高產(chǎn)IAA綠色木霉工程菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用

張豪， 李哲， 郭凱， 黃艷華， 郝永任

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所， 濟(jì)南 250014)

化肥的濫用導(dǎo)致環(huán)境污染問題趨于嚴(yán)重，農(nóng)藥和化肥的殘留，向環(huán)境釋放大量有害物質(zhì)，污染土壤、水源和食品，對人類健康及生存環(huán)境構(gòu)成極大威脅，因此研制出能夠降低化肥用量，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新型肥料十分必要。植物和植物根際土壤存在大量促生菌可使土壤無效營養(yǎng)有效化加強(qiáng)養(yǎng)分利用率，并可產(chǎn)生利于植物生長的代謝產(chǎn)物。

木霉(Trichodermaspp.)是一類重要的多功能絲狀真菌，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生防菌株和植物促生菌株，廣泛分布于土壤中。木霉可以很好地定植在植物根部，隨著植物根部的生長而延伸。Harman等[1-2]研究表明,木霉與植物的共生關(guān)系，并且通過定植能夠促進(jìn)植物生長。在共生階段，木霉可以產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物，從而對植物的生長產(chǎn)生一些影響，包括增加植物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)植物根的發(fā)育，改變植物根際微生物群落等。張量等[3]和Vinale等[4]在木霉菌的代謝產(chǎn)物中還分離純化出了木霉特有的類植物生長素6-PP (6-n-penty l-6H-py ran-2-one)，發(fā)現(xiàn)6-PP不僅能促進(jìn)植物的生長，同時在幫助植物抵抗病害的方面還有一些積極的作用。木霉還能促進(jìn)植物對土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。接種木霉能增加根系對各種營養(yǎng)物質(zhì)(銅、磷、鐵、錳和鈉)的吸收[5]，增加植物與其他生物的營養(yǎng)競爭能力。同時木霉還能產(chǎn)生一些物質(zhì)，溶解土壤中一些植物無法獲得的養(yǎng)分，如Fe3+、Cu2+和Mn4+等[6]。另外，木霉還能增加一些有毒金屬的吸收。研究表明，木霉和灌木柳樹的結(jié)合可以對污染的土壤起到一定的修復(fù)[7]。研究發(fā)現(xiàn)木霉對多種植物有促生作用。李衛(wèi)平[8]在研究綠色木霉(T.viride) 對蔬菜苗期病害的影響時發(fā)現(xiàn)，接種木霉的黃瓜，生長狀況更好。王彗中等[9-10]將哈茨木霉有機(jī)肥量使用于馬鈴薯和白菜，其產(chǎn)量明顯提高。Kthiri等[11]在研究木霉菌株包衣對小麥抵抗鐮刀菌冠腐病的影響時，也證明了木霉對小麥種子萌發(fā)，幼苗的生長和小麥對病原體的防御有積極的作用。Yedidia等[12]用哈茨木霉處理過的黃瓜后，黃瓜的體積也變得更大。

吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長素的信號物質(zhì)，也是在植物體內(nèi)普遍存在的生長素物質(zhì)。它對植物最明顯的作用是促進(jìn)細(xì)胞生長，使細(xì)胞的體積和重量增加，還具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)生根等生理功能。IAA并不是植物所特有的，在其他微生物中也發(fā)現(xiàn)了IAA[13]。自1977 年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)巴西固氮螺菌能合成IAA 后，更多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，土壤中超過50%的細(xì)菌可以產(chǎn)生IAA。

