牦牛源BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的原核表達(dá)及抗原表位分析

王慧慧，馮茜莉，蒲飛洋，李易聰，汪夢(mèng)竹，周小凱，趙澤陽(yáng)，馬忠仁，李 倬，馬曉霞

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州 730030;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730010)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹瀉病(bovine viral diarrhea,BVD)及黏膜病(mucosal disease,MD)的主要病原，也稱牛病毒性腹瀉-黏膜病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal diseas virus,BVD-MDV)，畜群感染該病毒后臨床癥狀復(fù)雜多樣，可表現(xiàn)為腹瀉、血小板減少、急性或慢性黏膜疾病、免疫抑制、出血綜合征和持續(xù)性感染，并出現(xiàn)繁殖障礙，即母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等，也可由免疫抑制導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)性疾病[1-2]，給全世界范圍內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)及邊界病毒(Border disease virus,BDV)也屬于瘟病毒屬，它們之間有較高的相似性，且能突破宿主特異性，存在交叉抗原并且多克隆抗體對(duì)BVDV和CSFV具有血清學(xué)交叉反應(yīng)[3-4]。BVDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，僅有一種血清型，不同毒株間存在遺傳多樣性，即存在大量基因亞型[5-8]。根據(jù)病毒基因組5′-非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR)序列的差異性，可將病毒分為BVDV-1和BVDV-2兩個(gè)基因型，并且根據(jù)病毒液接種細(xì)胞后能否產(chǎn)生細(xì)胞病變，可把BVDV毒株分為非致細(xì)胞病變型(non-cytopathogenic,NCP)和致細(xì)胞病變型(cytopathogenic,CP)兩種生物型[9-10]。

BVDV基因組全長(zhǎng)大約12.5 kb，整個(gè)基因組由5′-UTR、開(kāi)放閱讀框 (open reading frame,ORF)和3′-UTR組成。ORF編碼區(qū)編碼一條長(zhǎng)約4 000個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體多肽鏈，并進(jìn)一步由細(xì)胞和病毒基因編碼的蛋白酶加工成成熟的病毒蛋白，包括4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[11]。這些蛋白在基因組上的位置從N端到C端依次為：Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。其中Capsid、Erns、E1和E2為BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成BVDV的衣殼和囊膜，其余8種為非結(jié)構(gòu)蛋白[12]。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及病毒與宿主的相互作用中起重要作用。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A由497個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其編碼基因長(zhǎng)約1 488 bp，是一種磷酸化酶，可以與多種宿主細(xì)胞蛋白作用，同時(shí)也是病毒復(fù)制子的重要組成部分[13]。此外，NS5A還可以結(jié)合病毒5′-UTR，并與3′-UTR互作誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制[14]。由于對(duì)NS5A蛋白的表達(dá)功能研究較少，因此本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)NS5A基因，獲得非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A，為后續(xù)病毒與宿主細(xì)胞蛋白互作篩選及病毒的免疫學(xué)檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)周期短、水平高的特點(diǎn)構(gòu)建BVDV NS5A原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。通過(guò)DNAStar預(yù)測(cè)NS5A蛋白抗原表位，為疫苗和藥物研發(fā)及BVDV防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及毒株 牛腎細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney cell，MDBK)和BVDV毒株GSTZ由生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖、DNA回收試劑盒、50×TAE、PVDF膜均購(gòu)自Solarbio公司；4×Lodding Buffer、DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、IPTG、氨芐青霉素、T4 DNA連接酶、pET-28a(+)載體、TaqDNA聚合酶、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；新生牛血清(NBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰酶均購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司；鼠抗His多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均由生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要儀器 核酸電泳儀(BIO-RAD)購(gòu)自北京市六一儀器廠；超聲細(xì)胞破碎儀(SC2ENT2-650-E)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；化學(xué)發(fā)光分析儀(WD-9423C)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；臺(tái)式搖床(KB3-D)購(gòu)自杭州瑞城儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱(3111)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；酶標(biāo)儀(1530)、梯度PCR儀(K960)購(gòu)自力新儀器(上海)有限公司；水浴鍋(HH-1)購(gòu)自北京科偉永興儀器有限公司；超低溫冰柜(DW-86L386)購(gòu)自海爾集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取 將從牦牛血清中分離到的BVDV GSTZ毒株接種到MDBK細(xì)胞中進(jìn)行增殖，每隔24 h觀察1次，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，即細(xì)胞脫落變圓、聚集成堆、細(xì)胞瓶上出現(xiàn)空泡變性時(shí)收取細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不接毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照，于-80 ℃反復(fù)凍融3次，根據(jù)Trizol法提取RNA的說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的BVDV-1型毒株V006的NS5A基因核苷酸序列(GenBank登錄號(hào)：KX170647)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性檢測(cè)引物(BVDV NS5A-F:5′-CCCAAGCTTATGTCTGGGAA-3′，BVDV NS5A-R:5′-TATACAATGAAGCTAGGATCCGCG-3′)擴(kuò)增NS5A基因,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 488 bp，下劃線部分分別為Hind Ⅲ和BamHⅠ的酶切位點(diǎn)。引物由金唯智生物有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增BVDVNS5A基因 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的病毒總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增NS5A基因，反應(yīng)體系參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，用膠回收試劑盒回收目的片段，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。部分產(chǎn)物送西安擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，用于遺傳進(jìn)化分析。

