WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化的影響及其在小鼠不同生長階段的表達

王 楠，馮保亮，鄭云曦，黃 雷，王 悅，徐松松，，張秀玲，劉志國，李 奎，，牟玉蓮

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.天津市寧河原種豬場有限責(zé)任公司，天津 301504；3.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院，南昌 330031；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120)

脂肪組織是一類疏松結(jié)締組織，具有貯存能量、產(chǎn)熱以及保護生物體內(nèi)器官等作用。脂肪組織的形成主要是脂肪細(xì)胞體積以及數(shù)量增加的結(jié)果，脂肪細(xì)胞生成主要包括脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化形成前脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞通過終末定向分化最終形成成熟的脂肪細(xì)胞2個階段[1]。脂肪細(xì)胞分化是一個高度有序的過程，受到相關(guān)激素、轉(zhuǎn)錄因子、基因和信號通路的調(diào)控[2]。在脂肪細(xì)胞分化階段，CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)轉(zhuǎn)錄因子家族以及過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)[3-4]在脂滴形成中起關(guān)鍵作用[5]，尤其是PPARγ處于脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心位置。長亞型核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子1(L-NRF1)是脂肪生成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，L-NRF1基因敲低可通過上調(diào)PPARγ的表達增強3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂能力，L-NRF1-741的過表達可通過下調(diào)PPARγ的表達顯著減弱3T3-L1細(xì)胞的脂肪生成潛能[6]。沉默中介復(fù)合物亞基19(MED19)也可以通過介導(dǎo)PPARγ基因調(diào)控脂肪生成[7]。Zhu等[8]研究表明，溶質(zhì)載體蛋白家族25成員5(SLC25A5)可以調(diào)控脂肪分化，SLC25A5的缺失可抑制C/EBPα、PPARγ等脂肪生成相關(guān)因子的表達，減少甘油三酯的積累。解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)也可調(diào)控脂肪細(xì)胞分化，減少動物脂肪沉積[9-10]。雖然國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與脂肪生成性狀相關(guān)的候選基因，并明確了其與轉(zhuǎn)錄因子的相互關(guān)系。然而，當(dāng)前影響脂肪生成的基因鑒定仍存在不足，調(diào)控機理的解析仍有待深入。因此，挖掘與脂肪生成相關(guān)的候選基因并闡明其調(diào)控機制一直是研究的熱點。

野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1(WIP1)是一種絲/蘇氨酸磷酸酶，由蛋白磷酸化酶Mg2+/Mn2+依賴性1D(PPM1D)基因編碼[11]，屬于2C家族蛋白磷酸化酶(PP2C)家族成員[12]，分別位于人的17號染色體[13]、小鼠的11號染色體[11]、豬的12號染色體。人、豬、牛、羊WIP1蛋白均由605個氨基酸組成，小鼠WIP1蛋白由598個氨基酸組成，這5個物種WIP1蛋白序列相似度高達81%，表明其在哺乳動物中高度保守。WIP1基因在動物體內(nèi)廣泛表達，是各種生物過程中的重要調(diào)控因子，如在細(xì)胞增殖、衰老、凋亡、自噬、DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和動脈粥樣硬化疾病等生理和病理過程中發(fā)揮著功能[14-21]。隨著研究的不斷深入，WIP1基因與脂肪的關(guān)系越來越受到關(guān)注。WIP1基因過表達的人間充質(zhì)干細(xì)胞能夠表達脂肪生成特異性標(biāo)記，而野生型細(xì)胞不表達，提示W(wǎng)IP1基因可能具有調(diào)控脂肪生成的能力[22]。Le Guezennec等[23]報道WIP1基因在脂肪聚集中發(fā)揮著重要的作用，其可促進小鼠體重的增長和脂肪的累積。隨后，Armata等[24]報道在高脂飼喂條件下，與對照組相比，WIP1基因敲除小鼠可以阻止高脂誘導(dǎo)的肥胖、食物消耗水平降低和瘦素水平降低。Li等[25]發(fā)現(xiàn)WIP1基因敲除小鼠胎兒成纖維細(xì)胞成脂分化能力嚴(yán)重下降，PPARγ等脂肪生成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達量下調(diào)。表明WIP1可能是一個新的調(diào)控脂肪生成的基因，但與脂肪生成的關(guān)系及其分子調(diào)控機制仍需要深入探究。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞是體外研究脂肪生成機制的良好模型，可揭示脂肪細(xì)胞分化的分子過程。3T3-L1細(xì)胞系向成熟的脂肪細(xì)胞分化的過程主要包括細(xì)胞周期停滯、定向誘導(dǎo)分化、有絲分裂克隆增殖以及形成成熟脂肪細(xì)胞的終末分化等階段[26]。本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為材料，構(gòu)建WIP1基因敲低細(xì)胞模型，在體外探究WIP1基因?qū)χ炯?xì)胞增殖及成脂分化的潛在調(diào)控作用，并在小鼠個體水平驗證其與脂肪沉積的相關(guān)性，為深入研究WIP1基因調(diào)控脂肪沉積的分子機制積累基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，以期為家畜選育提供新的基因素材。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試驗動物

