腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規(guī)范專家共識（第二版）

喻 華， 徐雪松， 李 敏， 楊啟文， 楊 青， 張 嶸， 褚云卓， 單 斌，郭大文， 胡志東0， 簡 翠， 李 軼， 廖 康， 劉根焰， 季 萍， 金 炎，倪語星， 沈 瀚， 蘇丹虹， 卓 超， 王 輝0， 魏蓮花， 俞云松， 張 泓，張利俠， 周鐵麗， 朱 鐳， 王明貴， 朱德妹， 胡付品

當前，細菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，其中尤以碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE）引起的感染形勢最為嚴峻。碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛使用，CRE菌株的檢出率呈逐年快速上升趨勢。CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)歷年監(jiān)測結(jié)果顯示[1-2]，我國臨床分離肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率從2005年的3%快速攀升至2021年的23%以上，上升幅度高達8倍。2021年全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CARSS）數(shù)據(jù)顯示，全國1 429所醫(yī)院臨床分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的平均耐藥率為11.3%，部分省市甚至超過20%[3]。由于CRE菌株通常還攜帶對其他抗菌藥物耐藥的基因，對抗菌藥物呈廣泛耐藥甚至全耐藥，使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境[4]。為規(guī)范當前實驗室檢測碳青霉烯酶的方法和臨床報告，上海市微生物學(xué)會微生物耐藥防控專委會、CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)和上海市細菌真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)組織專家對上述問題進行了討論，撰寫了專家共識并對實驗室檢測碳青霉烯酶的方法進行了推薦，以期為各級醫(yī)療機構(gòu)或科研院所開展碳青霉烯酶的檢測提供指導(dǎo)。

與第一版相比，第二版更新主要要點如下：①細化了一些檢測方法，包括改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）和EDTA改良碳青霉烯滅活試驗（eCIM）以及碳青霉烯酶抑制劑增強試驗；②新增不常見檢測結(jié)果解決方案，因新出現(xiàn)的一些碳青霉烯酶基因亞型如KPC新亞型可能導(dǎo)致常規(guī)檢測方法出現(xiàn)假陰性結(jié)果；③新增不同方法推薦級別定義的描述；④更新碳青霉烯酶的實驗室檢測及結(jié)果報告和解釋流程圖；⑤新增碳青霉烯酶表型和基因型檢測報告參考圖示；⑥新增酶免疫層析技術(shù)快速檢測碳青霉烯酶方法介紹及結(jié)果圖示；⑦新增宏基因組二代測序（metagenomics next generation sequencing, mNGS）技術(shù)檢測碳青霉烯酶基因的介紹；⑧刪除OXA-48型碳青霉烯酶表型檢測方法和圖示；⑨更新部分參考文獻。

1 CRE的定義

美國疾病預(yù)防控制中心關(guān)于CRE的定義[5]為滿足以下任意一個條件：①對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗生素耐藥者。對于天然對亞胺培南敏感性降低的細菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗生素的藥敏結(jié)果。②產(chǎn)生碳青霉烯酶。

2 CRE的耐藥機制

產(chǎn)生碳青霉烯酶是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[6]。按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B、D三類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，以blaKPC（blaKPC-2～blaKPC-108）、blaSME（blaSME-1～blaSME-5）、blaIMI（blaIMI-1～blaIMI-23）、blaNMC和blaGES（blaGES-1～blaGES-51） 型為主；B類為金屬β內(nèi)酰胺酶，以blaNDM（blaNDM-1～blaNDM-41）、blaIMP（blaIMP-1～blaIMP-91）、blaVIM（blaVIM-1～blaVIM-79）、blaGIM（blaGIM-1～blaGIM-2） 和blaSPM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶，以blaOXA-181和blaOXA-232為主。除產(chǎn)生碳青霉烯酶外，少數(shù)菌株對碳青霉烯類藥物耐藥的機制是產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶和/或AmpC酶合并外膜孔蛋白表達下調(diào)或缺失。