木霉代謝產(chǎn)物中含有多種植物生長激素，如：細(xì)胞分裂素(CTK)、生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)等，它們可調(diào)控植株的很多代謝過程。研究表明，生長素介導(dǎo)的信號通路是調(diào)控木霉生防促生能力的主要方式[14]。研究證實(shí)了木霉菌可通過產(chǎn)生IAA來促進(jìn)植株生長，經(jīng)木霉處理后可以有效地提高植物體內(nèi)生長素的水平。Gravel等[15]在研究木霉對番茄的生長生產(chǎn)的影響時，發(fā)現(xiàn)接種木霉的番茄，其產(chǎn)量要更高，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)主要是吲哚乙酸對其產(chǎn)量產(chǎn)生了促進(jìn)作用。綠木霉(T.virens)代謝產(chǎn)生的IAA，使擬南芥的鮮重增加了62%。另外，從康氏木霉(T.koningii)及哈茨木霉(T.harzianum)的代謝物中分離純化出來的類植物生長素6-PP (6-n-penty l-6H-py ran-2-one)[3]也能促進(jìn)小麥胚芽鞘、油菜及番茄幼苗的生長。6-PP不僅能促進(jìn)植物的生長，還能減少植物病害的發(fā)生[16]。

吲哚乙酸的生物合成可通過色氨酸依賴途徑和色氨酸非依賴途徑進(jìn)行[17]。 IAA的生物合成主要通過色氨酸依賴型的途徑，依據(jù)IAA合成的中間產(chǎn)物不同，劃分成4條支路：吲哚乙醛肟途徑(IAOX)、吲哚丙酮酸途徑、色胺途徑和吲哚乙酰胺途徑[18]。趙還發(fā)現(xiàn)了植物中色氨酸轉(zhuǎn)化為IAA的簡單兩步途徑[19]。

近年來，很多與生長素合成相關(guān)的重要催化酶系和關(guān)鍵調(diào)控基因都被鑒定和克隆。其中色氨酸脫羧酶(L-tryptophan decarboxylase，TDC)是色胺途徑中重要的催化酶之一[20]。同時，作為IAA合成的重要前體，色氨酸的合成和含量也是影響IAA產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。經(jīng)分支酸合成色氨酸的代謝途徑包含五步反應(yīng)，由多種催化酶的參與。其中催化最后一步合成的色氨酸合成酶(tryptophan synthase，TRPS)，是異四聚體結(jié)構(gòu)，由trpA和trpB基因編碼的α亞基和β亞基組成。在色氨酸代謝工程育種中，色氨酸合成酶是影響色氨酸產(chǎn)率的重要限速酶之一。

利用基因組分析和基因工程技術(shù)，調(diào)控木霉中重要代謝產(chǎn)物的表達(dá)是提高木霉抗逆性、促生能力的有效途徑。構(gòu)建篩選具有高效產(chǎn)生IAA 的木霉工程菌株可為促生生物肥料的研發(fā)等提供出發(fā)菌株，對促進(jìn)木霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

綠色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511，由本實(shí)驗(yàn)分離鑒定，已保藏在中國普通微生物菌種保藏中心(保藏號為CGMCC No. 16800)，保藏日期為2018年12月4日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基均購買于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L。

1.1.3 試劑

大腸桿菌DH5α、T4連接酶試劑盒、高保真Taq酶等購自于南京諾唯贊公司；過表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pBARGPE1-Hygro購自Addgene公司；限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI購自NEB公司；氨芐、潮霉素B和溶菌酶購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 綠色木霉TvTRPS和TvTDC基因序列的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)TvTRPS、TvTDC基因表達(dá)盒的克隆。參照真菌基因組提取試劑盒(E.Z.N.A Fungal DNA Kit，美國OMEGA公司)說明書提取綠色木霉Tv-1511基因組DNA。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvTRPS基因表達(dá)盒的完整序列，擴(kuò)增引物分別為：TvTRPS-FL-EcoRI-Forward：CGGAATTCATGGCGATTATCAA GCAGA(SEQ ID NO.5)和TvTRPS-FL-KpnI-Reverse：GGGGTACCCTAAAAGCGAAGGTCCCAGC(SEQ ID NO.6)。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvTDC基因表達(dá)盒的完整序列，擴(kuò)增引物分別為：TvTDC-FL-EcoRI-For-ward：CGGAATTCATGGATACAGAACAGT TTCG(SEQ ID NO.7)和TvTDC-FL-KpnI-Reverse：GGGGTACCCTACTCCAGCTTCAACTG(SEQ ID NO.8)。利用高保真PCR聚合酶預(yù)混液(2×Phanta Master Mix，南京諾唯贊)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有酶切連接位點(diǎn)(EcoRI和KpnI)的TvTRPS和TvTDC基因表達(dá)盒；對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA回收試劑盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京諾唯贊)回收擴(kuò)增出的DNA片段；將DNA片段連接T載體，測序驗(yàn)證序列的正確性，獲得TvTRPS和TvTDC基因表達(dá)盒的完整序列。