3T3-L1前脂肪細(xì)胞(第15代)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物基因工程與種質(zhì)創(chuàng)新團隊保存；不同生長階段(21日齡、8周齡和6月齡)的SPF級C57BL/6J雄性小鼠各10只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所SPF級鼠房統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30243.01)購自HyClone公司；胎牛血清(10099-141)、青-鏈霉素(15140-122)和0.25%胰酶(25200072)均購自Gibco公司；Lipofectamine RNAiMAX(13778-075)和Opti-MEM(31985-070)購自Invitrogen公司；CCK-8(CK04)購自Dojindo公司；胰島素(I2643)、地塞米松(D1756)、異丁基甲基黃嘌呤(I5879)和羅格列酮(R2408)均購自Sigma公司；甘油三酯酶法測定試劑盒(E1013-105)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；β-actin抗體(4970S)和PPARγ抗體(2443S)購自Cell Signaling Technology公司；WIP1抗體(ab31270)購自Abcam公司；RNAiso Plus(9109)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)和SYBR熒光定量試劑盒(RR820A)均購自TaKaRa公司；油紅O染色液(G1260)購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞裂解液(778501)、蛋白酶和磷酸酶抑制劑(A32959)均購自Thermo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)購自Beyotime公司；上樣緩沖液(CW0027S)購自CWBIO公司；脫脂奶粉(232100)購自Becton Dickinson公司；NC膜(HATF00010)購自Millipore公司。

1.3 siRNA篩選

1.3.1 siRNA設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中小鼠WIP1基因mRNA序列(登錄號：NM_016910.3)，分別針對堿基位點790、893和1 845附近區(qū)域設(shè)計3對WIP1-siRNAs(WIP1-790、WIP1-893、WIP1-1845)，以非特異性片段為陰性對照(NC-siRNA),并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進行序列合成，序列信息見表1。

表1 WIP1基因siRNA序列

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 3T3-L1前脂肪細(xì)胞(第17代)以2×105/孔鋪板于12孔板中，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后進行siRNA的轉(zhuǎn)染(細(xì)胞生長密度達到70%～80%)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine RNAiMAX，參照試劑說明書轉(zhuǎn)染體系和操作流程將WIP1-siRNAs和NC-siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系配制如下：用Opti-MEM培養(yǎng)液將3 μL Lpofectamine RNAiMAX配制成50 μL的預(yù)混液1；然后取0.5 μL siRNA用Opti-MEM稀釋為50 μL的預(yù)混液2，將預(yù)混液1和預(yù)混液2混合后配制為完整的轉(zhuǎn)染體系，于室溫下避光孵育20 min。將100 μL轉(zhuǎn)染體系逐滴加入預(yù)先加入培養(yǎng)液的單個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后換成預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基，并于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞樣品進行后續(xù)試驗。

