PP2A的A/C亞基與多囊蛋白1抑制細胞增殖關系初步探討

萬燁東，楊慧欣，郝書弘，胡春梅，唐 艷*

(1.吉林大學第二醫(yī)院 腫瘤血液科，吉林 長春130041；2.吉林大學第二醫(yī)院 乳腺外科)

常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是一種以多發(fā)囊腫形成為特征的遺傳性腎病，主要是由編碼多囊蛋白1(polycystin-1，PC1)和多囊蛋白2(polycystin-1，PC2)的PKD1和PKD2基因突變所致，其中，PKD1基因所致的ADPKD占該病譜系的85% 左右[1]。PC1是一種分子量較大的跨膜糖蛋白，包含基質相互作用的胞外大N端和激活G蛋白并與伴侶蛋白相互作用的胞內C端，并通過mTOR、MAPK、cAMP、JAK-STAT、Wnt等多種信號途徑調節(jié)細胞轉導[2]。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族中的一員，是由結構亞基PP2A-A(也稱為PPP2R1A)、調節(jié)亞基PP2A-C(也稱為PPP2CA)和催化亞基PP2Ab(包含B56α)組成的異源三聚體復合物[3]，它是一種多功能酶，在細胞周期調控，形態(tài)以及發(fā)育中發(fā)揮作用。同時它又在信號轉導的級聯(lián)反應中與其他磷酸化酶和激酶相互作用，構成調節(jié)大分子從而調控下游信號轉導[4]。

在PC1調節(jié)的細胞增殖中，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通過磷酸化其下游靶蛋白來促進蛋白質合成(細胞增殖)，調節(jié)下游蛋白質翻譯。因S6 和 4EBP1是mTOR的底物，而PP2A通過使4EBP1 和 p70S6K去磷酸化調節(jié)翻譯的起始，提示PP2A是mTOR調節(jié)其下游效應器的主要磷酸酶[5]。在最近的研究中，我們發(fā)現PC-1通過磷酸酶PP2A/B56α途徑抑制細胞增殖[3]，但對于PP2A的A/C亞基是否參與PC1介導的增殖抑制作用尚未進一步明確。在本研究中，我們初步探討了PC1抑制細胞增殖與PP2A的A及C亞基的關系，從而進一步完善PC-1經磷酸酶PP2A/B56α抑制細胞增殖的研究。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和試劑

人HEK293T細胞、空白對照質粒pEGFP和PC1基因重組質粒pEGFP-PC1-5TMC均來自Xing-Zhen Chen博士實驗室。HEK293T細胞被置于含DMEM培養(yǎng)液的6孔板中孵育，并在該培養(yǎng)基中加入了L-谷氨酰胺，青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清，環(huán)境溫度保持在37℃，CO2濃度為5%。B56α抗體、PP2A-A抗體、PP2A-C抗體為Cell Signaling Technology 公司產品，PP2A-A,PP2A-C,PP2A-B56α的siRNA，小鼠單克隆抗HSP60(H-1)抗體及二抗購自美國圣克魯斯生物技術公司。綠色熒光蛋白(GFP)單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自鼎國生物公司，用于對GFP標記后的轉染細胞進行免疫印跡驗證。Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。用于細胞培養(yǎng)的DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購自長春尚寶生物公司?；瘜W發(fā)光試劑盒購自美國Bio-Red公司。

1.2 轉染

以2.0×104cells/孔密度接種6 孔細胞培養(yǎng)板,48 h后更換新鮮培養(yǎng)液，用無血清DMEM培養(yǎng)液分別稀釋質粒pEGFP及pEGFP-PC1-5TMC，用Lipofectamine 2000 試劑進行轉染。在37℃，5% CO2環(huán)境中6 h后，更換培養(yǎng)液為DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blotting法鑒定轉染細胞

轉染后24 h，各組細胞加入RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000 g速度離心后取上清液，使用BSA試劑盒進行蛋白含量測定，后取80 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，1∶2 000加入GFP單抗4℃孵育過夜，TBST液清洗3次后，1∶500加入對應的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 4℃孵育過夜，按化學發(fā)光試劑盒說明書進行測定。

1.4 RNA干擾實驗

PP2A-B56α亞基、A亞基和C亞基的siRNA被分別用來干涉HEK293T細胞中的PP2A-B56α，A亞基和C亞基基因，siRNA基因敲除的效率通過免疫印跡進行評估。