3 碳青霉烯酶分布特征

不同國家、不同地區(qū)、不同醫(yī)院、不同人群以及不同細菌所產(chǎn)的碳青霉烯酶種類均有差異[7-9]。我國臨床分離的CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶以KPC和NDM型為主，少數(shù)菌株產(chǎn)生OXA-48、IMP和VIM型碳青霉烯酶[10-12]。KPC-2型酶為KPC型碳青霉烯酶最主要的亞型，NDM-1和NDM-5是NDM型金屬酶中最主要的亞型，而OXA-181和OXA-232型酶是OXA-48型碳青霉烯酶中最主要的亞型。CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)對2018年收集自全國39所醫(yī)院935株CRE菌株的研究結(jié)果顯示，產(chǎn)KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶菌株所占比例分別為51.6%（482/935）、35.7%（334/935）和7.3%（68/935），其中少數(shù)菌株同時產(chǎn)多種碳青霉烯酶。兒童和成人患者分離的碳青霉烯類耐藥菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶型別有所差異，兒童分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)生KPC、NDM和OXA-48型碳青霉烯酶，而成人分離株主要產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶；但兒童和成人患者分離的碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌均主要產(chǎn)生NDM型金屬β內(nèi)酰胺酶。現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，近2年來產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌在治療過程中快速發(fā)生突變而導(dǎo)致抗感染治療失敗，是當前全球公共衛(wèi)生亟需重點關(guān)注的新挑戰(zhàn)。美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）數(shù)據(jù)庫顯示，2020年至今國際上新發(fā)現(xiàn)的基于blaKPC-2或blaKPC-3突變而出現(xiàn)的KPC新亞型基因如blaKPC-33和blaKPC-51等的數(shù)量超過之前2017年所報道數(shù)量的總和（56種對42種）。

4 碳青霉烯酶檢測的臨床意義

由于不同種類的抗菌藥物對產(chǎn)生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同，準確、快速地對CRE產(chǎn)生的碳青霉烯酶進行檢測并分型，對于臨床抗感染治療的精準用藥和醫(yī)院感染預(yù)防控制具有重要的價值[13-15]。如頭孢他啶-阿維巴坦[16-17]，對產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶菌株無抗菌活性。目前處于臨床研究階段的美羅培南-韋博巴坦（meropenem-vaborbactam）[18-19]和亞胺培南 -瑞來巴坦（imipenem-relebactam）[20]，對產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶和D類OXA-48型碳青霉烯酶菌株無抗菌活性。此外，尚有多種新型碳青霉烯酶抑制劑正處于臨床研究階段，未來將會陸續(xù)上市用于臨床治療產(chǎn)碳青霉烯酶菌株所致感染的藥物，如 enmetazobactam[21]、taniborbactam[22-24]和齊達巴坦（zidebactam）[25-27]等。此外，實驗室亦可根據(jù)不同碳青霉烯酶的特征，如金屬β內(nèi)酰胺酶不能水解氨曲南，KPC型碳青霉烯酶的活性可被阿維巴坦、韋博巴坦或瑞來巴坦抑制，被克拉維酸弱抑制，通過開展聯(lián)合藥敏試驗制定精準的抗感染治療方案[28-29]。目前已上市及處于臨床研究階段的不同碳青霉烯酶抑制劑的抑酶活性見表1。

表1 不同酶抑制劑的抑酶活性

5 碳青霉烯酶的實驗室檢測

目前實驗室檢測碳青霉烯酶的方法分為表型檢測和基因型檢測。表型檢測方法包括Carba NP試驗[30-32]、mCIM 和 eCIM[30，33-34]、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗[35-40]和時間飛行質(zhì)譜技術(shù)等[41-45]；基因型檢測方法包括酶免疫層析技術(shù)[46-48]和分子檢測技術(shù)[49-50]。執(zhí)行上述碳青霉烯酶檢測方法時，均需按要求選擇相應(yīng)的陽性和陰性質(zhì)控菌株進行質(zhì)控，以確保檢測方法的可靠性。下文簡單介紹目前臨床微生物實驗室較為常用的碳青霉烯酶檢測方法的原理、結(jié)果判讀、檢測性能以及優(yōu)缺點等，以供不同層次的實驗室根據(jù)實際情況選擇合適的檢測方法。不同碳青霉烯酶實驗室檢測方法比較見表2。

推薦級別說明：表2中的方法學(xué)推薦級別基于實驗室操作便捷程度、檢測結(jié)果一致性、試劑價格以及是否有注冊證等因素綜合判定。

表2 不同碳青霉烯酶檢測方法原理、適用標本、檢測時間、結(jié)果報告及其優(yōu)缺點

5.1 Carba NP試驗

美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）于2015年推薦Carba NP試驗檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶[30]。Carba NP試驗具體操作步驟可參考最新版CLSI M100文件要求。該試驗原理為細菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶可以水解亞胺培南，導(dǎo)致溶液pH值改變而發(fā)生顏色變化。研究顯示[31-32]，Carba NP試驗檢測碳青霉烯