1.2.4NS5A基因遺傳進(jìn)化分析 從GenBank中找出17株BVDVNS5A基因序列，分別為：C24V株(GenBank登錄號(hào)：AF091605)、VEDEVAC株(GenBank登錄號(hào)：AF268278)、C413株(GenBank登錄號(hào)：AF002227)、KS86-1cp株(GenBank登錄號(hào)：AB078952)、KS86-1ncp株(GenBank登錄號(hào)：AB078950)、Osloss株(GenBank登錄號(hào)：M96687)、p24515株(GenBank登錄號(hào)：AY149216)、SD-1株(GenBank登錄號(hào)：M96751)、New York 93株(GenBank登錄號(hào)：AF502399)、ZM-95株(GenBank登錄號(hào)：AF526381)、Singer_Arg株(GenBank登錄號(hào)：DQ088995)、KE9株(GenBank登錄號(hào)：EF101530)、p11Q株(GenBank登錄號(hào)：AY149215)、XJ-04株(GenBank登錄號(hào)：FJ527854)、JZ05-1株(GenBank登錄號(hào)：GQ888686)、Hokudai-Lab/09株(GenBank登錄號(hào)：AB567658)和CP7株(GenBank登錄號(hào)：U63479)。應(yīng)用DNAStar中Clustal W Method和Mega 5.0軟件對(duì)上述病毒株NS5A基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)并分析[15-16]。

1.2.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將NS5A基因和載體pET-28a(+)分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接，連接體系10 μL：NS5A酶切產(chǎn)物7 μL，pET-28a(+)酶切產(chǎn)物1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，Buffer 1 μL。16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒送金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a-NS5A。然后將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-NS5A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單個(gè)菌落，于37 ℃培養(yǎng)擴(kuò)增后進(jìn)行質(zhì)粒提取并用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆送金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.6 NS5A原核表達(dá)及檢測(cè) 挑取已鑒定的陽(yáng)性菌落加入到含有50 μg/mL氨芐青霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取新鮮菌液按1∶100加至含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，200 r/min震蕩培養(yǎng)，在600 nm 吸光度達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入1 mol/L IPTG，分別誘導(dǎo)3、6、9和12 h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)空載體和未誘導(dǎo)表達(dá)載體為對(duì)照組，收集2 mL菌液，將收集的菌體4 ℃、12 000 r/min 離心 5 min，棄上清，向沉淀中加入100 μL PBS緩沖液混勻，加入25 μL 4×Loadding Buffer，100 ℃金屬浴煮10 min，冷卻后取10 μL蛋白樣品進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。另外重組蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分析后，用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印儀將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用10 mL 50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次20 min。然后用一抗鼠抗His多克隆抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次20 min。二抗HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。HRP顯色分析。

1.2.7 BVDV NS5A蛋白抗原表位的預(yù)測(cè) 利用DNAStar軟件提供的protean模塊中的Kyte-Doolittle、Emini、Karplus-Schulz、以及Garnier-Robson和Chou-Fasman方法對(duì)NS5A蛋白親水性、表面可塑性、蛋白柔性以及蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；然后利用Jameson-Wolf法預(yù)測(cè)NS5A蛋白抗原性，并綜合蛋白質(zhì)的親水性、表面可塑性、蛋白柔性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析NS5A蛋白抗原表位[17-18]。

2 結(jié) 果

2.1 GSTZ毒株感染細(xì)胞結(jié)果

將BVDV GSTZ毒株懸液接種到MDBK細(xì)胞中進(jìn)行增殖，每隔24 h觀察1次，48 h時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞脫落變圓、聚集成堆，72 h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，陰性對(duì)照則無(wú)明顯變化(圖1)，此時(shí)收取細(xì)胞。

2.2 BVDV NS5A基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

BVDVNS5A基因PCR擴(kuò)增獲得了1條1 488 bp的特異性目的條帶(圖2)，與預(yù)期一致。

M，DL5000 DNA Marker；1，NS5A基因；2，陰性對(duì)照M，DL5000 DNA Marker；1，NS5A gene;2，Negative control圖2 NS5A基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of NS5A gene

