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    新型牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒基因組的鑒定

    2022-08-23 07:36:32楊李玲郭迎香位紅穎方藝菲姜敬哲
    南方水產(chǎn)科學 2022年4期
    關(guān)鍵詞:進化樹牡蠣圓環(huán)

    楊李玲,郭迎香,位紅穎,王 萌,方藝菲,朱 鵬,姜敬哲

    1. 天津農(nóng)學院,天津 300384

    2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室,廣東 廣州 510300

    3. 廣州美格基因科技有限公司,廣東 廣州 510005

    4. 從化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,廣東 廣州 510925

    5. 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,上海 201321

    6. 上海海洋大學,上海 201306

    牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目,廣泛分布于世界各地,其營養(yǎng)價值高,是全球養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的海水養(yǎng)殖品種。中國作為最大的牡蠣生產(chǎn)國,2019 年牡蠣產(chǎn)量達到 8 259×104t,占世界總產(chǎn)量的85.3% (數(shù)據(jù)來源:http://www.fao.org)。然而,受環(huán)境變化、陸源污染及種質(zhì)退化等因素影響,牡蠣病害的發(fā)生日趨頻繁,對其養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展造成負面影響[1]。

    1972年Farley等[2]首次報告了牡蠣病毒性疾病病例,證明在高溫條件下牡蠣死亡事件與皰疹病毒存在關(guān)聯(lián),并將這種病毒命名為1型牡蠣皰疹病毒 (Ostreid Herpesvirus-1, OsHV-1)。該病毒在長牡蠣 (Crassostrea gigas) 中具有高致病性,同時對其他多種雙殼類也造成嚴重影響[3-4]。除OsHV-1外,其他報道過的與牡蠣相關(guān)的病毒還包括:乳多空病毒科 (Papovaviridae) 病毒,可能導致牡蠣“卵囊炎”,引起卵子和配子細胞肥大;鰓壞死病毒,屬虹彩病毒科 (Iridoviridae),可能是導致20世紀60 年代后期葡萄牙牡蠣 (C. angulata) 種群大規(guī)模死亡的主要原因;另外,披膜病毒 (Togaviridae)、呼腸孤病毒 (Reoviridae) 和小 RNA 病毒 (Picornavridae) 在貝類宿主中也有多次報道[5]。牡蠣等濾食性貝類在過濾大量海水獲取有機顆粒物營養(yǎng)的同時,也會將水體中的其他物質(zhì)如病毒、污染物等帶入體內(nèi),并通過外套膜進行濃縮。因此,如果牡蠣養(yǎng)殖水域受到人類活動影響,牡蠣體內(nèi)可能還會富集諸如諾如病毒 (Norovirus, NV)、甲型肝炎病毒 (Hepatitis A Virus, HAV) 和星狀病毒 (Astrovirus, AV) 等引起人類消化道疾病的食源性病毒,但這些病毒并不是牡蠣的病原[6]。病毒基因組是疾病診斷、流行病檢測和病原生物學研究的基礎(chǔ)。由于無脊椎動物沒有能夠穩(wěn)定傳代的細胞系,除了OsHV-1和一些食源性病毒外,其他牡蠣相關(guān)病毒的鑒定證據(jù)主要基于病理學和電子顯微鏡觀察,很少能夠拿到基因組序列[7]。因此,基因組數(shù)據(jù)的匱乏是牡蠣病害研究進展緩慢的一個主要原因。高通量測序和宏病毒組技術(shù)的運用,克服了傳統(tǒng)病毒學研究對宿主細胞培養(yǎng)的依賴,極大提高了新病毒的發(fā)現(xiàn)和鑒定效率。近些年,已在海洋環(huán)境、無脊椎動物、低等脊椎動物及人類等相關(guān)研究中得到了廣泛應(yīng)用,鑒定到大量的新型病毒[8-11],極大地擴展了人們對病毒世界的認知。

    本研究基于前期工作所獲得的華南沿海多地養(yǎng)殖牡蠣宏病毒組數(shù)據(jù),進一步運用生物信息學工具對其進行深入挖掘,發(fā)現(xiàn)并鑒定到5條新型牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒基因組,為促進牡蠣病毒及貝類病害相關(guān)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)來源與篩選

