茶氨酸大腸桿菌的代謝工程研究初探

張程杰

(1.田邊三菱制藥研發(fā)(北京)有限公司上海分公司，上海 200030；2.上海國廣生物科技有限公司，上海 201801)

L-茶氨酸(L-theanine, L-The)是一種非常重要的非蛋白質氨基酸，是茶葉中特有的氨基酸，屬酰胺類化合物，分子式為C7H14N2O2，占其總游離氨基酸50%以上[1]。L-The使茶葉有鮮美的味道和獨特的特色，其在茶葉中的含量會直接影響茶的質量和價格。除了獨特的味道，L-The已被證明有許多有益的生理效果，尤其在促進人腦放松，提高注意力和促進學習能力方面有顯著的功效[2-3]。L-The已被FDA列為安全的食品藥品添加劑。根據(jù)數(shù)據(jù)表明，在2020年我國L-The產量高達700t左右，占據(jù)全球總產量的76%以上。隨著下游產業(yè)的發(fā)展，以及L-The應用技術的成熟，近幾年全球L-The市場需求持續(xù)攀升，行業(yè)得到快速發(fā)展，L-The的市場需求龐大，需要開發(fā)工業(yè)化生產L-The途徑和方法[4]。

目前，工業(yè)化生產 L-The的主要方法有植物分離提取法、植物組織細胞培養(yǎng)法、化學合成法和微生物法。分離提取法生產L-The成本高，規(guī)模受到限制，且分離過程中使用大量的化學試劑，易造成環(huán)境污染。植物組織細胞培養(yǎng)法運行成本高，無法大規(guī)模推廣應用?；瘜W合成法得到的是 L-構型和 D-構型的消旋體，需要進一步拆分得到 L-The，且反應副產物多[5]。微生物法催化合成 L-The具有原料價格低廉，催化效率高，立體專一性強等優(yōu)點，具有大規(guī)模工業(yè)生產的潛力[6]。但是目前報道的GMAS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-The的效率較低，導致L-The產量難以大幅度提高。L-The的化學結構見圖1。

圖1 L-The的化學結構

GMAS是一種能夠催化L-谷氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，該反應需要消耗ATP。同時GMAS也可以催化乙胺和L-谷氨酸合成L-The。1992年，Kimura等[7]從噬甲基菌株Methylophagasp.中純化出GMAS，該酶在pH 7.5和40℃條件下有最大活性，表現(xiàn)出較寬的底物特異性范圍，并能以乙胺和L-谷氨酸為底物催化合成L-The，但未進行深入研究。2019年，潘鑫茹等[8]報道共表達多聚磷酸鹽激酶(PPK)和GMAS的重組菌全細胞催化系統(tǒng)，建立ATP再生系統(tǒng)，強化 L-The的酶法合成。微生物發(fā)酵法具有培養(yǎng)條件簡單、周期短、操作簡便、綠色環(huán)保、原料及生產成本低廉等優(yōu)點，具有更加良好的工業(yè)應用價值。本研究建立了GMAS的三維結構，通過分子對接，開展GMAS的晶體結構半理性設計，建立GMAS關鍵位點的飽和突變體庫，以提高GMAS對關鍵底物谷氨酸的催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

E.coliBL21(DE3)菌株，質粒pETDuet-1為本實驗室保存。質粒pETDuet-1-GMAS-PPK和基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK由本實驗室構建。L-谷氨酸、乙胺和L-The均為分析純。

1.2 大腸桿菌合成L-The

將質粒pETDuet-1-GMAS-PPK轉化到BL21(DE3)中，構建合成L-The的基因工程菌BL21(DE3)/pETDuet-1-GMAS-PPK。將單菌落接種到培養(yǎng)基中，待OD600達到0.5-0.6，加入1.0 mM IPTG, 5 g/L L-谷氨酸，5 g/L 乙胺鹽酸鹽，250 RPM, 30℃, 發(fā)酵48 h。

1.3 同源模建及分子對接

選擇源于Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶體結構為模板，運用Swiss-Model服務器建立GMAS的三維模型。使用AutoDock4.2軟件進行分子對接。采用AutoDockTools程序簡歷格點盒子，格子長寬高位置為4 nm，間隔0.375?，采集128個構象。通過拉馬克遺傳算法將全局和局部搜索的能量優(yōu)化結合，尋找配體與受體最佳結合位置，完成分子對接。采用PyMOL軟件分析對接后復合物的三維結構。