2.3 NS5A基因遺傳進(jìn)化分析

遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，GSTZ毒株NS5A序列與BVDV-1型毒株Singer Arg株和NS3株的進(jìn)化關(guān)系較近(圖3)；與BVDV-2型的病變型New York 93株、Hokudai-Lab/09、XJ-04、JZ05-1以及非病變型P4515株、C413株被劃分于不同的進(jìn)化分支上。由此可以推斷出GSTZ毒株基因型屬于BVDV-1型。

圖3 BVDV NS5A基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of BVDV NS5A gene

2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定，分別在1 488 bp和5 369 bp處出現(xiàn)單一條帶(圖4)，表明目標(biāo)序列與pET-28a(+)表達(dá)載體連接成功。測(cè)序結(jié)果表明，NS5A基因片段正確插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，所構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒pET28a-NS5A可用于后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)。

M，DL2000 DNA Marker；1～6，pET28a-NS5A雙酶切M，DL2000 DNA Marker；1-6，Double digestion of pET28a-NS5A圖4 質(zhì)粒pET28a-NS5A酶切鑒定Fig.4 Identification of plasmid PET28A-NS5A by enzyme digestion

2.5 pET28a-NS5A誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting檢測(cè)NS5A蛋白的表達(dá)

由SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，與未誘導(dǎo)的pET28a-NS5A重組菌相比，IPTG誘導(dǎo)的pET28a-NS5A重組菌在55 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖5)。為進(jìn)一步探究NS5A是否在大腸桿菌中有效表達(dá)，經(jīng)Western blotting檢測(cè)重組蛋白被抗His抗體特異性識(shí)別(圖6)，大小與預(yù)期相同，而空載體組并沒(méi)有出現(xiàn)明顯條帶。表明NS5A在大腸桿菌中得到了表達(dá)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)的pET-28a(+)；2，未誘導(dǎo)的pET28a-NS5A；3，IPTG誘導(dǎo)9 h后的pET-28a(+)；4～7，IPTG分別誘導(dǎo)3、6、9、12 h后的pET28a-NS5AM，Protein Marker;1，pET-28a(+) uninduced;2，pET28a-NS5A uninduced;3，pET-28a(+) induced by IPTG for 9 h;4-7,pET28a-NS5A induced by IPTG for 3,6,9 and 12 h,respectively圖5 pET28a-NS5A重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.5 Prokaryotic expression of recombinant pET28a-NS5A plasmid

圖6 Western blotting 檢測(cè)NS5A蛋白Fig.6 Detection of NS5A protein by Western blotting

2.6 NS5A蛋白抗原表位預(yù)測(cè)

2.6.1 NS5A蛋白親水性及表面可塑性的預(yù)測(cè) 蛋白親水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NS5A蛋白具有較高的親水性，主要集中在12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463和469—495位氨基酸處(圖7)。表面可塑性分析結(jié)果顯示，NS5A蛋白表面可塑性較高的區(qū)域主要為14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸處(圖8)。

圖7 Kyte-Doolittle 預(yù)測(cè) NS5A蛋白的親水性Fig.7 Hydrolicity of NS5A protein predicted by Kyte-Doolittle

圖8 Emini預(yù)測(cè)NS5A蛋白的表面可塑性Fig.8 Surface accessibility of NS5A protein predicted by Emini

2.6.2 NS5A蛋白柔性區(qū)域預(yù)測(cè) Karplus-Schulz法預(yù)測(cè)NS5A蛋白柔性區(qū)域，結(jié)果顯示NS5A蛋白上含有的柔性區(qū)域較多，主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸處(圖9)。

圖9 Karplus-Schulz 預(yù)測(cè)NS5A蛋白柔性區(qū)域Fig.9 Flexible regions of NS5A protein predicted by Karplus-Schulz

2.6.3 NS5A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 使用Garnier-Robson和Chou-Fasman 2種方法對(duì)BVDV NS5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的預(yù)測(cè)方法對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析存在差異，并且α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲特定結(jié)構(gòu)的數(shù)目及所處的位置也存在明顯差異(圖10)。2種方法共有的α-螺旋區(qū)域主要集中在105—108、114—118、144—148、173—184、188—194、328—334、372—383、386—413、425—436、448—456和468—478位氨基酸處；共有的β-折疊區(qū)域主要集中在5—11、42—43、96—99、112—115、118—129、152—155、157—161、199—209、211—216、229—241、286—296、323—327、339—344、419—424和492—496位氨基酸處；共有的轉(zhuǎn)角區(qū)域主要在32—35、37—40、46—50、58—60、88—90、131—135、195—198、301—303、335—337、364—366和440—411位氨基酸處；而Garnier-Robson預(yù)測(cè)的無(wú)規(guī)則卷曲位于28—30、69—73、165—171、248—150、304—306、317—322、345—351、366—368和443—447位氨基酸處。

