Notch信號在顱頜面骨骼發(fā)育及骨代謝中的作用

譚 浩 徐文杰 何忻宜 鄭雷蕾

1.口腔疾病與生物醫(yī)學重慶市重點實驗室 重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學工程重點實驗室，重慶 401147；2.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147

在胚胎發(fā)育時期，顱頜面骨骼主要由神經(jīng)嵴細胞和中胚層細胞發(fā)育而來。在局部生長因子及組織發(fā)生因子的調(diào)節(jié)下，間充質(zhì)細胞逐漸分化為軟骨細胞、成骨細胞等，并通過基質(zhì)合成及礦物質(zhì)沉積等方式使骨骼逐漸發(fā)育成形。在成骨和破骨兩種骨代謝活動的協(xié)同及偶聯(lián)調(diào)控下，發(fā)育成形后的顱頜面骨組織將繼續(xù)改建，以完成骨量的增長并維持骨形態(tài)結(jié)構的穩(wěn)定平衡。研究表明，顱頜面骨骼的發(fā)育過程和代謝過程都受到各類分子信號通路的轉(zhuǎn)導調(diào)控。近年來，Notch 信號通路逐漸被證明也參與調(diào)控顱頜面骨的生長發(fā)育。

Notch 信號通路是一種進化上高度保守的通路，在細胞、組織、器官的分化和發(fā)育過程中起著關鍵調(diào)控作用。自1917年Morgan 等在翅膀邊緣缺刻的果蠅中發(fā)現(xiàn)Notch 基因以來，已有大量的研究闡明了Notch 信號在骨發(fā)育和骨代謝疾病中的重要作用。例如，在顱頜面骨骼中，異常的Notch 信號會導致顳下頜骨關節(jié)炎、顱骨缺損、牙槽骨病理性吸收等，靶向調(diào)控Notch 信號對于控制這些疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。因此，本文將重點討論Notch 信號在顱頜面骨骼發(fā)育及骨代謝中的作用，并分析其中的分子機制，旨在為相關疾病的防治提供新的思路。

1 Notch 信號概述

哺乳動物的Notch 信號通路包括四種單通道跨膜受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、五種跨膜配體（Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1 和Jagged2）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（CSL-DNA 結(jié)合蛋白）。Notch 受體的結(jié)構包括胞外區(qū)（Notch extracellular domain，NECD）、跨膜區(qū)（transmembrane，TM）和胞內(nèi)區(qū)（Notch intra cellular domain，NICD）三個部分，其中NECD 主要負責結(jié)合配體，啟動信號傳導后被配體細胞所吞噬，而NICD 經(jīng)γ-分泌酶的S3 裂解從細胞膜上分離出來并轉(zhuǎn)運入核后負責控制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。重組信號結(jié)合蛋白-Jκ（recombination signal binding protein-Jκ，RBP-Jκ）是Notch 信號通路中的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過與入核的NICD 及Maml 形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物，調(diào)控和激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。Notch 通路的下游靶基因包括Hes 和Hey 家族蛋白，它們是進化上保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋類型的轉(zhuǎn)錄抑制因子，作為主要的Notch 效應分子直接影響細胞的分化及功能。

2 Notch 信號對顱頜面骨骼發(fā)育的影響

2.1 Notch 信號對軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控

在顱頜面骨中，軟骨向骨的轉(zhuǎn)化最早開始于胚胎的第8 周，軟骨細胞的生成及分化在其中起著決定性作用。軟骨細胞的生成及分化起源于間充質(zhì)細胞的聚集，隨后經(jīng)過軟骨細胞增殖、軟骨細胞肥大、基質(zhì)分泌等過程逐漸分化成熟。研究表明，在正常的軟骨分化過程中，Notch 受體的胞內(nèi)段NICD 表達于肥大區(qū)，抑制Notch 信號通路將導致軟骨細胞分化活躍，軟骨增殖增加，從而導致骨形成減少。反之，在軟骨細胞中過表達Notch1-NICD 信號，會導致軟骨細胞前體增殖減少，軟骨分化被抑制。以上研究證明，Nocth信號抑制軟骨的增殖及分化，阻礙Notch 信號會加速軟骨的形成。Notch 信號抑制軟骨分化主要是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Sox9（SRY-related high mobility groupbox 9）來實現(xiàn)的，Sox9 主要負責翻譯后修飾軟骨分化相關基因。研究表明，Notch 下游靶基因如Hes1 和Hey1 的下調(diào)會增加Sox9 的表達，進而促進軟骨分化。綜上所述，Notch 信號通路可通過調(diào)節(jié)Sox9 的表達來抑制軟骨細胞的分化，降低軟骨的形成，并有利于軟骨內(nèi)成骨的發(fā)生。

