南海近岸硬骨魚鰓組織的細(xì)菌群落及多樣性分析

郭迎香，楊李玲，許友偉，方藝菲,3，王 萌，姜敬哲

1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，上海 201318

4. 廣州市從化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣東 廣州 510925

南海又稱南中國?；蛑袊虾＃鞘澜绲谌筮吘壓1]，擁有豐富的海洋生物資源。同時，南海也是海上“絲綢之路”的起點(diǎn)和國家海洋強(qiáng)國戰(zhàn)略的“主戰(zhàn)場”，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和政治意義。但20世紀(jì)80年代以來，南海漁業(yè)資源受海洋污染和過度捕撈的雙重影響而不斷衰退[2]。因此自1999年起，我國政府開始對南海區(qū)域漁船數(shù)量等進(jìn)行管控，調(diào)整漁業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)，以降低南海漁業(yè)資源的開發(fā)強(qiáng)度[3]，保護(hù)海洋漁業(yè)資源。

魚類是海洋中最主要的動物類群，現(xiàn)存種類主要包括硬骨魚綱、軟骨魚綱、盲鰻綱和頭甲綱4個綱[4]。張俊等[5]發(fā)現(xiàn)南海中南部中層魚中硬骨魚綱的種類最多，是南海海洋生態(tài)系統(tǒng)的主要物種。鰓是魚類等海洋生物的主要呼吸器官，除了具有呼吸作用，還具有濾食、滲透壓調(diào)節(jié)、pH平衡調(diào)節(jié)和氨排泄等功能[6]。同時，鰓也是海洋環(huán)境微生物進(jìn)入宿主體內(nèi)的第一道關(guān)卡，對宿主內(nèi)生的微生物群落具有重要調(diào)控作用。海洋魚類鰓組織中的微生物類群是一個重要的免疫屏障，也是魚類抵御海洋環(huán)境中潛在病原體的第一道防線。研究發(fā)現(xiàn)，魚類鰓組織中的細(xì)菌與宿主的疾病具有重要的相關(guān)性，Toenshoff等[7]通過對大西洋鮭 (Salmon salar) 鰓組織菌群研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的β-proteobacterial會引起宿主魚體上皮囊炎等疾病。因此，對鰓組織上附著的微生物群落進(jìn)行研究，對更好地理解海洋動物在海洋環(huán)境中的適應(yīng)性作用、以及病原入侵與魚類病害的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。近年來，海洋魚類微生物研究大多關(guān)注在各種魚類的腸道組織，如日本花鱸 (Lateolabrax japonicus)[8]、大西洋鱈(Gadus morhua)[9]、大西洋鮭[10]、大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[11]和大黃魚 (Larimichthys crocea)[12]等經(jīng)濟(jì)性物種，而圍繞鰓組織微生物多樣性及其功能的研究匱乏。王小彤和許強(qiáng)華[13]報(bào)道了4種南極魚類鰓組織微生物群落多樣性，Pratte等[14]對珊瑚礁不同魚類鰓組織微生物群落多樣性進(jìn)行了報(bào)道。但相較于種類繁多的海洋魚類資源，鰓組織微生物的研究數(shù)據(jù)還十分匱乏。

16S rDNA (或 16S rRNA) 基因作為細(xì)菌的保守特征序列是進(jìn)行細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的標(biāo)簽基因[15]。隨著高通量測序成本的降低和擴(kuò)增子 (Amplicon) 技術(shù)的日臻完善，16S rDNA擴(kuò)增子已逐漸成為微生物多樣性研究的主流方法[16]。本研究基于16S擴(kuò)增子技術(shù)，對從南海近岸海域7個站點(diǎn)采集的45種海洋硬骨魚綱生物的鰓組織樣品進(jìn)行了細(xì)菌群落分析，以期為了解影響海洋動物鰓組織微生物群落的主要因素、探索海洋動物與海洋環(huán)境微生物的相互依存關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與分組