(2)DNA片段及表達(dá)載體雙酶切。將回收得到的TvTRPS和TvTDC基因表達(dá)盒和載體pBARGPE1用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI(NEB公司)進(jìn)行雙酶切；對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠，利用DNA回收試劑盒(FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司)回收酶切后的DNA片段和線性化的pBARGPE1質(zhì)粒。

(3)過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化。DNA片段與表達(dá)載體的連接采用T4連接酶(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行，TvTRPS或TvTDC基因表達(dá)盒分別與pBARGPE1線性化載體連接，反應(yīng)體系10 μL。

取50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞與10 μL連接體系混勻孵育進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后涂布到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上；37 ℃培養(yǎng)12～20 h后，挑取菌落至含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12～20 h后，送菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2 原生質(zhì)體制備及過表達(dá)工程菌株的構(gòu)建

(1)原生質(zhì)體制備。接種綠色木霉Tv-1511于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)10 d后，產(chǎn)生大量新鮮分生孢子；用10 mL生理鹽水(0.9% NaCl，0.05% Tween-20)洗滌菌絲表面，經(jīng)玻璃絨紙過濾，去除菌絲體得到孢子懸液；在玻璃紙覆蓋的PDA平板上，取200 μL孢子懸液涂布，28 ℃避光培養(yǎng)24 h，使PDA平板上的孢子萌發(fā)；配制溶解酶溶液：取0.15 g 溶解酶(Lysing enzyme，Sigma：L1412)溶于20 mL溶液I(1.2 mol/L D-sorbitol, 0.1 mol/L KH2PO4, pH為5.6)，0.2 μmol/L濾膜過濾除菌；取出PDA平板，將長有菌絲的纖維膜取出并反向貼在含有3～4 mL 裂解液的平板上，于28 ℃、100 r/min條件下處理 100 min；在無菌超凈臺下將平板中的纖維膜取出，確保大部分菌絲體保留在平板中，在此過程中可以用溶液I沖洗纖維膜上殘留的菌絲塊，利用槍頭反復(fù)吹吸液體中的菌絲塊200次以上，充分釋放內(nèi)部的原生質(zhì)體；用裝有4層紗布的1.5 mL 管過濾上述混合液，保留下層濾液并進(jìn)行4 ℃離心，2 000 r/min離心10 min，棄上清，保留底部的原生質(zhì)體。加1 mL溶液I，再次離心，棄上清；加1 mL 4 ℃預(yù)冷的溶液II (1 mol/L sorbitol, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH為7.5)，冰上得到原生質(zhì)體；用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)數(shù)，稀釋原生質(zhì)體至107個/mL。

(2)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及突變子篩選。冰上放置15 mL離心管，分別加入200 μL原生質(zhì)懸浮液、10 μL質(zhì)粒載體、50 μL PEG溶液(25% PEG600, 50 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L Tris-HCl, pH為7.5); 用槍頭混勻，冰上放置20 min；加2 mL PEG溶液，輕輕混勻，常溫下放置5 min；加2 mL溶液II，輕輕混勻；加2 mL混合液涂布在覆蓋層析紙的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，層析紙預(yù)先剪成條形；28 ℃避光培養(yǎng)24 h；將條形層析紙轉(zhuǎn)導(dǎo)含抗生素的PDA平板上，28 ℃避光培養(yǎng)36 h，待條形層析紙邊緣長出菌落后，挑取菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的抗生素平板上，培養(yǎng)2 d。

