白茶對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化損傷和抗衰老作用研究

李　慕

白茶對(duì)秀麗隱桿線蟲抗氧化損傷和抗衰老作用研究

李慕

（邵陽學(xué)院湖南邵陽422000）

文章選取秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎冒缀零y針（Baihaoyinzhen, YZ）、白牡丹（Baimudan, MD）和壽眉（Shoumei, SM）來比較不同原料來源白茶的體內(nèi)抗氧化和抗衰老作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種白茶在百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激秀麗隱桿線蟲模型中，均表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老作用。在壽命和體內(nèi)抗氧化酶含量測定實(shí)驗(yàn)中，3種類型的白茶測試的濃度中均以1 000 mg/L的濃度效果最佳，并且在該濃度下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無明顯差異。在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

白茶；百草枯；抗氧化損傷；抗衰老

如何延長生物壽命、延緩衰老，一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。衰老是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，由于科研工作者觀察角度、研究方法的不同，關(guān)于衰老機(jī)制的學(xué)說也不盡相同。其中衰老的自由基學(xué)說認(rèn)可度較高，其認(rèn)為氧氣進(jìn)入生物體后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚匝踝杂苫?，過量的自由基會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化損傷的累積，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老[1]。而生物體內(nèi)所含的抗氧化酶體系及外部攝入飲食中所含的抗氧化活性物質(zhì)能夠通過終止自由基反應(yīng)，減少自由基的產(chǎn)生并增長個(gè)體的壽命[2-3]。秀麗隱桿線蟲的生命周期短，培養(yǎng)條件簡單、易于操作，且具備完備的發(fā)育和解剖學(xué)特征及復(fù)雜的遺傳學(xué)特征。其抗氧化及抗衰老相關(guān)基因與人類高度同源，使其成為在衰老研究領(lǐng)域中國際公認(rèn)首選的模式生物。

白茶是我國傳統(tǒng)的六大茶類之一，有研究證明，白茶具有良好的抗突變、抗癌、抗氧化效果，并且在神經(jīng)保護(hù)、預(yù)防糖尿病及生殖健康等方面有諸多效果[4]。但有關(guān)白茶的抗氧化損傷研究多數(shù)是體外實(shí)驗(yàn)[5]，體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)較為缺乏。利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，體內(nèi)研究白茶的抗氧化損傷、抗衰老功能以及分子機(jī)制少有報(bào)道。因采摘和制作工藝的不同，造成不同種類白茶含有的化學(xué)活性物質(zhì)存在較大的差異，其抗氧化和抗衰老效果也可能會(huì)有所不同。本研究選取3種代表性白茶（白毫銀針、白牡丹和壽眉）為研究對(duì)象，以秀麗隱桿線蟲為動(dòng)物模型，旨在探討不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老效果的差異和分子機(jī)制，為白茶促進(jìn)人體健康，延緩人體衰老的保健功效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選取白茶為2018年白毫銀針（Baihaoyinzhen, YZ）、2018年白牡丹（Baimudan, MD）、2018年壽眉（Shoumei, SM），制于福建福鼎。

白茶提取物制備過程：取200 g白茶葉進(jìn)行粉碎，過200目篩，獲得白茶干粉；白茶干粉加入2 500 mL 50 ℃～60 ℃的純凈水中，攪拌均勻，加入植物水解酶，在超聲波輔助下酶解4 h～6 h，滅酶，經(jīng)過高速離心取上清液，即得提取液；通過超濾膜對(duì)提取液進(jìn)行過濾，對(duì)于不同提取物選擇相應(yīng)溫度進(jìn)行真空濃縮，并干燥、儲(chǔ)存。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為秀麗隱桿線蟲N2品系、GA186突變型品系。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲壽命實(shí)驗(yàn)

秀麗隱桿線蟲壽命實(shí)驗(yàn)分為非氧化應(yīng)激組和氧化應(yīng)激組兩大組（各3個(gè)平行），每個(gè)大組里又分3個(gè)白茶提取液處理組（處理濃度分別為100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L）以及1個(gè)空白對(duì)照組（0 mg/L）。將野生型（N2品系）同步化的秀麗隱桿線蟲在不同濃度的3種白茶提取液培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至L2時(shí)期后，非氧化應(yīng)激組不做氧化應(yīng)激處理，氧化應(yīng)激組使用2 mM百草枯進(jìn)行氧化應(yīng)激處理。各組的每個(gè)培養(yǎng)皿上20條～25條成蟲，定期轉(zhuǎn)板，非氧化應(yīng)激組24 h記錄一次線蟲死亡數(shù)目，百草枯氧化應(yīng)激組12 h記錄一次，在進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)時(shí)，以線蟲L2時(shí)期為記錄起始時(shí)間。

1.2.2 氧化應(yīng)激組脂褐素分析實(shí)驗(yàn)