2019年3月，在7個站點(diǎn)共采集了52份魚類鰓組織樣品 (分類見表1)，分屬于11目33科40屬的45種硬骨魚綱魚類。7個站點(diǎn)的位置見圖1，其中D3、D8、F3、F8、H3、H8和I9站點(diǎn)距離海岸的距離分別為60、215、10、175、20、130和165 km。采集到的鮮活樣品迅速裝于無菌密封袋中，于?80 ℃暫存。上岸后用無菌解剖工具完整取下鰓組織并于液氮中速凍后，置于?80 ℃長期保存。本實(shí)驗(yàn)將同一站點(diǎn)采集的同種魚類的鰓組織，根據(jù)魚體大小，進(jìn)行1～3尾的混合而作為一個樣品，以保證文庫構(gòu)建和測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

表1 樣品分類信息Table 1 Taxonomy information of samples

圖1 廣東近岸南海海域采樣站點(diǎn)示意圖Fig. 1 Diagram of sampling stations in Guangdong coastal waters in South China Sea

分別按照采樣站位、宿主來源可將52個樣品進(jìn)行兩種分組編排。依站點(diǎn)不同可分為7組，依宿主目水平可分為3組，其中鱸形目樣品最多 (19個)，鲉形目16個，其他小目統(tǒng)一編為一組 (17個)。

1.2 細(xì)菌 DNA 提取、文庫構(gòu)建和測序

使用 HiPure Bacterial DNA kit (Magen，廣州)試劑盒，參照說明書進(jìn)行總DNA提取，利用Thermo NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific Inc., 上海) 檢測DNA的純度和濃度。針對16S rDNA基因的V4區(qū)進(jìn)行巢套式擴(kuò)增，使用帶barcode 的特異引物及 TaKaRaPremix Taq? Version 2.0(TaKaRa Biotechnology Co., 大連) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。所用一輪引物為27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3') 和 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTAY GACTT-3')，二輪引物為 515F (5'-GTGCCA GCMGCCGCGGTAA-3') 和 806R (5'-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3')，擴(kuò)增區(qū)域長度為 310 bp。一輪 PCR 反應(yīng)體系為 (20 μL)：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)/Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L?1) 各 0.4 μL，模板 DNA (40～60 ng) 各1 μL，Nuclease-free water 8 μL。二輪 PCR 反應(yīng)體系(50 μL) 為：Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)/Mix 25 μL，上下游引物 (10 μmol·L?1) 各 1 μL，模板 DNA (40～60 ng) 1 μL，Nuclease-free water 22 μL。PCR 反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 8 min。DNA 提取、文庫構(gòu)建及測序工作委托廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行。

1.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

采用 Illumina Nova 6000平臺對構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行PE250測序 (廣東美格基因科技有限公司,廣州)，測序完成后得到原始的下機(jī)數(shù)據(jù)：雙端原始序列 (Paired-end Raw Reads)，利用 fastp[17](An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor, V 0.14.1，https://github.com/OpenGene/fastp) 分別對兩端的原始序列進(jìn)行滑窗 (sliding window) 質(zhì)量剪裁，同時根據(jù)序列首尾兩端的引物信息利用cutadapt軟件(https://github.com/marcelm/cutadapt/) 去除引物，得到質(zhì)控和過濾后高質(zhì)量的雙端優(yōu)化序列 (Clean Reads)。對于雙端優(yōu)化序列，根據(jù)reads之間的overlap關(guān)系，利用 usearch-fastq_mergepairs (V10,http://www.drive5.com/usearch/預(yù)設(shè)參數(shù)包含最小overlap長度設(shè)置為16 bp，拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配5 bp等) 過濾不符合的Tags，獲得原始的拼接序列 (Raw Tags)，利用fastp對拼接序列數(shù)據(jù)進(jìn)行滑窗質(zhì)量剪裁，得到優(yōu)化的拼接序列(Clean Tags)。利用UPARSE[18]方法進(jìn)行 OTU 聚類。利用usearch-sintax將每個OTU的代表序列與 SILVA (16S)、RDP (16S)、Greengenes (16S) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得物種注釋信息，以達(dá)到了解所有序列物種來源的目的，最終用SILVA (16S) 數(shù)據(jù)庫注釋得到的OTU結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 細(xì)菌群落多樣性