酶（包括產(chǎn)KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和/或SME型碳青霉烯酶菌株）的靈敏度和特異度均超過90%。Carba NP試驗具有操作簡單和快速的特點（4～6 h），適合所有臨床微生物實驗室開展。缺點是需特殊試劑（如七水硫酸鋅溶液和酚紅溶液），其中一些需自制（有效期短，如含亞胺培南的Carba NP B液）；一些分離株會出現(xiàn)無效結(jié)果；可能無法檢測某些類型碳青霉烯酶（如染色體介導(dǎo)OXA型碳青霉烯酶）。

5.2 改良碳青霉烯滅活試驗

CLSI推薦mCIM和eCIM用于腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的檢測[30]。mCIM和eCIM具體操作步驟可參考最新版CLSI M100文件要求。其原理是將美羅培南與受試菌菌懸液混合，若受試菌產(chǎn)生碳青霉烯酶，可破壞美羅培南的抗菌活性；否則美羅培南仍可保持其對大腸埃希菌ATCC 25922的抗菌活性。根據(jù)金屬β內(nèi)酰胺酶活性可被EDTA抑制的特點，mCIM和eCIM兩種方法聯(lián)合可區(qū)分細菌產(chǎn)生的絲氨酸碳青霉烯酶或金屬β內(nèi)酰胺酶。mCIM可用于檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，而mCIM聯(lián)合eCIM僅適用于腸桿菌目細菌以區(qū)分其產(chǎn)生的碳青霉烯酶類型（絲氨酸碳青霉烯酶或金屬β內(nèi)酰胺酶）。研究顯示[33-34]，mCIM檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均超過97%；mCIM檢測不動桿菌屬細菌實驗室間的特異性和重復(fù)性均較差，方法未獲得CLSI認可。eCIM區(qū)分腸桿菌目細菌中金屬β內(nèi)酰胺酶和絲氨酸型碳青霉烯酶的靈敏度＞95%、特異度＞92%。mCIM和eCIM具有操作簡單、無需特殊試劑和成本低的特點，適合所有臨床微生物實驗室開展。缺點是需過夜孵育，耗時長，需自配試劑（如0.5 mol/L EDTA溶液），且不能檢測同時產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶的菌株。

5.3 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗

根據(jù)A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸（3-aminophenylboronic acid hydrochloride, APB）抑制[35]，而金屬β內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特點[36-39]，APB聯(lián)合EDTA可對單產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶、單產(chǎn)B類金屬β內(nèi)酰胺酶以及同時產(chǎn)生A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶的腸桿菌目細菌進行檢測并區(qū)分[40]，具體實驗操作步驟見附件1。研究顯示，碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測單產(chǎn)KPC或金屬酶菌株的靈敏度均為100%，檢測同時產(chǎn)KPC和金屬酶菌株的靈敏度為96.8%，特異度為98.8%[40]。該方法具有操作簡單、結(jié)果容易閱讀以及可檢測單產(chǎn)或同時產(chǎn)不同類型碳青霉烯酶的特點，適合所有臨床微生物實驗室開展，但缺點是需特殊試劑（需自配或購買商品化的EDTA溶液和APB溶液）、耗時長以及不能檢測OXA-48型碳青霉烯酶。

5.4 質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）是近年來發(fā)展的簡便、快速、準確的病原微生物鑒定方法。質(zhì)譜技術(shù)通過比較不同細菌間質(zhì)譜峰強度差異，可快速對碳青霉烯類耐藥細菌進行檢測；或者基于碳青霉烯酶水解碳青霉烯類抗生素而使藥物的特異峰發(fā)生改變的特點進行檢測[41-45]。質(zhì)譜技術(shù)雖然可快速檢測碳青霉烯酶的種類，但缺點是目前僅對某種碳青霉烯酶有為數(shù)不多的研究且并無統(tǒng)一可行的方法，而酶水解法需要配制抗菌藥物溶液作為底物與待測菌進行共孵育（孵育時間約1～2.5 h），操作較繁瑣，不適于在臨床微生物實驗室常規(guī)開展，目前大多用于科學(xué)研究。

5.5 酶免疫層析技術(shù)