在顱頜系統(tǒng)中，顱底、顱蓋、髁突的骨骼都是以軟骨內(nèi)成骨的形式形成的。髁突軟骨是顳下頜關節(jié)的重要生長區(qū)，對于控制下頜骨生長、維持顳下頜關節(jié)的正常結(jié)構與功能具有重要意義。同時，髁突軟骨細胞的生成及分化也受到諸多因素的調(diào)節(jié)。有研究在髁突軟骨增殖層細胞中檢測到眾多Notch 信號通路相關基因的表達。此外，Notch 信號也被發(fā)現(xiàn)活躍于髁突表面的纖維軟骨干細胞中，并參與調(diào)控顳下頜關節(jié)的發(fā)育成形過程。應用γ-分泌酶DAPT 抑制髁突軟骨細胞中的Notch 信號轉(zhuǎn)導后，發(fā)現(xiàn)細胞增殖相關基因的表達降低，而Sox9 的表達明顯增高，軟骨細胞的分化被促進，提示Notch 信號通路促進了髁突軟骨細胞的增殖而抑制其分化。國內(nèi)有學者對小鼠顳下頜骨關節(jié)炎模型的髁突軟骨行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)髁突軟骨中Notch1、Jagged1、Hes5 的表達量顯著升高，利用Notch 抑制劑DAPT 治療可顯著改善髁突軟骨的破壞。以上研究證明Notch 信號參與調(diào)控髁突軟骨的形成及分化過程，同時抑制Notch 信號可能是治療顳下頜骨關節(jié)炎的一個新的治療靶點。

2.2 Notch 信號對顱縫生長發(fā)育的調(diào)控

骨縫生長是顱頜面骨特殊的生長發(fā)育方式之一，是指兩骨塊之間未骨化區(qū)域的骨質(zhì)沉積，顱頜面骨縫包括顱骨縫、腭中縫以及上頜骨周四條骨縫。有研究表明，Notch 信號通路在調(diào)節(jié)顱縫融合方面起著重要作用，其突變會導致顱縫的早期融合。在由Jagged1突變引起的Alagille 綜合征個體中，顱縫早閉被認為是典型特征之一。有研究在Jagged1 突變的顱縫中檢測到Notch2 及Hes1 的高表達，其顯著增強了該區(qū)域骨縫的成骨作用，并導致顱縫早閉。但不同類型顱縫中的Notch 信號可能發(fā)揮不同的作用。在小鼠和大鼠的正常顱縫融合中，后額縫在出生后的第一個月融合，而矢狀縫仍保持開放。Liu 等的研究發(fā)現(xiàn)，Notch 相關上下游信號的mRNA 水平在大鼠后額縫融合過程中逐漸下降以促進骨縫的融合，卻在矢狀縫中逐漸上升以維持骨縫的持續(xù)開放。由此可見，Notch信號在兩種顱縫中的適應性變化有利于維持顱縫的生理性融合與開放。以上研究提示，靶向調(diào)節(jié)Notch信號對于治療顱縫早閉、維持顱縫正常生長發(fā)育具有重要意義。