使用過濾后獲得的最終OTU豐度表進(jìn)一步進(jìn)行物種群落組成分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析。Alpha多樣性使用物種豐富度或均勻度來表征，其中 Chao1[19]、 ACE 和 Observed species指數(shù)用于估算群落物種豐富度[20]。而Shannon[21]和Simpson指數(shù)用于反映群落物種多樣性。Beta多樣性通過非度量多維尺度分析 (Nonmetric Multidimensional Scaling, NMDS) 來表征，NMDS 可以基于進(jìn)化關(guān)系或數(shù)量距離矩陣對比樣本之間的差異。

1.5 細(xì)菌群落功能預(yù)測

使用PICRUSt軟件[22]預(yù)測OTU的功能，首先消除16S marker gene在物種基因組中的拷貝數(shù)的影響，然后通過每個OTU所對應(yīng)的greengene id，分別比對到京都基因和基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 數(shù)據(jù)庫和 COG (Clusters of Orthologous Groups) 數(shù)據(jù)庫，獲得功能預(yù)測信息，根據(jù)OTU豐度計(jì)算各功能類別的豐度，分別得到各樣本在不同分類水平的功能豐度表。

使用在線微生物組分析平臺MicrobiomeAnalyst (https://www.microbiomeanalyst.ca) 進(jìn)行微生物數(shù)據(jù)的多樣性和功能分析[23]。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)概述

對52份16S rDNA文庫進(jìn)行測序，共獲得有效拼接序列 2 952 366 條，平均每個文庫 56 776 條；共產(chǎn)生10 617個OTU。圖2表明各樣本稀釋曲線隨著測序深度的增加逐漸趨于平緩，所有樣品均達(dá)到平臺期，表明本研究的測序深度足夠。由稀釋曲線的位置可知，I9站點(diǎn)樣品的OTU數(shù)量相對較高，D8站點(diǎn)樣品較低。

圖2 各個樣本的稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curve of each sample

2.2 魚鰓細(xì)菌群落組成

2.2.1 門水平組成

對不同站點(diǎn)樣品的細(xì)菌門水平分類組成和相對豐度情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì) (圖3)。在總體水平上，平均相對豐度≥1%的優(yōu)勢菌門依次為變形菌門 (Proteobacteria, 71.3%)、厚壁菌門 (Firmicutes, 10.3%)、浮霉菌門 (Planctomycetes, 8.3%)、放線菌門 (Actinobacteria, 3.4%)、擬桿菌門 (Bacteroidetes, 2.1%) 和藍(lán)細(xì)菌 (Cyanobacteria, 1%)。不同站點(diǎn)的優(yōu)勢菌門豐度不同，但變形菌門均為所有站點(diǎn)中豐度最高的優(yōu)勢類群，其中以F3和F8站點(diǎn)最高，D3站點(diǎn)最低。厚壁菌門主要分布于D3、D8、I9站點(diǎn)，而浮霉菌門主要分布于D3、H8、I9站點(diǎn)，其他門在不同站點(diǎn)間豐度比例略有差異。另外，F(xiàn)3和F8站點(diǎn)的細(xì)菌種類較少，而H8和I9站點(diǎn)的細(xì)菌種類相對較多。

圖3 魚鰓細(xì)菌門水平物種組成相對豐度Fig. 3 Relative abundance of taxonomy composition of bacteria in fish gill at phylum level

2.2.2 屬水平組成

進(jìn)一步在屬水平上對各站點(diǎn)樣品的分類組成和相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在所有站點(diǎn)中，相對豐度≥2%的優(yōu)勢菌屬依次為不動桿菌屬 (Acinetobacter, 17.2%)、青枯菌屬 (Ralstonia, 7.5%)、嗜冷桿菌屬 (Psychrobacter, 7.5%)、鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas, 3.5%)、BD1_7_clade(3.3%) 和Clostridium_sensu_stricto_1 (3%，圖4)。不同菌屬在不同站點(diǎn)的豐度占比不同，但不動桿菌屬在所有站點(diǎn)中均為優(yōu)勢菌屬。青枯菌屬 (26.5%) 和鞘氨醇單胞菌屬 (20.5%) 主要分布于 F3站點(diǎn)，BD1_7_clade在F8站點(diǎn)占比最高 (20.3%)，而嗜冷桿菌屬在H3(20.7%) 和 I9 站點(diǎn) (17.9%) 豐度較高?？傮w來看，D8、H8、I9站點(diǎn)的細(xì)菌在屬水平上的種類相對其他幾個站點(diǎn)較多，各個站點(diǎn)優(yōu)勢菌屬的相對豐度相差較大。