1.2.3TvTRPS和TvTDC過表達(dá)菌株的原生質(zhì)體融合

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得同時過表達(dá)TvTRPS基因和TvTDC基因的綠色木霉工程菌株，分別制備TvTRPS-OE和TvTDC-OE菌株的原生質(zhì)體。隨后，分別對兩種原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活和紫外滅活。原生質(zhì)體的滅活率隨處理時間的延長和升高，其中TvTRPS-OE原生質(zhì)體55 ℃熱處理25 min滅活率達(dá)到100%，TvTDC-OE原生質(zhì)體經(jīng)紫外處理20 min后滅活率達(dá)到100%。兩種滅活液等體積混合，并加入PTC溶液(PTC：60%PEG4000，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，pH為7.5)促融，35 ℃水浴保溫5 min，離心后梯度稀釋，混入再生培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，將平板上長出的單菌落轉(zhuǎn)接PDA平板后保存。

1.2.4TvTRPS、TvTDC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析

將3種木霉工程菌的孢子液分別接種于PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，通過4層無菌紗布過濾獲得無菌的菌絲體。將上述收集的木霉無菌菌絲體，經(jīng)過液氮充分研磨處理后，用Trizol法提取木霉菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用熒光定量PCR檢測3種木霉工程菌中TvTRPS基因和TvTDC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

第一，采用“1+1”模式，英文授課。哈工程學(xué)生在哈工程完成碩士階段第一學(xué)年課程后，赴法進(jìn)行第二學(xué)年的課程學(xué)習(xí)和6個月的企業(yè)實(shí)習(xí)，之后回哈工程完成碩士學(xué)位論文和答辯，畢業(yè)后獲法國南特礦業(yè)學(xué)院的科技碩士和哈工程的碩士學(xué)位。學(xué)生需向南特支付減免一半的學(xué)費(fèi)，具體費(fèi)用參照當(dāng)年學(xué)費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[3]。

1.2.5 色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶活性測定

將上述收集的木霉無菌菌絲體，冷凍狀態(tài)下進(jìn)行粉碎，加入有機(jī)溶劑，離心后，收集上清液，采用液相色譜法檢測木霉菌株中的色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶活性。

1.2.6 綠色木霉原始菌株及工程菌株產(chǎn)IAA能力的檢測

檢測了木霉菌株發(fā)酵產(chǎn)生長素IAA的情況。將200 μL木霉原始菌株(Wildtype)和工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃,180 r/min培養(yǎng)72 h，通過2層無菌紗布過濾菌絲體后，回收液體發(fā)酵液，回收的液體發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后取上清，利用GC-MS檢測發(fā)酵液中的IAA含量。

1.2.7 綠色木霉原始菌株及工程菌株耐脅迫能力的分析

接種綠色木霉原始菌株及工程菌株于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)10 d后，產(chǎn)生大量新鮮分生孢子；用10 mL生理鹽水(0.9% NaCl，0.05% Tween)洗滌菌絲表面，經(jīng)玻璃絨紙過濾，去除菌絲體得到孢子懸液；用30%的甘油懸浮，充分混勻，分裝到1.5 mL離心管中，標(biāo)記好名稱和時間，-80 ℃凍存；取一管孢子液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定孢子液的濃度。

在PDA平板上活化木霉原始菌株(Wildtype)和突變工程菌(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)，28 ℃避光培養(yǎng)48～72 h，使得原始菌株和突變工程菌木霉長勢均一，再使用打孔器制備大小均一的菌塊。轉(zhuǎn)移到含有300 mmol/L NaCl的PDA平板中央，進(jìn)行耐鹽實(shí)驗(yàn)研究，將不同處理的木霉平板培養(yǎng)一段時間后，分別測量其菌落生長直徑。