利用抗原抗體免疫層析技術(shù)快速檢測腸桿菌目細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，是近年發(fā)展起來的以細菌菌落為基礎(chǔ)的檢測方法中最快速的檢測技術(shù)[46-47]。該方法操作簡單（不同產(chǎn)品實驗操作步驟需參考產(chǎn)品說明書），加樣后測試條上相應(yīng)區(qū)域標記線條出現(xiàn)紅色（除外對照線條），提示該菌產(chǎn)生所對應(yīng)的碳青霉烯酶，具體實驗操作步驟可參考附件2。目前該測試條最多可同時快速檢測KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP等5種碳青霉烯酶基因。與測序方法相比，酶免疫層析技術(shù)檢測碳青霉烯酶基因的靈敏度和特異度均在90%以上[48]。酶免疫層析技術(shù)具有操作簡單、快速及結(jié)果容易判讀的優(yōu)點，但缺點是價格較高，各實驗室可根據(jù)自身條件有選擇性地開展碳青霉烯酶的檢測，如對從高?；颊撸庖咭种苹颊呋蚬撬枰浦不颊叩龋吮局蟹蛛x的CRE菌株進行碳青霉烯酶基因的快速檢測，以協(xié)助臨床盡早啟動有針對性的抗感染治療方案。

5.6 碳青霉烯酶分子檢測技術(shù)

5.6.1 碳青霉烯酶靶基因檢測技術(shù) 分子檢測技術(shù)可直接快速檢測臨床標本如直腸拭子中CRE菌株中的碳青霉烯酶基因。如GeneXpert[49-50]、Verigene[51]和Filmarray[52]等系統(tǒng)采用熒光定量PCR技術(shù)對主要的碳青霉烯酶基因包括KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48等進行檢測，檢測時間一般在1 h左右，檢測靈敏度和特異度可達96%以上。分子檢測技術(shù)具有快速（可直接從標本中檢測）和結(jié)果容易判讀的優(yōu)點，但缺點是價格昂貴，各實驗室可根據(jù)自身條件有選擇性地開展碳青霉烯酶的檢測。比如對于高?；颊撸庖咭种苹颊呋蚬撬枰浦不颊叩龋┓蛛xCRE菌株碳青霉烯酶基因的快速檢測，以協(xié)助臨床盡早啟動有針對性的抗感染治療方案。

5.6.2 mNGS技術(shù) mNGS技術(shù)因可對未知的病原體和耐藥基因進行檢測，是當前臨床應(yīng)對非培養(yǎng)、難培養(yǎng)和少見病原菌檢測的重要可選技術(shù)之一。近年來，mNGS亦開始進行樣本中病原菌耐藥基因的檢測，包括碳青霉烯酶基因。但在采用mNGS檢測樣本中病原菌的碳青霉烯酶時，應(yīng)明確為感染樣本以及需要明確耐藥基因與病原菌的對應(yīng)關(guān)系。雖然mNGS技術(shù)可覆蓋多種病原體和耐藥基因，尤其是未知基因，但由于其高靈敏度的特點，也帶來了結(jié)果解讀的難題，且價格仍比較昂貴。

6 不常見結(jié)果解決方案

目前我國臨床分離CRE菌株產(chǎn)生的KPC型碳青霉烯酶基因以blaKPC-2為主，但隨著新型碳青霉烯酶抑制劑復(fù)方制劑在臨床的廣泛應(yīng)用，CRE菌株為適應(yīng)強大的壓力環(huán)境變化，快速發(fā)生突變出現(xiàn)新的KPC基因亞型，導(dǎo)致治療失敗，其中以肺炎克雷伯菌為代表?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，自2020年以來國際上新報道的新KPC基因亞型呈爆發(fā)式增長。新的KPC基因亞型如blaKPC-33、blaKPC-51、blaKPC-76和blaKPC-79等的出現(xiàn)，可使實驗室常用碳青霉烯酶檢測方法包括mCIM、碳青霉烯酶抑制劑增強試驗和酶免疫層析技術(shù)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[53]，需要引起實驗室和臨床高度重視。當藥敏試驗確認為CRE但常見碳青霉烯酶檢測結(jié)果呈“陰性”時，為明確該菌株是否產(chǎn)生碳青霉烯酶，可采用GeneXpert Carba-R或基于PCR的DNA測序或mNGS技術(shù)進行驗證，以明確基因亞型。

7 碳青霉烯酶的實驗室檢測及結(jié)果報告和解釋流程圖

以臨床分離的細菌為樣本和以臨床標本為樣本的檢測流程見圖1。

7.1 報告模式

如以細菌為樣本進行檢測，建議與細菌鑒定及藥敏試驗結(jié)果同時報告。除按要求提供一般細菌鑒定和藥敏試驗報告規(guī)定的信息外，碳青霉烯酶檢測報告信息包括①檢測方法：表型或基因型檢測方法；②檢測結(jié)果報告及解釋：如采用mCIM和eCIM方法需同時報告“陽性”或“陰性”檢測結(jié)果并判斷該菌所產(chǎn)碳青霉烯酶種類；如采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗可直接報告最終檢測結(jié)果，或同時報告紙片抑菌圈直徑并判斷該菌所產(chǎn)碳青霉烯酶種類；如采用免疫層析或分子檢測技術(shù)，直接報告檢測到的碳青霉烯酶基因型；③碳青霉烯酶表型或基因型檢測結(jié)果解釋等，參考表3。