圖4 魚鰓細(xì)菌屬水平物種組成相對豐度Fig. 4 Relative abundance of taxonomy composition of bacteria in fish gill at genus level

2.3 Alpha 多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)可用于反映樣品內(nèi)部微生物群落的相對豐度及多樣性。本研究計(jì)算了各站點(diǎn)分組樣品的Alpha多樣性指數(shù) (圖5)。結(jié)果表明，H3、H8和I9站點(diǎn)的物種豐富度，包括Chao1 (圖5-a)、ACE (圖5-b) 和 Observed species指數(shù) (圖5-c) 均極顯著高于D3、D8、F3和F8站點(diǎn) (P<0.01)，尤以H8和I9最高。各站點(diǎn)的群落多樣性，包括Simpson(圖5-d) 和 Shannon 指數(shù) (圖5-e)，也表現(xiàn)出了顯著差異 (P<0.05)，其中D3站點(diǎn)最高，F(xiàn)3站點(diǎn)最低。然而，基于宿主目水平的分組結(jié)果顯示，不同物種分組間的Alpha指數(shù)均無顯著差異 (P>0.05，圖5-f，以Chao1指數(shù)為例)。上述結(jié)果表明，不同站點(diǎn)細(xì)菌群落多樣性和豐富度指數(shù)均存在顯著差異，而基于宿主目水平的分組之間未表現(xiàn)出顯著差異。

圖5 Alpha多樣性指數(shù)箱線圖注：a—e. 基于站點(diǎn)分組的Chao1、ACE、Observed、Simpson、Shannon 多樣性指數(shù)箱線圖，不同顏色代表不同站點(diǎn)的樣本；f. 基于樣本宿主(目水平) 分類分組的Chao1 指數(shù)箱線圖。Fig. 5 Boxplot of Alpha diversity indexNote:a—e. Boxplot of diversity indexes of Chao1, ACE, Observed, Simpson and Shannon based on site grouping, and different colors represent samples of different sites; f. Boxplot of Chao1 index based on sample host (Order level) classification.

2.4 Beta 多樣性分析

Beta多樣性可用于描述不同樣本微生物群落之間物種組成的差異。我們基于不同分組對各個樣本進(jìn)行NMDS分析 (圖6)。按照站點(diǎn)分組結(jié)果顯示，各個站點(diǎn)樣本的Beta多樣性具有極顯著差異(P<0.001)，且不同站點(diǎn)樣本分別聚集在一起 (圖6-a)?？傮w來看，與α多樣性結(jié)果一致，即H3、H8、I9站點(diǎn)與D3、D8、F3、F8站點(diǎn)明顯分為兩個主要類群。其中D3和F3、D8 和F8 站點(diǎn)的樣本距離更近，H3、H8和I9站點(diǎn)的10個樣本聚集在一起，I9站點(diǎn)一部分樣本單獨(dú)分群(圖6-a：I9-2)。然而，基于樣本目水平的分組未發(fā)現(xiàn)明顯分群，不同的目分組間不存在顯著差異 (P>0.05，圖6-b)。由此可見，地理站位對硬骨魚鰓組織內(nèi)微生物可能具有重要影響，而樣本宿主遺傳因素可能不是影響魚鰓細(xì)菌群落分布的主要因素。