    課題組前期工作通過對中國華南沿海多地養(yǎng)殖牡蠣進行宏病毒組測序,得到約25億條測序原始序列 (reads)[12]。對測序數(shù)據(jù)進行 Fastp (V0.20.0)[13]質(zhì)控去除低質(zhì)量和接頭序列,用Megahit (V1.2.9)[14-15]將reads組裝成重疊群 (contig) 片段,以NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為參考,用Diamond[16](V0.9.24.125) 進行比對注釋,并用 Megan 6[17]進一步對注釋結(jié)果進行分類,篩選其中5條基因組完整的、疑似為圓環(huán)病毒科 (Circoviridae) 的病毒序列 (Contig ID:ML2-k141_11943、ML2-k141_27933、QZd1-k141_2132、T5S3-k141_267932、ZHd1-k141_220676)進一步深入分析。

    1.2 開放閱讀框預(yù)測與比對

    基于 NCBI ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 進行開放閱讀框 (Open reading frame, ORF) 預(yù)測,其中 Minimal ORF length (nt) 選取 75,Genetic code選取 standard,ORF start codon to use 選擇 Any sense codon,忽略 nested ORFs。用預(yù)測到的ORF進行Blastp比對,其中數(shù)據(jù)庫選擇nr蛋白數(shù)據(jù)庫,e為0.000 001。對于有比對結(jié)果的ORF,取一致性最高的蛋白用tblastn方法反向比對本研究中病毒的基因組序列,驗證5條ORF序列是否完整,并用DNAstar進行翻譯,得到最終的蛋白序列。

    1.3 基因組進化樹的構(gòu)建及比較基因組分析

    將5條病毒全基因組序列提交至VIPTree(V1.9)[18](https://www.genome.jp/viptree/),選擇核酸類型為ssDNA,選擇宿主病毒類型為Eukaryote,選擇基因預(yù)測的遺傳密碼為Eukaryotic,構(gòu)建基因組進化樹。利用MAFFT[19]將5條病毒基因組序列與近源的病毒基因組序列進行比對,并使用TrimAI[20]進一步修剪以去除對齊不明確的區(qū)域,利用 MEGA[21]構(gòu)建 Neighbor-joining Tree,設(shè)置 Bootstrap Replications為 1 000,選擇 substitution model為 p-distance,設(shè)置 Site Coverage Cutoff為50%。

    根據(jù)與5條病毒復(fù)制酶蛋白一致性最高的參考蛋白序列 (YP_006281010.1),計算參考蛋白與5條病毒序列之間的 Amino Acid Identity (AAI)。下載YP_006281010.1對應(yīng)的基因組序列 (NC_017843.2),利用 Orthologous Average Nucleotide Identity Tool (OAT) 對 NC_017843.2 和 5 條病毒序列計算兩兩序列的 Average Nucleotide Identity (ANI),得到兩兩序列的ANI,使用R的ggcorrplot包對數(shù)值進行可視化。同時在VIPtree中進行基因組兩兩比較分析:設(shè)置 positioning of each sequence 為auto,colors為 default,ticks of genomes為 shown,vertical dashed lines為 shown,representation of tBLASTx hits為 normal。

    1.4 復(fù)制酶蛋白進化樹分析

    因5條病毒復(fù)制酶蛋白序列Blatsp比對的結(jié)果存在重疊,因此僅以其中1條序列(ML2-k141_11 943)比對結(jié)果前50的序列和5條序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,建樹過程參考1.3。

    1.5 復(fù)制酶蛋白結(jié)構(gòu)域分析

    在NCBI上下載ARI44308.1[22],用Jalview對ARI44308.1、YP_006281010.1和這5條病毒復(fù)制酶蛋白序列進行結(jié)構(gòu)位點分析,使用ClustalW進行比對,下載保存SVG格式文件。用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) 軟件進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測,同時采用Swiss model進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。

    1.6 病毒豐度分析

    為了計算每個病毒的相對豐度值,首先合并5 條病毒基因組序列用 salmon (V0.13.1) index[23]命令生成參考基因組數(shù)據(jù)集,然后再利用salmon quant[23]命令將全部牡蠣病毒組文庫的clean reads逐一映射 (Mapping) 到參考基因組上,統(tǒng)計映射上的reads數(shù),根據(jù)調(diào)整后的FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments) 計算公式計算各病毒的相對豐度值。

    式中:G為比對的reads數(shù);T為測序reads總數(shù)(×106);L為基因組長度 (kb)。

    2 結(jié)果

    2.1 病毒注釋結(jié)果

    通過對中國華南沿海多地養(yǎng)殖牡蠣樣品進行宏病毒組測序,消除低質(zhì)量序列并組裝,共獲得3 375 091 條非冗余 contig序列,進一步與 NCBI的NR庫進行blastp比對和分類注釋最終獲得731 536條疑似病毒來源的contig,篩選其中5條基因組相對完整的、被注釋為圓環(huán)病毒的基因組序列進一步分析,具體信息見表1。