1.4 飽和突變文庫的構建和篩選

基于GMAS一級結構和三維結構分析，選擇在GMAS的E174位點進行飽和突變。設計含有簡并密碼子 NNK( N = A /T/C/G，K = G/T) 的引物，以重組質粒pETDuet-1-GMAS-PPK為模板，利用PCR方法 (PCR反應條件: 98℃變性60 s; 98℃預變性 30 s，55℃退火 15 s，72℃延伸7 min，30個循環(huán); 72℃充分延伸5 min; 16℃保存) 進行飽和突變以構建突變文庫。通過Sanger公司(上海)測序，確定正確的突變體。挑取正確的轉化子接種到含有 2 mL LB液體培養(yǎng)基的玻璃試管中，于 37℃，200 r/min 條件下培養(yǎng) 8 h 后，轉接至含有 10 mL LB 液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，37℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)至 OD600為 0. 6-0. 8，向培養(yǎng)基中添加0. 5 mM IPTG，不同濃度的L-谷氨酸和乙胺，于30℃，200 r/min條件下誘導培養(yǎng) 12 h。通過高效液相色譜法測定L-The產量。

1.5 分析方法

L-谷氨酸和L-The用高效液相色譜法進行定性和定量分析。衍生劑采用苯異硫酸酯[9]，XDB-C18柱，操作溫度40℃，流速1.0 mL/min， 檢測波長254 nm。

2 結果與分析

2.1 GMAS與L-谷氨酸的模建結構與分子對接

位于酶底物結合口袋附近的氨基酸突變通常會在一定程度上影響酶的空間結構、電荷分布及疏水性，從而影響酶的催化活性和底物專一性等催化特性[10]。選取Methyloversatilisuniversalis的GMAS的晶體結構為模板建立了 GMAS 的三維模型，并將底物對接到建立好的三維模型中，對接結果見圖2。結構生物學數(shù)據(jù)表明，GMAS的底物結合口袋相對保守，推測口袋內識別底物谷氨酸和乙胺的關鍵氨基酸殘基為E174。通過在線服務器SWISS-MODEL對GMAS中缺失的結構進行同源模建補全，然后進行分子對接。GMAS與L-谷氨酸的模建結構與分子對接結果見圖2。

圖2 GMAS與L-谷氨酸的模建結構與分子對接

2.2 E174位點飽和突變對合成L-茶氨酸的影響

利用含有簡并密碼子的引物進行E174位點飽和突變以構建突變文庫，獲得了庫容20 株的突變文庫。結果顯示，突變體E174A、E174R、E174C、E174E和E174S與野生型E174在L-The產量上無顯著性差別，而突變體E174A和E174G在L-The產量上相較野生型，提高了19%和24%。搖瓶發(fā)酵24 h，L-The產量達到1.71 g/L和1.78 g/L(圖3)。其他飽和突變體導致L-The產量現(xiàn)在下降。E174A和E174G這兩個突變體明顯提高了L-The在大腸桿菌中的合成能力，實現(xiàn)了L-The產量的大幅提高。

圖3 突變體E174A和E174G提高大腸桿菌L-The產量

3 討論

L-The是茶樹中最具代表性的非蛋白氨基酸，是茶葉的鮮味成分之一，有助于茶的獨特風味。由于其多種保健功能，L-The已被商業(yè)開發(fā)為一種有價值的成分，被廣泛用作食品補充劑和添加到藥物、保健品和化妝品中。微生物發(fā)酵法生產L-The具有一步完成反應、原料價格低廉、容易從反應液中提取獲得產物、轉化效率高、可大量生產等特點，因此，采用微生物發(fā)酵法是實現(xiàn)L-The規(guī)?；a的潛在優(yōu)勢途徑。為了提高GMAS的在大腸桿菌中的表現(xiàn)，過表達構建的GMAS的 E174 位點飽和突變體，希望獲得在大腸桿菌胞內表現(xiàn)更好的GMAS，經過發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn) GMAS (E174A) 和GMAS (E174G)的點突變，顯著提高了大腸桿菌合成L-The的產量，這證明了 E174位點對 GMAS 的重要性。