圖6 基于不同分組方式的NMDS分析 [非參數(shù)多元方差分析 (PerMANOVA)]注：a. 基于站點(diǎn)分組的 NMDS 分析； b. 基于樣本的目水平分組。圖中兩個樣本點(diǎn)越接近，表示兩個樣本物種組成越相似。橫縱坐標(biāo)表示樣本間的相對距離，無實(shí)際意義。圖形中的每一個點(diǎn)代表一個樣本，不同顏色代表不同的樣本分組信息。NMDS 結(jié)果的優(yōu)劣用脅迫系數(shù)(stress) 來衡量，此值越小越好，當(dāng)小于 0.2 時表示可以用 NMDS 的二維點(diǎn)圖表示組間或組內(nèi)差異。Fig. 6 NMDS analysis based on different grouping modes [Nonparametric multivariate analysis of variance (PerMANOVA)]Note:a. NMDS analysis based on site grouping; b. Grouping based on the order level of the sample. The closer the two sample points are,the more similar the composition of the two sample species are. The abscissa and ordinate indicate the relative distance between samples, which is of no practical significance. Each point in the graph represents a sample, and different colors represent different sample grouping information. The advantages and disadvantages of testing NMDS results are measured by stress coefficients, the smaller, the better, and the value less than 0.2 indicates that the twodimensional dot plot of NMDS can be used to represent differences between or within groups.

2.5 微生物群落功能預(yù)測

基于KEGG比對共獲得8個一級層級和41個二級層級功能分類。各樣本在一級功能層級組成上的差異不明顯 (數(shù)據(jù)未展示)，占比最高的均為基因與新陳代謝相關(guān)功能 (Metabolism, 50%)，其次是遺傳信息處理 (Genetic information processing, 16%)、環(huán)境信息處理 (Environmental information processing, 13%)。圖7為KEGG數(shù)據(jù)庫比對到的22個相對豐度較高 (>1%) 的二級功能層級熱圖?？傮w來看，二級功能層級中膜轉(zhuǎn)運(yùn) (Membrane transport)功能豐度最高 (11.02%)，其次為氨基酸代謝(Amino acid metabolism, 10.5%)。但不同功能在不同樣本中豐度差異明顯，膜轉(zhuǎn)運(yùn) (14%)、碳水化合物代謝 (Carbohydrate metabolism, 10%)、氨基酸代謝 (9%)、復(fù)制和修復(fù) (Replication and repair, 9%)在I9.11S中豐度最高，在D8.6S中次之。樣本聚類顯示魚鰓中細(xì)菌功能基因分布及豐度與站點(diǎn)沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。另外，基于COG數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果與KEGG的一級功能結(jié)果類似 (數(shù)據(jù)未展示)，各樣本中的功能基因比例總體差別不大。

圖7 22個KEGG-L2功能層級相對豐度熱圖注：橫坐標(biāo)代表不同的樣本，縱坐標(biāo)代表不同的功能層級，圖片上方色條表示不同分組，并按照樣本聚類。Fig. 7 Heatmap of relative abundance of 22 KEGG-L2 functional levelsNote:The abscissa represents different samples; the ordinate represents different functional levels; the color bars indicate different groups, which are clustered according to samples.

兩種功能數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果均表明，魚鰓細(xì)菌群落可能主要參與了宿主營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等相關(guān)進(jìn)程。