1.2.8 綠色木霉原始菌株及工程菌株對植物促生能力的分析

供試植物為小麥、黃瓜和椒樣薄荷。小麥促生實(shí)驗(yàn)：取大小一致、飽滿的小麥種子，洗凈并吸干水分，浸入木霉原始菌株(Wildtype)或工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的發(fā)酵液中24 h，隨后將種子置于濕潤濾紙上，觀察種子萌發(fā)及幼苗生長。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

黃瓜促生實(shí)驗(yàn)：挑選飽滿一致的黃瓜種子在實(shí)驗(yàn)室培育一定時間后，挑選長勢一致的幼苗移至水培裝置，進(jìn)行處理。以加入木霉原始菌株(Wildtype)或突變工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子液(終濃度為105)為不同處理組，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

椒樣薄荷促生實(shí)驗(yàn)：取在實(shí)驗(yàn)室扦插并栽培一段時間的大小一致的椒樣薄荷幼苗，移至水培裝置，進(jìn)行處理。以加入木霉原始菌株(Wildtype)或工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的孢子液(終濃度為105)為不同處理組，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)TvTRPS和TvTDC基因的綠色木霉的工程菌構(gòu)建及鑒定

從綠色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因組中鑒定出的分別編碼色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶的編碼基因。通過前期對Tv-1511開展的全基因組測序和精細(xì)基因組圖譜繪制工作(GenBank Accession No. VCEC00000000；BioProject：PRJNA543939；BioSample：SAMN11791795)，得到了TvTRPS和TvTDC基因及其編碼蛋白的詳細(xì)信息。TvTRPS(NCBI accession number MZ451173)和TvTDC(NCBI accession number MZ451174)基因的序列已分別提交到NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫。TvTRPS的氨基酸序列包含有tryptophan synthase alpha chain (trpA)和tryptophan synthase beta chain (trpB)結(jié)構(gòu)域[圖1(a)]，TvTDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，包含有pyridoxal-dependent decarboxylase結(jié)構(gòu)域[圖1(b)]。

aa為氨基酸圖1 TvTRPS和TvTDC蛋白-氨基酸序列結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic diagram of amino acid sequence and domain of TvTRPS and TvTDC

以木霉基因組為模板，擴(kuò)增并回收木霉TvTRPS和TvTDC基因，并通過雙酶切的方法成功構(gòu)建了TvTRPS和TvTDC表達(dá)載體。利用原生質(zhì)體，進(jìn)一步構(gòu)建了過表達(dá)木霉菌株TvTRPS-OE和TvTDC-OE(圖2)。利用原生質(zhì)體融合技術(shù),分別將上述原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活和紫外滅活，融合后，得到同時過表達(dá)TvTRPS基因和TvTDC基因的綠色木霉工程菌株(TvTRPS/TDC-OE)。

采用熒光定量PCR檢測TvTRPS、TvTDC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果表明，與原始菌株相比，獲得的過表達(dá)TvTRPS基因(TvTRPS-OE)或者TvTDC基因(TvTDC-OE)的綠色木霉工程菌株，其TvTRPS或者TvTDC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著提高，而同時過表達(dá)TvTRPS基因和TvTDC基因的綠色木霉工程菌株(TvTRPS/TDC-OE)，其TvTRPS和TvTDC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)都顯著提高(圖3)。

2.2 綠色木霉工程菌中色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶活性的變化

TvTRPS是色氨酸合成酶的編碼基因，TvTDC是IAA合成途徑關(guān)鍵酶色氨酸脫羧酶的編碼基因。過表達(dá)TvTRPS基因和TvTDC基因后，采用液相色譜法測定了色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶活性。結(jié)果表明，與原始菌株相比，過表達(dá)TvTRPS基因的綠色木霉工程菌株(TvTRPS-OE)中色氨酸合成酶的活性顯著提高，而過表達(dá)TvTDC基因的綠色木霉工程菌株(TvTDC-OE)中色氨酸脫羧酶的活性顯著提高，TvTRPS/TDC-OE菌株的色氨酸合成酶活性和色氨酸脫羧酶均顯著提高(圖4)。

primer為引物；terminator為終止子；promotor為啟動子圖2 TvTRPS和TvTDC表達(dá)載體Fig.2 Expression vectors of TvTRPS and TvTDC