3 Notch 信號對顱頜面骨代謝的影響

3.1 Notch 信號對成骨細胞的影響

成骨細胞來源于充質(zhì)干細胞，沿著骨表面聚集，合成由膠原及其他蛋白質(zhì)組成的類骨質(zhì)，隨后鈣磷晶體在類骨質(zhì)內(nèi)不斷沉積，類骨質(zhì)礦化成熟。根據(jù)成骨細胞分化階段的不同，Notch 信號可能具有不同程度的抑制或誘導作用。研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號的激活抑制早期前體成骨細胞的分化，促進中間成骨細胞的增殖，抑制成熟成骨細胞的形成。當Notch 信號在未分成熟成骨細胞中被激活時，成骨細胞分化受損，骨質(zhì)形成減少。而在軟骨膜細胞分化為前成骨細胞（中間期）的階段，NICD 的表達促進了細胞增殖，其特征是骨髓腔內(nèi)過量的未成熟編織骨和纖維化細胞。除此之外，不同的Notch 受體在成骨細胞生成及分化過程中也承擔著不同的任務。Notch1 過表達通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路來阻礙成骨分化。成骨細胞特異性的Notch2 失活導致局部骨小梁的骨量增加，同時在體外也觀察到成骨能力的增強。SiRNA轉(zhuǎn)染靶向下調(diào)Notch3 的表達可促進正常下頜骨間充質(zhì)干細胞中成骨相關轉(zhuǎn)錄因子的表達。Nocth4 被發(fā)現(xiàn)在人牙槽骨來源的骨祖細胞成骨分化中上調(diào)，提示Notch4 可能促進成骨分化。由此可見，Notch 信號對成骨細胞的影響并非單一的促進或抑制，不同類型的Notch 信號在不同的局部環(huán)境下可能發(fā)揮不同的功能。

3.2 Notch 信號對破骨細胞的影響

破骨細胞來源于造血單核/巨噬細胞，其前體在RANKL 及M-CSF 等因子的作用下發(fā)生細胞融合，從而形成多核破骨細胞，具有去除礦化骨基質(zhì)的能力。破骨細胞的生成及分化受到多種信號的調(diào)控，其中RANKL/RANK/OPG 軸起主要作用。Notch 信號通路也被證明是破骨細胞發(fā)生及分化的重要調(diào)控因子。根據(jù)破骨細胞的分化狀態(tài)，不同的Notch 信號相關分子在其中發(fā)揮不同的功能。有研究認為，Notch 信號抑制破骨細胞的分化，例如在M-CSF 刺激下，缺失Notch1～3 的骨髓巨噬細胞分化成破骨細胞的速度反而加快。相反，另有研究表明，激活Jagged1 和Notch2可增強活化T 細胞核因子c1（Nuclear factor of activated T cells cl，NFATc1）啟動子的活性和表達，從而促進破骨細胞的形成。NICD2 與NF-κB 的相互作用會導致NFATc1 的激活，而NFATc1 是調(diào)節(jié)破骨細胞形成的主要轉(zhuǎn)錄因子。在Notch2 功能獲得模型中也發(fā)現(xiàn)破骨細胞數(shù)目增加，骨吸收活躍，從而導致明顯的骨質(zhì)減少。以上研究表明，Notch 信號對破骨細胞分化及功能的影響尚無定論，不同的Notch 受體在破骨分化過程中可能發(fā)揮不同的作用。

3.3 Notch 信號在牙槽骨骨代謝中的作用

發(fā)育完成后的顱頜面骨在一生中都在進行不斷地改建，通過成骨細胞及破骨細胞的作用來維持骨代謝動態(tài)平衡，以維持骨骼的正常形態(tài)與結(jié)構。牙槽骨是全身中變化最活躍的骨骼，在生理狀態(tài)下，它隨著牙齒的替換和移動而不斷改建。而在病理狀態(tài)下，受到刺激后的牙槽骨中破骨細胞異常活躍，骨代謝平衡被打破，導致牙周炎、種植體周圍炎等疾病的發(fā)生。已有研究報道，Notch 信號與各類牙槽骨異常骨代謝活動的發(fā)生相關，靶向調(diào)控Notch 信號對于控制牙槽骨的代謝改建具有重要意義。