    表1 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒基因組信息Table 1 Genome information of oyster-related circoviruses

    2.2 基因組水平進化樹分析

    為了明確病毒的分類,用5條基因組序列與全部單鏈DNA病毒一起構(gòu)建基因組水平的進化樹(VIPTree,圖1)?;蚪M樹中內(nèi)圈顏色代表病毒科(Family),主要包括圓環(huán)病毒科、雙生病毒科(Geminiviridae)、類雙生病毒科 (Genomovirdae) 和細項圈病毒科 (Anellovridae)。從科水平分類看,圓環(huán)病毒科在整個單鏈DNA基因組樹中占據(jù)絕大部分。候選的5條序列均聚在了一個小的分支 (紅色五角星標識,圖1),且在圓環(huán)病毒大分支內(nèi),說明它們屬于圓環(huán)病毒科成員。圖1的最外圈代表病毒的宿主,包括脊索動物門、節(jié)肢動物門、綠藻門和軟體動物門。從宿主來源看,候選病毒分支周圍主要是節(jié)肢動物宿主和其他來源宿主,而節(jié)肢動物與軟體動物同屬無脊椎動物。

    圖1 單鏈DNA病毒基因組進化樹 (VIPtree)Fig. 1 Phylogenetic tree of single-stranded DNA virus genome (VIPtree)

    為了解5條病毒序列的進化關(guān)系,將5條病毒基因組序列與近源的病毒基因組序列進行比對。5 條病毒序列與 NC 017843.2、NC 027797.1、NC 030466.1均聚在了一支,其中除了NC 030468.1來源于海水樣品外,NC 017843.2、NC 027797.1、NC 030466.1分別來源于橈足動物、珊瑚、大猩猩樣品(圖2)。該聚類結(jié)果與5條候選序列的來源背景基本一致 (海洋、動物)。值得注意的是,QZd1-k141_2132與T5S3-k141_267932在全基因組水平關(guān)系最接近。

    圖2 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒基因組與近源基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of five oyster-related circoviruses and relative viral genome sequences

    2.3 全基因組序列和復(fù)制酶蛋白序列一致性分析

    用候選序列中預(yù)測到的復(fù)制酶蛋白序列在NCBI上進行Blastp比對,發(fā)現(xiàn)5條病毒序列均與YP_006281010.1的蛋白序列相似性較高。該序列注釋為圓環(huán)病毒復(fù)制酶蛋白,該蛋白來源于一種海洋節(jié)肢動物——夏唇角水蚤 (Labidocera aestiva)。用其基因組序列 (NC_017843.2) 和5條序列進行兩兩比較,NC_017843.2基因組序列與5條候選序列的ANI介于0%~72%,其中最高的是QZd1-k141_2132 (63%),最低的是 ML2-k141_27933 (0%,圖3)。5條病毒序列兩兩間的一致性為0%~94%,其中QZd1-k141_2132與T5S3-k141_267932的最高(94%),ML2-k141_27933和其余4條病毒序列均為0%。根據(jù)ICTV規(guī)定的圓環(huán)病毒科在種水平劃分閾值80%來看,5條序列可能屬于4個不同的新種,且均與NC_017843.2不同,即QZd1-k141_2132與T5S3-k141_267932可能屬于同一種,而其余3條序列屬于另外3個種。復(fù)制酶蛋白序列一致性分析結(jié)果一致。

    圖3 圓環(huán)病毒基因組序列間的ANI (a) 和復(fù)制酶蛋白序列間的AAI (b)Fig. 3 ANI value among genomic sequences (a) and AAI value among replication proteins of circoviruses (b)

    2.4 比較基因組分析

    比較基因組分析表明,夏唇角水蚤圓環(huán)病毒基因組序列 (NC_017843.2) 與5條候選基因組序列均在復(fù)制酶蛋白區(qū)域 (即YP_006281010.1) 具有相似性 (圖4),但在另一個ORF,即疑似衣殼蛋白區(qū)域,均未見明顯的相似性??梢姾蜻x病毒的衣殼蛋白屬于新型的衣殼蛋白,與牡蠣宿主細胞受體的特異性識別相關(guān)。