3 討論

3.1 海洋魚類鰓組織菌群群落組成

本研究發(fā)現(xiàn)，硬骨魚鰓組織細(xì)菌群落中的優(yōu)勢菌門包括變形菌門、厚壁菌門、浮霉菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌，這與其他學(xué)者對海洋環(huán)境菌群統(tǒng)計(jì)分析所得結(jié)果一致，如穆大帥等[24]對我國分離鑒定的577種海洋細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在門分類水平上分布最多的是變形菌門，其次是擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門。白潔等[25]采用高通量測序方法分析了南海南部海域浮游細(xì)菌豐度，發(fā)現(xiàn)南海南部海域浮游細(xì)菌的優(yōu)勢類群為變形菌門、藍(lán)藻門和擬桿菌門，優(yōu)勢亞群為γ-變形菌綱、α-變形菌綱、藍(lán)藻菌綱和黃桿菌綱。徐新亞等[26]報(bào)道廣西北部灣分離鑒定到1 843種海洋細(xì)菌，分別隸屬于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、浮霉菌門和變形菌門。本研究結(jié)果表明海洋環(huán)境與魚類鰓中的微生物群落至少在門水平上具有較高的一致性。變形菌門作為海洋中主要的微生物類群之一，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)、氮循環(huán)等多種物質(zhì)循環(huán)過程中均發(fā)揮重要作用[27]，有研究證實(shí)海洋表面的變形菌門含有豐富的固氮種群[28]。厚壁菌門最主要的功能是降解纖維類物質(zhì)，擬桿菌門主要降解非纖維物質(zhì)[29-30]，而上述3類細(xì)菌在魚鰓組織上的富集可能與宿主在海洋環(huán)境中的代謝需求有關(guān)。此外，Legrand等[31]認(rèn)為，黃尾鰤 (Seriolalalandi) 鰓中豐度較高的浮霉菌門可能在海洋魚類體內(nèi)固氮作用中發(fā)揮功能，有助于促進(jìn)氮元素在海洋環(huán)境與海洋生物之間的垂直傳播。由于本研究是通過16S的物種組成反推預(yù)測群落功能，并未直接對宏基因組和功能基因進(jìn)行測序。因此，功能分析結(jié)果會與真實(shí)情況有一定差距。未來研究還需進(jìn)一步結(jié)合宏基因組測序及海洋環(huán)境有機(jī)物質(zhì)的測定，才能更好地解讀鰓組織微生物在魚體環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮的功能。

3.2 海洋魚類鰓組織菌群的潛在生態(tài)功能

近年來，國內(nèi)外學(xué)者在海洋細(xì)菌多樣性研究領(lǐng)域貢獻(xiàn)了大量成果，但多數(shù)只關(guān)注水體中游離的細(xì)菌，對于宿主，尤其是鰓組織上，共附生細(xì)菌群落潛在功能的研究相對較少。本研究預(yù)測到魚類鰓中細(xì)菌多參與宿主的新陳代謝過程，積極參與氨基酸代謝反應(yīng)和碳水化合物代謝反應(yīng)，表明魚鰓中細(xì)菌可能在碳循環(huán)中發(fā)揮作用。Kessel等[32]研究了鯉(Cyprinus carpio) 和斑馬魚 (Danio rerio) 鰓中微生物在氮循環(huán)中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鰓中含有一個活躍的N-循環(huán)細(xì)菌群，屬于β-變形桿菌綱成員，可能對許多魚類降低氨濃度、防止高濃度氨中毒有益。本研究發(fā)現(xiàn)所有樣本中均包含豐度不一的β-變形菌綱成員，提示海水魚類鰓組織中可能也具有類似功能的菌群。Pratte等[14]對于法國Moorea珊瑚礁采集的魚鰓和腸道等樣本的微生物群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)成魚和幼魚鰓中的微生物群落組成與腸道有顯著差異。鰓中最豐富的細(xì)菌是希瓦氏菌屬和Endozoicimonaceae成員，且微生物群落與環(huán)境樣品共享的OTU百分比高達(dá)75%，表明鰓微生物組可能受到周圍浮游微生物群落變化的影響。本研究中D8 站點(diǎn)的網(wǎng)紋裸胸鱔 (Gymnothorax reticularis)、黑鮟鱇 (Lophiomus setigerus)、環(huán)紋蓑鰣 (Pterois lunulata) 和深水金線魚 (Nemipterus bathybius) 中的希瓦氏菌屬細(xì)菌占比同樣較高，與該結(jié)果吻合。然而，其他多數(shù)樣品中則是變形菌門的不動桿菌屬細(xì)菌比例較高，是所有站點(diǎn)的優(yōu)勢菌屬。該結(jié)果說明不同站點(diǎn)或不同宿主物種的微生物組成可能差異很大。有研究報(bào)道，不動桿菌屬細(xì)菌作為非發(fā)酵革蘭陰性菌，具有代謝多樣性，可有效降解海水中己內(nèi)酰胺、石油油烴等海洋污染成分[33]。不動桿菌屬在海水魚鰓部的富集或可有效促進(jìn)環(huán)境污染物等的代謝，從而對宿主產(chǎn)生潛在的保護(hù)作用。除了D3站點(diǎn)，其他6個站點(diǎn)的優(yōu)勢菌屬還包括嗜冷桿菌屬。該屬細(xì)菌多分布于潮濕、含鹽或寒冷的生境中，且能分泌適應(yīng)低溫的酶，可在海洋低溫下發(fā)揮其生物活性[34]，且具有較高的催化效率。然而，本研究發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于魚鰓組織中的嗜冷桿菌是否也具有類似功能值得深入研究。