1.3.3WIP1基因siRNA干擾效率檢測 利用Trizol方法提取1.3.2收集細(xì)胞的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中WIP1、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和CyclinB1、PPARγ、C/EBPα、脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)和β-actin基因mRNA序列，利用Primer-BLAST工具設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus) (2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。根據(jù)WIP1-siRNAs組和NC-siRNA組WIP1基因表達情況，選取干擾效果最佳的WIP1-siRNA開展后續(xù)的細(xì)胞功能試驗。

表2 引物信息

1.4 干擾WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

1.4.1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞(第17代)鋪至96孔板中，接種密度為5.6×104/cm2；培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)IP1-siRNA和NC-siRNA，每個轉(zhuǎn)染組設(shè)置0、12、24、48、72、96和120 h 7個檢測時間點，每個時間點設(shè)置5個重復(fù)。按照CCK-8試劑盒說明書進行細(xì)胞增殖情況檢測。利用酶標(biāo)儀檢測D450 nm值，比較不同轉(zhuǎn)染組相應(yīng)時間點D450 nm值差異。

1.4.2 細(xì)胞周期基因表達檢測 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞(第17代)以5.6×104/cm2鋪于12孔板中，分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)IP1-siRNA和NC-siRNA，每個轉(zhuǎn)染組設(shè)置3個重復(fù)。分別收集轉(zhuǎn)染24和48 h后的細(xì)胞樣品，進行脂肪細(xì)胞總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，按照1.3.3的方法檢測細(xì)胞周期基因的表達。

1.5 干擾WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響

1.5.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞(第17代)分別轉(zhuǎn)染W(wǎng)IP1-siRNA和NC-siRNA，每個轉(zhuǎn)染組設(shè)置3個復(fù)孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+5 μg/mL胰島素+0.4 μg/mL地塞米松+0.5 mol/L異丁基甲基黃嘌呤+1 μmol/L羅格列酮+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素)開始成脂誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理2 d(分化第2天)后將其換成維持培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+5 μg/mL胰島素+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d(分化第4天)，然后更換為DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素)。之后每2 d更換1次DMEM完全培養(yǎng)基。

1.5.2 脂肪細(xì)胞油紅O染色 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA組成脂誘導(dǎo)8 d的細(xì)胞，按照油紅O染色試劑盒的說明進行染色。染色后的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。每孔細(xì)胞加入1 mL異丙醇，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min，萃取油紅O染液，并用分光光度計檢測D510 nm值。

1.5.3 脂肪細(xì)胞甘油三酯檢測 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA組成脂誘導(dǎo)分化8 d的細(xì)胞樣品，按照甘油三酯酶測定試劑盒說明檢測各組細(xì)胞甘油三酯含量。

1.5.4 成脂分化標(biāo)志基因mRNA表達量的檢測 收集WIP1-siRNA和NC-siRNA組誘導(dǎo)分化8 d的細(xì)胞，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，按照1.3.3的方法檢測PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1基因的表達情況。

1.5.5 WIP1、PPARγ蛋白表達量的檢測 在WIP1-siRNA和NC-siRNA組誘導(dǎo)分化8 d的細(xì)胞培養(yǎng)孔中每孔加入120 μL配置好的蛋白裂解液(10 mL細(xì)胞裂解液中加入50 mg蛋白酶和磷酸酶抑制劑)冰上裂解30 min。細(xì)胞裂解物4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并用BCA法檢測蛋白濃度。各取20 μg蛋白于上樣緩沖液中100 ℃熱變性10 min，使用10% SDS-PAGE電泳凝膠進行蛋白的分離，然后轉(zhuǎn)移到NC膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別孵育WIP1(1∶1 000)、PPARγ(1∶2 000)蛋白的一抗以及對應(yīng)的二抗(1∶2 000)，孵育完成后在Tanon化學(xué)發(fā)光儀中觀察并拍照，使用ImageJ 1.48軟件統(tǒng)計灰度值。