如以臨床標本或細菌（少數(shù)情況可能在藥敏試驗前即以菌株直接檢測以早期指導(dǎo)臨床抗感染治療）直接檢測碳青霉烯酶基因，可以單獨報告檢測結(jié)果，報告信息包括①患者姓名、年齡、性別、科室、標本類型；②臨床診斷；③檢測目的：評估治療效果、去定植或基于感染控制目的；④基因型檢測方法、結(jié)果解釋。參考表3。

表3 碳青霉烯酶檢測結(jié)果報告及解釋參考

碳青霉烯酶表型和基因型檢測報告格式參考圖3～6，包括采用表型（圖3、圖4）或基因型（圖5、圖6）檢測結(jié)果報告格式，以及是否進行替加環(huán)素、多黏菌素和頭孢他啶-阿維巴坦藥敏試驗時的不同報告格式（圖3～6）。

7.2 質(zhì)控要求

質(zhì)控頻率要求：每天或每次。注意：質(zhì)控菌株隨標本測試同步進行。

陽性質(zhì)控菌株選擇：按照不同檢測方法可檢測的碳青霉烯酶型別或靶基因種類，選擇相應(yīng)的陽性和陰性質(zhì)控菌株。陽性質(zhì)控菌株首選肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705（KPC型碳青霉烯酶陽性株）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2146（NDM型金屬β內(nèi)酰胺酶陽性株）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-2524（OXA-48型碳青霉烯酶陽性株）；陰性質(zhì)控菌株首選肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706（非產(chǎn)碳青霉烯酶株）。如實驗室無法獲得上述首選ATCC陽性或陰性質(zhì)控菌株，亦可選擇經(jīng)DNA測序明確產(chǎn)相應(yīng)碳青霉烯酶基因型的菌株作為陽性質(zhì)控菌，以及選擇大腸埃希菌ATCC 25922作為陰性質(zhì)控菌株。

附件1 表型檢測A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶

原理：A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被APB抑制，金屬β內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制。

方法：參考CLSI推薦的紙片擴散法。將待測菌調(diào)制成0.5麥氏濁度菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂平板上，隨后貼4張?zhí)记嗝瓜╊惪股丶埰ㄒ话銥閬啺放嗄匣蛎懒_培南）于瓊脂表面。一張紙片不加任何液體，一張紙片滴加APB溶液（終濃度300 μg/片，濃度為60 mg/mL的APB溶液可滴加5 μL）、一張紙片滴加EDTA溶液（終濃度292 μg/片，濃度0.2 mol/L的EDTA溶液可滴加5 μL）、最后一張同時滴加APB溶液（終濃度300 μg/片）和EDTA溶液（終濃度292 μg/片）。過夜孵育后量取紙片抑菌圈直徑。

結(jié)果判讀：①添加APB溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產(chǎn)A類碳青霉烯酶（圖7A）；②添加EDTA溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產(chǎn)生B類金屬酶（圖7B）；③如僅同時添加APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，可判斷該受試菌株同時產(chǎn)A類碳青霉烯酶和B類金屬酶（圖7C）；④如含酶抑制劑的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥相差均＜5 mm，可判斷該菌不產(chǎn)A類或B類金屬酶，其耐藥機制可能為產(chǎn)生OXA-48型碳青霉烯酶，或產(chǎn)生ESBL酶和/或AmpC酶合并膜孔蛋白的下調(diào)或缺失。

附件2 酶免疫層析技術(shù)快速檢測碳青霉烯酶（金標法）

原理：抗原抗體結(jié)合技術(shù)。

方法（不同產(chǎn)品操作步驟有所差異）：于試管中滴加5滴細菌裂解液，之后挑取一接種環(huán)（10 μg）新鮮純培養(yǎng)菌落于裂解液中（仔細研磨使細菌混懸于液體中），輕輕混勻后滴加100 μL裂解后的菌液于樣品孔中，等待15 min后閱讀結(jié)果。檢測步驟參考圖8所示。

結(jié)果判讀：根據(jù)檢測條上出現(xiàn)的紅色線條所在位置判斷該菌所產(chǎn)碳青霉烯酶種類。見圖9。