    圖4 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒比較基因組分析圖Fig. 4 Comparative genome analysis of oyster-related circoviruses

    2.5 Neighbor-joining 進化樹構(gòu)建

    因5條病毒復(fù)制酶蛋白序列Blatsp比對的結(jié)果存在重疊,因此僅以其中1條序列(ML2-k141_11943) 比對結(jié)果的前50的序列和5條序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。ML2-k141_11943、ZHd1-k141_220676、QZd1-k141_2132、T5S3-k141_267932 這4個病毒和YP_006281010.1、GAC77785.1、QNG41123.1、AXQ66182.1形成了一個分支,其中YP_006281010.1、QNG41123.1和 AXQ66182.1的來源是動物宏基因組 (具體物種不明),GAC77785.1來源于海洋沉積物 (圖5)。ML2-k141_27933序列與AXH76045.1、AXH74760.1形成了一個分支,該序列來源同樣是動物宏基因組 (具體物種不明)。

    圖5 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒復(fù)制酶蛋白進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree of replication proteins of oyster-related circoviruses

    2.6 功能分析

    為查明復(fù)制酶ORF中是否有相關(guān)功能位點和結(jié)構(gòu)域,用ARI44308.1和YP_006281010.1作為參考序列與5條候選序列進行全局比對 (圖6)。雖然5條候選序列在典型環(huán)狀病毒的復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域(HUH phage replication sub-family) 處與參考蛋白序列差異較大。但SMART分析發(fā)現(xiàn),除ZHd1-k141_220676外,余下的4條候選序列與2條參考序列都鑒定到明確的HUH結(jié)構(gòu)域。復(fù)制酶蛋白結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,5條候選序列,尤其是ML2-k141_11943、ML2-k141_27933和T5S3-k141_267932,與YP_006281010.1復(fù)制酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)存在較高的相似性 (圖7)。

    圖6 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒復(fù)制酶蛋白序列比對Fig. 6 Sequence alignment of oyster-related circoviruses

    圖7 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒復(fù)制酶蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 7 Three-dimensional structure prediction of replication protein of oyster-related circoviruses

    2.7 病毒豐度分析

    為了計算每個病毒的相對豐度值,用salmon統(tǒng)計映射上的reads數(shù)。在牡蠣測序文庫中均檢測到了5條備選病毒序列的reads,F(xiàn)PKM豐度各不相同 (表2)。整體來看,T5S3-k141_267932的分布最廣泛,ML2-k141_11943在特定樣品中的豐度最高。具體來看,ML2-k141_11943和ML2-k141_27933 在 ML1 中豐度最高 (148.67 和 2 080.33);QZd1-k141_2132和T5S3-k141_267932在ChYJ1509Da中豐度最高 (542.87和76.93);ZHd1-k141_220676在 ChZH1511Da 豐度最高 (55.17)。

    表2 牡蠣相關(guān)圓環(huán)病毒豐度分析Table 2 Analysis of abundance of oyster-related circovirus virus

    3 討論

    近年來,我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖貝類大規(guī)模死亡事件頻發(fā),涉及的貝類品種、養(yǎng)殖面積和區(qū)域范圍不斷擴大,使貝類養(yǎng)殖業(yè)遭受重大經(jīng)濟損失[24]。傳統(tǒng)病毒學研究嚴重依賴宿主細胞的培養(yǎng),由于缺乏可穩(wěn)定傳代的無脊椎動物細胞培養(yǎng)技術(shù),加之相關(guān)研究投入有限,貝類病毒研究進展十分緩慢[25]。由于高通量測序和病毒組技術(shù)的應(yīng)用,近年幾項海洋無脊椎動物病毒研究成果的發(fā)表,加深了人們對于海洋動物病毒的了解。2016年,Shi等[26]報道了關(guān)于無脊椎動物RNA病毒組的重要研究成果,對包括多種貝類生物在內(nèi)的約400種無脊椎動物 (包括牡蠣) 組織混合后的約200個文庫進行了測序,發(fā)現(xiàn)了1 400多種新型RNA病毒,極大地豐富了RNA病毒的多樣性和種類。Rosani和Gerdol[27]從長牡蠣 (C. gigas)和地中海貽貝 (Mytilus galloprovincialis) 宿主轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定了7個幾乎完整的RNA病毒基因組,屬于小核糖核酸病毒目 (Picornavirales),其中有6種是全新的病毒。Ian等[28]對健康的與被感染的海星進行了比較研究,鑒別出1種細小病毒科 (Parvoviridae) 的疑似致病病原,并且明確其在浮游生物和海洋沉積物中也廣泛存在。Cui[29]從不同海域共采集了3門6綱58種的海洋無脊椎動物樣品 (包括牡蠣),并利用宏轉(zhuǎn)錄組的測序方法對不同物種的RNA病毒組進行研究,鑒定出涵蓋9個病毒家族 (Durnavirales、Totiviridae、Bunyavirales、Chuviridae、Picornavirales、Flaviviridae、Hepelivirales、Solemoviridae、Tombusviridae) 的363個RNA病毒,其中的315個與已知的RNA病毒相似度較低,被認為是全新的RNA病毒,其中牡蠣來源病毒4個。牡蠣等海洋無脊椎動物體內(nèi)可能存在著非常豐富的病毒種類。但前述研究多基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)的新病毒大部分為RNA病毒,對DNA病毒的相關(guān)報道則十分有限。