1.6 WIP1基因在小鼠不同生長階段脂肪組織中的表達量檢測

分別采集21日齡、8周齡和6月齡小鼠各10只的腹股溝皮下脂肪組織(ingWAT)和性腺脂肪組織(pgWAT)，用Trizol方法提取組織RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，按照1.3.3的方法檢測腹股溝皮下脂肪組織和性腺脂肪組織中WIP1基因的表達情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Tukey法進行組間多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA篩選

由圖1可知，與NC-siRNA組相比，3對siRNAs組WIP1基因的表達量均極顯著降低(P<0.01)，其中WIP1-790與WIP1-1845的干擾效率可達70%以上，WIP1-893的干擾效率在50%以上。因此后續(xù)細(xì)胞試驗選用干擾效率最高的WIP1-790。

2.2 干擾WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，WIP1-790干擾組細(xì)胞的增殖速率在指數(shù)增長期(24、48和72 h)、平臺期(96 h)和退化衰亡期(120 h)均極顯著低于NC-siRNA組細(xì)胞(P<0.01)(圖2A)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，WIP1-790干擾組細(xì)胞在干擾后24和48 h，CyclinD1和CyclinB1基因mRNA水平均極顯著低于NC-siRNA組細(xì)胞(P<0.01)(圖2B)。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖6同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as fig.6圖1 WIP1-siRNAs干擾效率的檢測Fig.1 Detection of WIP1-siRNAs interference efficiency

2.3 干擾WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響

2.3.1 干擾WIP1基因?qū)χ|(zhì)積聚的影響 油紅O染色結(jié)果顯示，WIP1-790干擾組細(xì)胞在分化第8天的油紅O染色陽性細(xì)胞(脂肪細(xì)胞)明顯少于NC-siRNA組(圖3A)。脂滴和甘油三酯的定量檢測結(jié)果顯示，與NC-siRNA組相比，WIP1-790干擾組細(xì)胞的脂滴數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，甘油三酯含量顯著降低(P<0.05)(圖3B、3C)。

2.3.2 干擾WIP1基因?qū)Τ芍只瘶?biāo)志基因mRNA表達的影響 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與NC-siRNA組細(xì)胞相比，WIP1-790干擾組細(xì)胞的成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1的mRNA在分化第8天的表達水平均極顯著降低(P<0.01)(圖4)。

2.3.3 干擾WIP1基因?qū)Τ芍只蜃覲PARγ蛋白表達量的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與NC-siRNA組相比，WIP1-790干擾組細(xì)胞WIP1蛋白表達量顯著下降(P<0.05)；PPARγ蛋白表達水平極顯著下降(P<0.01)(圖5)。

①A，CCK-8增殖曲線；B，轉(zhuǎn)染后24和48 h Cyclin D1和Cyclin B1基因表達情況。②與NC-siRNA組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同①A,CCK-8 proliferation curve;B,The relative expression of Cyclin D1和Cyclin B1 genes at 24 and 48 h after transfection.②Compared with NC-siRNA group,*,Significant difference(P<0.05)；**，Extremely significant difference(P<0.01)；No *,No significant difference(P>0.05).The same as below圖2 干擾WIP1基因?qū)?xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of WIP1 gene interference on cell proliferation

A，油紅O染色(200×)；B，分化第8天異丙醇萃取油紅O分光光度檢測；C，分化第8天細(xì)胞中甘油三酯含量檢測A,Oil red O staining (200×);B,Spectrophotometric detection of oil red O extracted with isopropanol on the eighth day of differentiation;C,Detection of triglyceride content in cells on the eighth day of differentiation圖3 干擾WIP1基因?qū)?T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響Fig.3 Effects of WIP1 gene interference on adipogenic differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