圖3 木霉工程菌TvTRPS和TvTDC基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平Fig.3 Transcriptional expression levels of TvTRPS and TvTDC genes in Trichoderma engineered strains

圖4 木霉工程菌色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶的活性測定Fig.4 Determination of tryptophan synthase and tryptophan decarboxylase activity in Trichoderma engineered strains

2.3 過表達(dá)TvTRPS和TvTDC基因提高了綠色木霉產(chǎn)IAA的能力

生長素IAA具有多條生物合成途徑，色氨酸是其重要的前體物質(zhì)，而色氨酸脫羧酶(TDC)和色氨酸合成酶(TRPS)是IAA合成途徑中相關(guān)的重要催化酶系。因此在過表達(dá)TvTRPS基因和TvTDC基因后，測定木霉發(fā)酵液中IAA的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比原始菌株(Wildtype)，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)所產(chǎn)的IAA含量均顯著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的產(chǎn)IAA的量最高(圖5)。

圖5 木霉工程菌發(fā)酵液中IAA的含量檢測Fig.5 Determination of IAA content in fermentation broth of bacterial strains in Trichoderma engineered strains

2.4 過表達(dá)TvTRPS和TvTDC基因提高了綠色木霉的抗逆能力

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于夏天陽光暴曬，以及一些地方鹽堿地的特殊地質(zhì)條件，使得木霉新型肥量，在使用中往往面臨著高溫和高鹽的環(huán)境脅迫。在過表達(dá)TRPS和TDC基因后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)300 mmol/L NaCl脅迫下，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的直徑平均比原始菌株(Wildtype)顯著增加，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的直徑最大，如圖6(a)、圖6(b)。在液體培養(yǎng)基中，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的生物量比原始菌株(Wildtype)顯著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的生物量最大[圖6(c)]。在35 ℃的液體培養(yǎng)環(huán)境下，工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)的生物量比原始菌株(Wildtype)顯著提高，其中TvTRPS/TDC-OE菌株的生物量最大(圖7)。

圖6 木霉工程菌耐鹽能力的分析Fig.6 Salt tolerance analysis of Trichoderma engineered strains

圖7 木霉工程菌高溫抗性的分析Fig.7 Analysis of high temperature resistance of Trichoderma engineered strains

2.5 過表達(dá)TvTRPS和TvTDC基因的綠色木霉工程菌具有更強(qiáng)的植物促生能力

木霉菌屬于重要的植物根際促生真菌。在植物根際接種木霉孢子液，可以有效地促進(jìn)植物的生長。在小麥、黃瓜和椒樣薄荷種植中，接種了綠色木霉Tv-1511的孢子液，有效的促進(jìn)了植物的生長，而且接種了過表達(dá)TRPS和TDC基因的工程菌菌株效果更明顯。

結(jié)果表明，木霉工程菌株(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長和黃瓜、椒樣薄荷的促生效應(yīng)明顯強(qiáng)于原始菌株(Wildtype)。其中經(jīng)TvTRPS/TDC-OE發(fā)酵液處理的小麥促生效果最明顯，如圖8所示。