A，α-螺旋；B，β-折疊；T，轉(zhuǎn)角；C，無(wú)規(guī)則卷曲A，Alpha helix；B，Beta sheet；T，Turn；C，Random coil圖10 Garnier-Robson和Chou-Fasman預(yù)測(cè)NS5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.10 Secondary structure of NS5A protein predicted by Garnier-Robson and Chou-Fasman

2.6.4 NS5A蛋白抗原性預(yù)測(cè) NS5A蛋白所在的抗原性區(qū)域主要位于15—23、33—114、129—138、141—146、153—160、167—190、193—202、216—228、241—263、270—277、294—341、346—362、364—380、414—424和465—493位氨基酸處(圖11)。

圖11 Jameson-Wolf 預(yù)測(cè) NS5A蛋白的抗原性Fig.11 Antigenicity of NS5A protein predicted by Jameson-Wolf

綜合以上預(yù)測(cè)和分析，并結(jié)合NS5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，得出NS5A蛋白存在B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸殘基處(表1)。

表1 氨基酸位點(diǎn)

3 討 論

NS5A蛋白的具體功能雖然尚不明確，但是NS5A復(fù)雜多樣的功能使其成為抗病毒藥物研發(fā)的靶標(biāo)。NS5A蛋白通過(guò)和NS3、NS4A、NS4B及NS5B蛋白形成病毒的復(fù)制酶復(fù)合體，參與病毒基因的復(fù)制[19]。其他研究還發(fā)現(xiàn)，NS5A蛋白和NS4B蛋白可以和細(xì)胞內(nèi)的囊泡膜結(jié)合蛋白A結(jié)合[20]。NS5A蛋白在BVDV的生活周期中所扮演的具體角色還沒(méi)有定論，除了參與病毒基因復(fù)制之外，NS5A蛋白對(duì)BVDV的蛋白翻譯也具有調(diào)節(jié)作用[21-22]。目前，BVDV疫情在全世界范圍內(nèi)以不同的程度暴發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，在BVDV基因組5′-UTR內(nèi)存在著一段特殊的序列，稱為核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)，這段序列可以通過(guò)和核糖體結(jié)合而促進(jìn)BVDV的蛋白翻譯[23]。BVDV NS5A蛋白可以和5′-UTR的IRES結(jié)合，從而中斷核糖體與IERS的結(jié)合，抑制BVDV的蛋白翻譯而影響起始病毒的基因復(fù)制，使病毒從蛋白的合成階段進(jìn)入到病毒基因的復(fù)制階段，這種作用在病毒感染早期具有重要意義。

NS5A蛋白相較于BVDV其他蛋白來(lái)說(shuō)較保守，F(xiàn)u等[24]的研究表明，BVDV NS5A與翻譯延伸因子1α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)的互作關(guān)系較為保守，這也可在一定程度上影響B(tài)VDV復(fù)制。本研究用RT-PCR的方法獲得BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A基因，然后將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，通過(guò)酶切和序列測(cè)定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)電泳檢測(cè)和Western blotting證明非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A在大腸桿菌內(nèi)得到表達(dá)。NS5A原核表達(dá)載體的成功構(gòu)建為后期NS5A蛋白功能和致病性機(jī)制的研究創(chuàng)造了條件，可以通過(guò)NS5A蛋白功能特點(diǎn)及與其他蛋白的互作關(guān)系研制抑制病毒復(fù)制的相關(guān)藥物，如黃雯靜[25]通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了甲基轉(zhuǎn)移酶3 (methyltransferase-like 3，METTL3)與BVDV NS5A蛋白可能的相互作用關(guān)系，為抑制病毒復(fù)制奠定基礎(chǔ)。本研究也根據(jù)DNAStar軟件預(yù)測(cè)分析了NS5A蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，了解該蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲等區(qū)域的結(jié)構(gòu)分布信息，并從蛋白的親水性、表面可塑性、柔性和抗原性等方面對(duì)NS5A蛋白的抗原表位分布和構(gòu)成情況進(jìn)行了全面分析，為深入研究該蛋白的免疫學(xué)特性及研發(fā)BVDV新型疫苗和藥物靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功表達(dá)并鑒定了牦牛源BVDV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)表明BVDV GSTZ株基因型屬于BVDV-1型，NS5A蛋白的B細(xì)胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸處。