選取存活率為20％的線蟲，NaN3麻醉后制片，在倒置熒光顯微鏡（參數(shù)為激發(fā)340 nm～380 nm，發(fā)射430 nm）下拍攝線蟲脂褐素?zé)晒鈭D片，使用ImageJ軟件分析脂褐素?zé)晒馑?，并繪圖。

1.2.3 氧化應(yīng)激組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶含量分析

各組線蟲處理培養(yǎng)5 d后進(jìn)行收集，平均分配后，每管大約500條成蟲，進(jìn)行洗滌超聲破碎離心取上清液，根據(jù)SOD測定試劑盒的操作步驟來測定相關(guān)抗氧化酶含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；組間均值比較采用單因素方差分析，*表示＜0.05，差異顯著，**表示＜0.01，差異極顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

在非氧化應(yīng)激組中，不同種類白茶提取液各濃度處理后線蟲的平均壽命如表1所示。3種白茶的3種濃度提取液處理組與空白對(duì)照組對(duì)比，平均壽命經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析均無顯著性差異，說明在非急性氧化應(yīng)激狀態(tài)下，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度范圍內(nèi)，白茶提取液對(duì)秀麗隱桿線蟲的壽命沒有顯著性影響。

在百草枯處理的氧化應(yīng)激組中，不同種類白茶提取液各濃度處理后線蟲的平均壽命如表2所示。白茶的3種濃度提取液處理組線蟲的平均壽命相比空白對(duì)照組有顯著的延長，其中白毫銀針組效果最為顯著，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L濃度下分別延長了19.3％、24.8％和31.8％。壽眉組與白牡丹組相比，線蟲的平均壽命沒有顯著性差異，延長壽命效果略差于白毫銀針組。實(shí)驗(yàn)表明，在百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激組中，不同種類白茶提取液均對(duì)秀麗隱桿線蟲有保護(hù)作用，能夠提高秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激抵抗力，并且在測試的不同濃度中，1 000 mg/L濃度的效果最好。

表1不同濃度白茶處理后線蟲（非氧化應(yīng)激組）的平均壽命統(tǒng)計(jì)（單位：d）

白茶類型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ20.09±1.1220.31±1.2320.46±1.0520.39±0.95 SM20.09±1.1220.01±1.1520.20±1.0520.30±1.22 MD20.09±1.1218.98±1.0320.23±1.2120.33±1.02

表2不同濃度白茶處理后線蟲（氧化應(yīng)激組）的平均壽命統(tǒng)計(jì)（單位：d）

白茶類型提取液濃度/mg/L01005001 000 YZ3.11±0.853.71±0.95*3.88±0.98*4.10±0.90** SM3.11±0.853.41±1.10*3.52±1.15*3.67±1.08* MD3.11±0.853.39±1.03*3.49±1.13*3.63±1.02*

注：*代表與空白對(duì)照組相比，＜0.05；**代表與空白對(duì)照組相比，＜0.01。

2.2 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲脂褐素的影響

圖1　3種白茶提取物對(duì)野生型（N2）秀麗隱桿線蟲脂褐素的影響比較（氧化應(yīng)激組）

大部分生物在衰老的過程中，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體自噬后，未被消化的化合物和一些脂質(zhì)會(huì)聚集在一起形成脂褐素，這種現(xiàn)象在秀麗隱桿線蟲中也存在。脂褐素可以自發(fā)熒光，可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。生物越是衰老，脂褐素濃度越高，可以觀察到的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，因此脂褐素?zé)晒鈴?qiáng)度可以作為評(píng)價(jià)線蟲衰老程度的重要指標(biāo)[6]。

百草枯誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激組中，在100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L的處理濃度下，白毫銀針組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了10.2％、14.1％和21.3％，壽眉組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了7.3％、10.2％和16.8％，白牡丹組的脂褐素含量對(duì)比空白對(duì)照組分別下降了6.9％、9.4％和15.7％。如圖1所示，3種白茶提取液的3個(gè)濃度處理下的脂褐素積累相比空白對(duì)照組均有下降，其中白毫銀針組效果最為顯著，壽眉組與白牡丹組沒有顯著差異。由此可知，脂褐素積累的下降趨勢和壽命延長的趨勢基本吻合。

2.3 白茶提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶含量的影響

細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基、MDA、自由基和脂質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，引起細(xì)胞衰老，而抗氧化酶（SOD）可以抑制這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的氧化損傷作用，因此，通過測定其活性可以評(píng)估生物的抗氧化損傷能力。鑒于在1 000 mg/L的濃度下，3種白茶提取液在對(duì)氧化應(yīng)激組線蟲延長壽命和抑制脂褐素積累上效果最佳，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象為氧化應(yīng)激處理后的N2品系秀麗隱桿線蟲，3種白茶提取液濃度為1 000 mg/L，空白對(duì)照組濃度為0 mg/L。結(jié)果顯示，在急性氧化應(yīng)激條件下，與空白對(duì)照組相比，白毫銀針組、壽眉組和白牡丹組線蟲體內(nèi)SOD含量分別提高了61.1％、40.6％和35.3％（見圖2），說明白茶提取物可以提高線蟲體內(nèi)SOD的含量，增強(qiáng)其抗氧化損傷的能力。同時(shí)，白毫銀針組提升效果高于壽眉組和白牡丹組，與前期壽命實(shí)驗(yàn)和脂褐素實(shí)驗(yàn)趨勢相吻合，也進(jìn)一步證實(shí)了線蟲體內(nèi)SOD活性、脂褐素積累情況與壽命之間存在高度相關(guān)性。