圖8 木霉工程菌的促生效果Fig.8 Growth-promotion effects of Trichoderma engineered strains

3 討論

IAA作為植物生長素，不僅植物可以生產(chǎn)，一些菌類也可以生產(chǎn)。木霉作為代替化肥的新型生物肥料，可以通過分泌一些IAA類似的代謝產(chǎn)物來幫助植物的生長。Contreras-Cornejo等[21]通過氣相色譜-質(zhì)譜在木霉培養(yǎng)液中檢測到吲哚類化合物吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙醛(IAAld)和吲哚-3-乙醇(IEt)，并用這些物質(zhì)處理擬南芥，擬南芥表現(xiàn)出生長態(tài)勢更茂盛。Mir等[22]在芥菜中加入IAA，很好地促進(jìn)了薺菜的生長。IAA作為生長素，在植物生長和發(fā)育的各個方面發(fā)揮作用[23-24]。IAA能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、生長，能夠促進(jìn)植物根的發(fā)育和側(cè)根的生長。在植物生長過程中，還能增加植物光合速率，提高植物生產(chǎn)糖類的能力[25-27]。

IAA的生物合成有依賴色氨酸和非依賴色氨酸兩條途徑。依據(jù)IAA合成的中間產(chǎn)物不同, 依賴色氨酸的生物合成過程通常又劃分成4條支路：吲哚乙醛肟途徑、吲哚丙酮酸途徑、色胺途徑和吲哚乙酰胺途徑[28]。另外隨著生長素合成途徑中重要催化酶功能的明確, 也有研究將依賴色氨酸的生長素合成過程分為CYP79B途徑、YUCCA(YUC)途徑、吲哚乙酰胺途徑和吲哚丙酮酸途徑[29-30]。從綠色木霉(Trichodermaviride)Tv-1511基因組中鑒定出分別編碼色氨酸合成酶、色氨酸脫羧酶的編碼基因TvTRPS和TvTDC，它們都與色胺途徑有關(guān)。隨后成功構(gòu)建了TvTRPS和/或TvTDC過表達(dá)的綠色木霉工程菌(TvTRPS-OE、TvTDC-OE和TvTRPS/TDC-OE)，顯著提升了IAA和合成和在發(fā)酵液中的含量，增強(qiáng)了綠色木霉的抗逆和促生能力。結(jié)果表明TvTDC基因和TvTRPS基因參與了綠色木霉的IAA合成。色胺途徑的第一步就是TDC(TRP decarboxylase)催化色氨酸形成色胺，但剩余過程，色胺如何變成IAA的過程還需深入研究[31]。

4 結(jié)論

木霉具有代謝途徑繁多，代謝產(chǎn)物豐富，且基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格控制，木霉作為一類重要的多功能絲狀真菌，是工業(yè)生產(chǎn)中重要的酶和代謝產(chǎn)物的工程菌。以綠色木霉基因組為模板克隆到了TvTDC基因和TvTRPS基因，并通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體融合法構(gòu)建了TvTDC基因和TvTRPS基因的過表達(dá)綠色木霉工程菌株。得出如下結(jié)論。

(1)經(jīng)試驗(yàn)證明，所構(gòu)建的3種綠色木霉工程菌與原始木霉菌株相比，其生產(chǎn)IAA的能力顯著增強(qiáng)，同時具有更強(qiáng)的抗逆和植物促生能力，能夠促進(jìn)木霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，因此具有良好的實(shí)際應(yīng)用之價值。

(2)木霉在工業(yè)上是重要的產(chǎn)酶菌株，在農(nóng)業(yè)上具有促生作用，也是廣泛應(yīng)用的生防菌，一般用于生產(chǎn)生物肥料和木霉菌劑使用。運(yùn)用基因組分析和基因工程技術(shù)，提高了木霉產(chǎn)IAA的能力，增強(qiáng)了木霉的抗逆和對植物的促生能力，對木霉作為生物肥料的應(yīng)用起到了積極的作用，同時也證明了運(yùn)用基因組分析和基因工程技術(shù)來促進(jìn)木霉的生產(chǎn)應(yīng)用是具有可行性的。

隨著木霉的研究深入和基因技術(shù)的發(fā)展，木霉作為優(yōu)秀的生產(chǎn)工程菌，運(yùn)用基因技術(shù)對木霉基因進(jìn)行不斷地挖掘，進(jìn)一步提高木霉在促生、抗逆和生防方面的生產(chǎn)應(yīng)用，仍具有重要的意義。