3.3 地理位置對魚鰓細(xì)菌群落的影響

本研究發(fā)現(xiàn)站點(diǎn)對魚鰓細(xì)菌群落的影響遠(yuǎn)高于宿主物種遺傳因素的影響。近年來，其他研究者也發(fā)現(xiàn)地理位置對海洋環(huán)境中的微生物群落產(chǎn)生影響。翟萬營等[35]發(fā)現(xiàn)地理位置對南極中山站附近海水微生物群落組成有重要影響；Zhang等[36]認(rèn)為除理化性質(zhì)外，地理位置對南極中山站、長城站周邊土壤樣品和近海沉積物中的細(xì)菌群落組成產(chǎn)生一定影響。與土壤等環(huán)境樣本不同，生物體內(nèi)的微生物群落除受到環(huán)境影響外，還會受到飲食、遺傳、發(fā)育階段、健康等因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)海洋魚類鰓中的菌群也受到地理位置的影響，可能由不同站點(diǎn)的水質(zhì)環(huán)境、浮游微生物和營養(yǎng)物質(zhì)與鰓的直接接觸造成。海洋動物鰓組織與腸道等內(nèi)生組織不同，鰓暴露于水體環(huán)境中，沒有額外的免疫屏障，可能導(dǎo)致魚鰓細(xì)菌群落受到環(huán)境的影響尤為顯著。鑒于海洋魚類具有自主、靈活的游泳能力，由此推測，其在海洋微生物傳播和海洋微生物群落調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮著重要作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)I9站點(diǎn)的20個樣本明顯分為兩個群，這可能有兩個原因：1) 兩個群落在宿主物種水平上存在差異，第一個群落包括大鱗鱗頭鲉 (Sebastapistes megalepis)、黃紋擬鱸 (Parapercis xanthozona)、壽魚 (Banjos banjos) 和棕斑寬吻鲀(Amblyrhynchotes rufopunctatus) 等物種；第二個群落包括冠鰈 (Samaris cristatus)、叉斑狗母魚 (Synodus macrops)、美尾? (Calliurichthys japonicus)、虻鲉 (Erisphex pottii) 和紅鲬 (Bembras japonicus) 等物種。通過調(diào)查采樣記錄發(fā)現(xiàn)，第一個類群部分物種魚類營養(yǎng)級高于第二個類群，而第二個類群的樣本魚體較小，由此推測，營養(yǎng)級和個體大小 (發(fā)育階段) 或許是造成該批次群落差異的一個原因。2) 擴(kuò)增、建庫、測序等試驗(yàn)環(huán)節(jié)批次的不同也有可能會對上述群落差異造成一定影響，具體原因還需要更多試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，南海具有豐富的海洋微生物資源，本研究發(fā)現(xiàn)南海近岸硬骨魚鰓組織中細(xì)菌群落的組成非常豐富。采樣站點(diǎn)相比宿主來源對鰓組織上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性具有更主要的影響，它們可能在輔助宿主營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝方面發(fā)揮積極作用。然而本研究也存在很多不足如：樣本和站點(diǎn)數(shù)量較少，未對海水樣品進(jìn)行對照研究等。未來還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣品的種類、數(shù)量，并結(jié)合水質(zhì)環(huán)境、理化因子和宿主的生理生長指標(biāo)及生活方式等多維度指標(biāo)，同時探討海洋動物鰓、腸道等多個器官中海洋微生物的分布、富集和傳播模式，為研究海洋動物宿主微生物與環(huán)境浮游微生物群落之間的互作關(guān)系及生態(tài)影響提供更深入、全面的數(shù)據(jù)支持。