 表示，引物設計見表1。同時采用氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸。

表1 不同細菌RT-PCR 引物序列

1.4 血液中肌酐（Cr) 和尿素氮（UN) 含量測定

分別在試驗的10、20、30d，經(jīng)頭靜脈采血，分離血清，用試劑盒法檢測Cr 與UN 含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結果用“平均值±標準差”表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件ANOVA 程序t 檢驗分析進行比較。p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 大黃素對慢性腎衰犬臨床癥狀的影響

由圖1 可知，慢性腎衰對照組犬采食量及體重顯著低于試驗組（p＜0.05），嘔吐及腹瀉發(fā)生率高于試驗組（p＜0.05）。試驗期間，慢性腎衰對照組有3 只動物死亡，試驗組無動物死亡。

圖1 各組犬的臨床表現(xiàn)（*,p＜0.05）

2.2 大黃素對慢性腎衰犬腸道菌群的影響

由圖2 可知，隨著飼喂時間推移，慢性腎衰對照組犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量逐步降低，而大腸桿菌的數(shù)量逐漸升高。給予大黃素后可回調這些細菌的變化。試驗結束時，試驗組雙歧桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)顯著高于慢性腎衰慢性腎衰對照組（p＜0.01），大腸桿菌數(shù)顯著低于慢性腎衰對照組（p＜0.01）。

圖2 大黃素對慢性腎衰犬腸道菌群的影響（**，p＜0.01）

2.3 大黃素對慢性腎衰犬腸道菌群代謝產物的影響

由表2 可知，與慢性腎衰對照組相比，試驗組糞中乙酸水平無變化（p＞0.05）；試驗組丙酸水平在第20 和30 天時分別顯著升高（p＜0.05）；試驗組丁酸水平在第20 和30 天時分別顯著升高（p＜0.05）。

表2 大黃素對慢性腎衰犬腸道菌群代謝產物的影響 單位：μmol/g

2.4 大黃素對慢性腎衰犬腎功能的影響

由圖3 可知，隨著慢性腎衰的發(fā)展，血清肌酐和尿素氮含量逐漸升高。給予大黃素可以降低慢性腎衰犬血清中肌酐和尿素氮含量。

圖3 大黃素對慢性腎衰犬腎功能的影響（**，p＜0.01）

3 結論與討論

肌酐和尿素氮是機體代謝的產物，并經(jīng)過腎臟排出體外，當腎臟衰竭時血液中的肌酐和尿素氮排出受阻，導致在血中積聚，因此它們是反映腎功能的重要指標。在本試驗第10 天，對照組與試驗組的血清肌酐和尿素氮均高于犬的正常參考范圍，表明慢性腎衰造模成功。隨著腎衰的發(fā)展，肌酐和尿素氮有升高趨勢，而給予大黃素干預后，二者含量有降低趨勢，說明大黃素可改善慢性腎衰患犬的腎功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂可導致腸道細菌極其有害代謝物進入血液循環(huán)，通過介導炎癥反應、腎臟纖維化及血管損傷等途徑參與了慢性腎衰的進展[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰患犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌減少，大腸桿菌等有害菌增多，糞中丙酸丁酸含量降低；大黃素可提高慢性腎衰犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌數(shù)量，減少大腸桿菌數(shù)量，提高糞中短鏈脂肪酸水平，提示腸道菌群紊亂在犬慢性腎衰過程可能也發(fā)揮重要作用，大黃素改善犬慢性腎衰的作用可能與調節(jié)腸道菌群及其代謝物有關。