    圓環(huán)病毒科病毒是已知基因組最小的一類動物致病性DNA病毒,呈二十面體對稱球形,無囊膜,直徑為17~22 nm,基因組由大約1.7~2.3 kb的單鏈環(huán)狀DNA組成。該家族成員種類繁多,可感染各類動物宿主,包括蝙蝠、嚙齒動物、畜禽動物和人類等,其中了解比較清楚的是感染畜禽動物和人類的種類,如雞傳染性貧血病毒 (Chicken Infectious anemia)、豬圓環(huán)病毒 (Porcine circovirus)、鴿圓環(huán)病毒 (Pigeon circovirus)等[30-31]。截止到本研究前,在牡蠣中尚未有圓環(huán)病毒的報道。經(jīng)查詢Virus-Host數(shù)據(jù)庫確認 (數(shù)據(jù)截止至2021年5月),目前已知的所有圓環(huán)病毒宿主都是動物界內(nèi)的兩側(cè)對稱動物,加之基因組和蛋白序列進化樹表明,它們與夏唇角水蚤圓環(huán)病毒最為接近,同屬無脊椎動物宿主范疇。這意味著這些圓環(huán)病毒不可能是牡蠣體內(nèi)的某些共生細菌或原生動物的病毒。另一方面,圓環(huán)病毒的宿主特異性是由其衣殼蛋白序列決定的[32]。而本研究發(fā)現(xiàn)5條病毒基因組序列中,僅在ZHd1-k141_220676序列中比對到了疑似衣殼蛋白序列,且與水蚤圓環(huán)病毒衣殼蛋白無相似性。因此,這5個新型圓環(huán)病毒的宿主是水蚤等節(jié)肢動物的可能性不高。當然,現(xiàn)有證據(jù)尚不足以確認牡蠣是其真正宿主,還需要結(jié)合水體浮游蚤類篩查、擴大養(yǎng)殖牡蠣調(diào)查范圍及牡蠣人工感染實驗來進一步明確其真正的宿主。

    根據(jù)ICTV標準,同一圓環(huán)病毒科物種的成員在其整個基因組中應(yīng)該具有大于80%的核苷酸同一性[33]。本研究中的5條候選序列與已知圓環(huán)病毒在整個基因組水平的相似性低于80%,在衣殼蛋白方面未觀察到明顯的相似性。因此,本研究鑒定的5個病毒可能與現(xiàn)有圓環(huán)病毒科家族成員有較大差異,具體的分類界定還有待發(fā)現(xiàn)更多家族成員序列后的分析。

    病毒是海洋中最豐富的生命體,以貝類為代表的軟體動物門也是海洋中最大的動物類群。但目前對于兩者的交叉領(lǐng)域——貝類病毒的了解仍十分有限。宏病毒測序方法已經(jīng)在眾多生物和環(huán)境樣品中得到廣泛應(yīng)用,突顯了高通量測序技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新病毒方面的巨大潛力[12]。然而,病毒組在未知序列解析和新病毒分類方面還有很多不足尚待解決。本研究發(fā)現(xiàn)的5個牡蠣圓環(huán)病毒的分類地位、家族成員以及宿主范圍、致病性、流行情況等方面還有很多工作要做。后續(xù)研究應(yīng)該在發(fā)揮病毒組技術(shù)優(yōu)勢的基礎(chǔ)上,同時配合以經(jīng)典的病毒學研究方法,獲得更為全面和深入的數(shù)據(jù),進而為提升為牡蠣等貝類病害的防控水平、支撐相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展發(fā)揮作用。

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