Notch 信號被證明與牙周炎牙槽骨吸收有關。Djinic Krasavcevic 等納入80 例侵襲性牙周炎及慢性牙周炎患者，收集患者的各項臨床指標及齦溝液進行mRNA 水平檢測及線性回歸分析。結(jié)果顯示，Notch2 表達的上調(diào)影響侵襲性牙周炎患者的附著喪失，提示Notch2 的高表達可能是引起牙槽骨水平丟失的因素之一。另有一組臨床研究同樣也證實了這一點，他們發(fā)現(xiàn)齦溝液中Notch2 的高表達會加重侵襲性和慢性牙周炎所導致的牙槽骨吸收。然而，Notch1對牙周炎牙槽骨吸收間的影響仍有爭議。有學者發(fā)現(xiàn)，侵襲性牙周炎齦溝液中Notch1 和Jagged1 的下調(diào)會引起更多的破骨細胞形成，從而導致更嚴重的牙槽骨吸收。然而另有研究發(fā)現(xiàn)，外周血中Notch1 的表達上調(diào)反而會加重牙周炎的程度，并指出牙周炎的惡化可能與Notch1 促進了外周血輔助性T 細胞17（helper T cell 17，Th17）的分化有關。齦溝液和外周血中Notch1 的表達水平為何對牙周炎的發(fā)生、 發(fā)展發(fā)揮作用效果不一，目前尚不清楚，其潛在機制需進一步被闡明。此外，Notch 信號還被證明在種植體周圍炎相關骨吸收中發(fā)揮作用，研究顯示，Notch1 下調(diào)和部分關鍵炎癥調(diào)節(jié)因子表達上調(diào)的聯(lián)合作用可能引起種植體周圍炎中破骨細胞活性增加并導致骨吸收破壞，因此控制Notch 信號的表達水平，對預防種植體周圍炎骨吸收的發(fā)生同樣也具有重要參考價值。

在矯治力作用下，牙槽骨穩(wěn)定有序的代謝改建保證了牙齒的高效移動，不當?shù)某C治力會打破牙槽骨的骨代謝平衡。已有研究報道，Notch 信號受到機械應力的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)，間歇性壓縮應力下人牙周韌帶細胞中的Notch2、Notch3、Hes1 和Hey1 的mRNA 表達均顯著升高，表明機械應力可誘導激活Notch 信號通路。此外，在小鼠前成骨細胞中，間歇性應力可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路顯著上調(diào)Notch 靶基因的表達。這些研究提示，Notch 信號可能參與機械應力作用下的正畸牙移動周圍骨改建。在大鼠的正畸牙移動模型中，發(fā)現(xiàn)Notch1 和Jagged1 在受壓側(cè)的牙周膜中高表達，且與加力時間呈正相關，應用DAPT 抑制Notch 信號后，牙移動距離增加，破骨陽性細胞數(shù)量增加，骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/細胞核因子κB 受體活化因子配基（receptor activator of NF κB ligand，RANKL）比值下降，提示抑制Notch 信號會導致壓力側(cè)破骨吸收活躍，促進正畸牙移動。鑒于Notch 信號系統(tǒng)的復雜性，有關其對正畸力作用下牙槽骨骨代謝的作用及機制，還需通過更多的研究來進一步闡明。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，Notch 信號與顱頜面骨骼發(fā)育及骨代謝有著密不可分的聯(lián)系。Notch 信號在顱頜面軟骨內(nèi)成骨及骨縫成骨過程中活躍，它通過調(diào)控間充質(zhì)干細胞、軟骨細胞、成骨細胞的命運來維持顱頜面骨骼的正常發(fā)育，靶向調(diào)控Notch 信號有利于預防顱頜面骨畸形的發(fā)生。而Notch 信號在顱頜面骨代謝中的作用似乎尚無定論。這主要是由于成骨細胞及破骨細胞的生成及分化涉及多個階段，并受到多種因素的調(diào)控，且Notch 信號通路也涵蓋各類配體、 受體及下游靶點，從而導致不同的模式下激活的Notch 信號級聯(lián)在特定環(huán)境中發(fā)揮其特定的功能。對Notch 信號的調(diào)控可能成為一種有效的骨組織工程策略，利用Notch 信號對顱頜面骨代謝的調(diào)控作用，靶向防治牙周炎、種植體周圍炎以及不當矯治力所致牙槽骨代謝失衡可作為未來的研究方向之一。然而，目前對于Nocth 信號在顱頜面骨中的研究仍不夠全面和深入，期待未來有更多研究將Notch 信號用于顱頜面骨骼發(fā)育及骨代謝相關疾病的防治中。