圖4 成脂分化相關(guān)基因mRNA水平的檢測Fig.4 Detection of mRNA level of genes related to adipogenic differentiation

圖5 Western blotting檢測WIP1、PPARγ蛋白表達量Fig.5 WIP1 and PPARγ protein expression detected by Western blotting

2.4 WIP1基因在不同生長階段小鼠脂肪組織中的表達檢測

不同生長階段(21日齡、8周齡和6月齡)C57BL/6J小鼠的ingWAT和pgWAT中WIP1基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在ingWAT中8周齡小鼠WIP1基因表達量顯著高于21日齡小鼠(P<0.05)，6月齡小鼠極顯著高于8周齡(P<0.01)(圖6A)。在pgWAT中，8周齡小鼠WIP1基因表達量與21日齡小鼠無顯著差異(P>0.05)，而6月齡小鼠極顯著高于8周齡和21日齡小鼠(P<0.01)(圖6B)。

圖6 WIP1基因在小鼠不同生長階段腹股溝皮下脂肪組織(A)和性腺脂肪組織(B)中的表達情況Fig.6 The expression of WIP1 gene in ingWAT (A) and pgWAT (B) of mice at different growth stages

3 討 論

WIP1基因廣泛表達于全身各組織器官，作為一種蛋白磷酸酶參與不同信號通路的調(diào)控，在各靶器官中表現(xiàn)為特異的生物學(xué)功能，是一個典型的一因多效基因。WIP1基因的功能研究主要集中在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)[18]和癌癥發(fā)生等方面[27]。近年來，WIP1基因在脂肪沉積[23]、神經(jīng)發(fā)生[28-29]、生殖發(fā)育[30]等方面的作用逐步被發(fā)現(xiàn)和了解。WIP1基因的體外研究顯示，其在間充質(zhì)干細(xì)胞中的過表達能夠促進脂肪生成相關(guān)特異性標(biāo)志基因的表達，揭示其參與脂肪生成調(diào)控的潛在作用[22]。為了探究WIP1基因與3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系，本研究篩選到干擾效果良好的WIP1-siRNA，并以WIP1基因敲減的3T3-L1前脂肪細(xì)胞為模型，進行了細(xì)胞增殖速率和分化能力的檢測。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WIP1基因敲減細(xì)胞的增殖和分化能力均顯著下降，證實了WIP1基因可調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化。WIP1基因敲減后脂肪細(xì)胞CyclinB1、CyclinD1和PPARγ等基因的表達量也顯著下調(diào)，表明WIP1基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因的表達水平來促進細(xì)胞的增殖，并通過調(diào)節(jié)成脂分化相關(guān)基因的表達參與3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化能力的調(diào)節(jié)。