圖2　白茶提取物對(duì)野生型（N2）線蟲體內(nèi)抗氧化酶含量的影響（氧化應(yīng)激組）

2.4 白茶提取物對(duì)GA186品系秀麗隱桿線蟲壽命的影響

圖3　白茶提取物對(duì)GA186品系秀麗隱桿線蟲壽命的影響

影響線蟲壽命的最主要分子機(jī)制為Insulin/IGF-1信號(hào)途徑，其關(guān)鍵性基因有。為了分析白茶提取物對(duì)處于急性氧化應(yīng)激條件下的線蟲的保護(hù)作用的分子機(jī)制是否與該經(jīng)典途徑相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選擇GA186（基因型為sod-3(tm760)X）突變型線蟲進(jìn)行氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，用濃度為1 000 mg/L的3種白茶提取液進(jìn)行處理，測定其壽命。收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，空白對(duì)照組（0 mg/L）的平均壽命為2.88 d，白毫銀針、壽眉和白牡丹實(shí)驗(yàn)組的平均壽命分別為2.77 d、2.83 d、2.70 d（見圖3）。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組線蟲平均壽命無顯著差異，說明白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，3種白茶提取物在急性氧化應(yīng)激秀麗隱桿線蟲模型中，表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老作用。3種類型的白茶提取液的測試濃度中，均以1 000 mg/L濃度的效果最佳，其中在相同提取液濃度條件下，白毫銀針的抗氧化作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉，而白牡丹與壽眉無明顯差異。白茶提取物的主要成分為茶多酚、黃酮、咖啡因等物質(zhì)，但是不能排除有極微量的小分子活性物質(zhì)也在里面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，所以本實(shí)驗(yàn)中并未對(duì)3種白茶提取物的主要化學(xué)成分進(jìn)行測定分析。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，3種白茶的提取物中，白毫銀針的茶多酚、總黃酮含量要高于壽眉和白牡丹，壽眉和白牡丹的相關(guān)成分含量差別不大，而茶多酚和黃酮類物質(zhì)體外和體內(nèi)抗氧化能力顯著[7]，這從側(cè)面揭示了白毫銀針抗氧化、抗衰老作用明顯強(qiáng)于白牡丹和壽眉的原因，但是也不能排除在不同類型白茶提取物中可能存在其他微量的活性物質(zhì)在發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

在生化水平上，3種白茶提取物均能提高線蟲體內(nèi)SOD的含量，增強(qiáng)其抗氧化損傷的能力，延緩線蟲衰老。而在分子水平上，白茶提取物的抗氧化損傷和抗衰老作用依賴于經(jīng)典的Insulin/IGF-1信號(hào)途徑。

[1]GUTTERIDGE J M C,HALLIWELL B.Free radicals and antioxidants in the year 2000:a historical look to the future [J].Annals of the New York Academy of Sciences,2000,899(1):136-137.

[2]WILLIS L M,SHUKITT-HALE B,JOSEPH J A.Modulat-ion of cognition and behavior in aged animals:role for antioxidant-and essential fatty acid-rich plant foods[J].The American Journal of Clinical Nutrition,2009,89(5):1602S-1606S.

[3]MATES J M,SANCHEZ-JIMENEZ F.Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes[J].Frontiers in Bioscience:a Journal and Virtual Library,1999,4(4):339-345.

[4]呂海鵬,張悅,陳興華,等.不同花色種類白茶的抗氧化活性及其主要品質(zhì)化學(xué)成分分析[J].食品科學(xué),2016,37(20):42-50.

[5]楊皓彬,楊娜,柏雪,等.白茶中茶多酚提取工藝及抗氧化活性的研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2014,14(12):24-31.

[6]王懷玲.藍(lán)莓多酚化合物抗衰老活性及作用機(jī)制研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2018.

[7]曾琪,任發(fā)政,雷新根,等.白茶體外抗氧化與體內(nèi)抗衰老作用的研究[J].茶葉科學(xué),2018,38(6):615-624.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.07.07

TS272.5

A

2095-1205(2022)07-20-03

湖南省教育廳一般項(xiàng)目“三種白茶的體內(nèi)抗氧化損傷效果與機(jī)制研究”（18C0812）