1.5 細胞增殖實驗

較諸于國別文學，比較文學提供的是一種更為開闊的文學視域，讓學者在探求不同國家之文學的同時，能夠把文學作品放在世界文學的格局和世界文學發(fā)展的長河中進行觀照，不僅能使我們更深入地了解自己國家和民族的文學，而且能對世界其他國家和民族的文學有“了解之同情”，從而知曉我們自身文學的特異之處，清楚別的國家的文學同我們自身文學的差異之所在，并能辨考其間相互影響的痕跡，或彼此共通的文學特質。有鑒于此，季羨林先生特別指出：

將HEK293T細胞瞬時轉染PC1-5TMC至100 mm培養(yǎng)皿，轉染24 h后，采用Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒按既往研究所述進行細胞增殖試驗[3,6]。應用酶標儀檢測各孔光密度值(optical density，OD)，并計算細胞增殖率，細胞增殖率(%)=OD測試/OD對照×100%。

1.6 數據處理

數據以平均值±標準誤表示，使用Sigma Plot 11軟件對數據進行統(tǒng)計分析，P值小于0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PC1基因重組質粒轉染HEK293T細胞株的鑒定

空白質粒及pEGFP-PC1-5TMC質粒上均攜帶有綠色熒光蛋白(GFP)，采用GFP單抗用Western blotting法觀察在分子量約68 KD大小處顯示 pEGFP-PC1-5TMC蛋白條帶，即pEGFP-PC1-5TMC質粒轉染成功(圖1)。

條帶 1:空白對照組；條帶 2:轉染組.

2.2 PP2A各亞基基因干涉效果鑒定

以HSP-60為內參對照，Western blotting結果提示，與非干涉組相比，PP2A-A干涉組、PP2A-C干涉組以及B56α干涉組各自亞基表達水平下降(圖2)。

圖2 Western blotting法驗證各亞基表達

2.3 各組細胞增殖率

在既往研究中，我們證實PC-1抑制細胞增殖是PP2A/B56α依賴的[3]，為了進一步明確PP2A的A和C亞基對該過程的影響，我們采用siRNA敲除后的PP2A 3個亞基及對照進行增殖實驗來驗證。結果顯示PP2A-A或PP2A-C的敲除并不影響PC1-5TMC對細胞增殖的抑制，而B56α的敲除則消除了抑制作用(圖3)，從而支持PC1通過PP2A(B56α)而不是PP2A的A或C亞基抑制細胞增殖。

圖3 Alarma Blue測定法比較各組細胞增殖抑制率

3 討論

PC-1的異常改變是遺傳性多囊腎病發(fā)病的關鍵因素之一，其多表達于遠端腎單位和集合管中，通過多種途徑調節(jié)腎上皮細胞的增殖活性。例如通過平衡Ca2+/cAMP濃度抑制腎上皮細胞增殖，負性調節(jié)mTOR及下游信號分子S6激酶和4EBP1/eIF4E抑制細胞生長等[5]。我們前期的研究證實了PP2A作為4EBP1和p70S6K的去磷酸化受體，參與了PC1通過mTOR途徑介導的增殖抑制，且證明調節(jié)亞基B56α參與其中[3]。

PP2A作為異源三聚體復合物，還包含有結構亞基PP2A-A和催化亞基PP2A-C。其中，結構亞基PP2A-A是一段包含15個串聯(lián)重復序列的支架蛋白，全長65 kDa，可分為α、β兩型。催化亞基PP2A-C全長36 kDa，與PP2A-A亞基一同構成PP2A去磷酸化的核心酶[7]。B亞基家族之間的同源性非常低，具有組織、細胞及底物的特異性，其中B56是B亞基中基因最多樣化的家族，其4個亞基在許多組織和細胞中差異性表達，PP2A的功能和活性主要依靠調節(jié)亞單位B56α[8]。

本研究為探討PP2A-A和PP2A-C是否參與了PC1對細胞增殖的抑制，對PP2A各亞基進行了siRNA干預，并通過免疫印跡證實干擾后各組對應亞基的低表達；通過增殖實驗我們發(fā)現PP2A-A或PP2A-C的敲除并不影響PC1-5TMC對細胞增殖的抑制作用，而B56α的敲除逆轉了這種作用(圖3)，這支持并驗證了PC1不是通過PP2A的A或C亞基，而是通過PP2A(B56α)抑制細胞增殖。

總之，本研究進一步驗證了PP2A在PC1抑制的細胞增殖中發(fā)揮作用的具體亞基，為進一步研究PP2A介導的PC1抑制細胞增殖的研究提供了基礎。