在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，已有研究發(fā)現(xiàn)，WIP1基因敲除后，神經(jīng)前體細(xì)胞[28]和支持細(xì)胞[30]的增殖受到抑制，其機制是轉(zhuǎn)型相關(guān)蛋白53(p53)活性下降導(dǎo)致細(xì)胞周期的G2期阻滯，CyclinB1基因參與細(xì)胞周期G2至M期轉(zhuǎn)換[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，CyclinB1基因表達量在WIP1基因干擾細(xì)胞中顯著下降，且細(xì)胞增殖速率降低，WIP1基因是否可能通過p53-Cyclin B1途徑調(diào)控前脂肪細(xì)胞的增殖有待探討。本研究中WIP1基因敲減后CyclinD1基因表達量降低，而CyclinD1基因?qū)?xì)胞周期G1期的調(diào)控具有重要作用[31]，暗示了WIP1基因也可能通過其他途徑參與了細(xì)胞周期G1期的調(diào)控。WIP1基因在前脂肪細(xì)胞增殖調(diào)控過程中的直接靶點及其分子調(diào)控機制還有待進一步研究。另外，WIP1基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞也發(fā)生了細(xì)胞周期G2期阻滯[32]，WIP1基因表達量下調(diào)引起的細(xì)胞周期阻滯將導(dǎo)致成體干細(xì)胞如成纖維細(xì)胞[16]和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[32]的早衰。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，WIP1基因是否影響前脂肪細(xì)胞周期的阻滯、早衰進而調(diào)控增殖也是需要探討的問題。在細(xì)胞分化調(diào)控方面，近期研究發(fā)現(xiàn)，WIP1基因?qū)Ψ只恼{(diào)控具有細(xì)胞特異性。如Ogasawara等[33]研究表明，WIP1基因通過對維甲酸-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(RA-Erk)信號通路的調(diào)控來抑制畸胎瘤細(xì)胞的分化，從而維持細(xì)胞的多能性；而在神經(jīng)前體細(xì)胞中，WIP1基因通過調(diào)控Dickkopf相關(guān)蛋白3-無翅型MMTV整合位點家族-Wnt(DKK3-Wnt)信號通路來促進神經(jīng)發(fā)生過程[29]；在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，WIP1基因通過Nemo樣激酶-Wnt(NLK-Wnt)信號通路促進生殖細(xì)胞的分化[34]。WIP1基因敲除抑制胎兒成纖維細(xì)胞的成脂分化能力，PPARγ基因表達下調(diào)，表明WIP1基因可能在脂肪發(fā)育早期就具有潛在的調(diào)控作用，其異常表達可能導(dǎo)致脂肪發(fā)生過程的失調(diào)[25]。此外，WIP1蛋白對成脂分化關(guān)鍵蛋白PPARγ S112位點的去磷酸化能夠提高PPARγ蛋白活性，進而促進脂肪生成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，WIP1基因通過上調(diào)PPARγ蛋白的表達來調(diào)控前脂肪細(xì)胞的分化，暗示其對PPARγ的調(diào)控作用不僅限于翻譯后調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平也可能具有調(diào)節(jié)，但具體分子機制及其在前脂肪細(xì)胞分化調(diào)控中的直接作用靶點有待深入的研究。由此可見，WIP1基因是一個對脂肪沉積具有重要作用的新候選基因，在瘦肉型豬的育種方面可能具有潛在的育種價值。

前脂肪細(xì)胞的增殖和分化對動物個體的脂肪沉積至關(guān)重要。小鼠脂肪組織在生長發(fā)育的早期(離乳期21日齡)和生長發(fā)育后期(性成熟期8周齡及中年期6月齡)呈現(xiàn)一定的規(guī)律，即在早期主要表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞的增殖和定向分化，而在后期則以成熟脂肪細(xì)胞維持分化為主。為了驗證WIP1基因在小鼠脂肪沉積過程中的潛在作用，本研究依據(jù)小鼠脂肪組織生長發(fā)育規(guī)律，選取了具有代表性的21日齡、8周齡和6月齡3個時期，并檢測了不同生長階段C57BL/6J小鼠的ingWAT和pgWAT中WIP1基因動態(tài)表達情況，結(jié)果顯示，隨著日齡的增長，小鼠脂肪組織中WIP1基因的表達顯著提高，暗示其與脂肪沉積的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，WIP1基因敲除小鼠體重和脂肪含量均顯著低于對照組，且對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型具有顯著的抵抗作用[23]，其體重顯著低于野生型對照小鼠，具體表現(xiàn)為內(nèi)臟脂肪沉積的降低，食物消耗水平降低和瘦素水平降低[24]。本研究發(fā)現(xiàn)WIP1基因的表達量隨著小鼠日齡的增長呈顯著的上升趨勢，進一步驗證了上述WIP1基因參與小鼠脂肪沉積調(diào)控的報道[23-24]。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，干擾WIP1基因表達可抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和脂肪分化能力，顯著降低細(xì)胞周期基因CyclinB1、CyclinD1和成脂分化相關(guān)標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1的表達量；WIP1基因在6月齡ingWAT和pgWAT表達量均極顯著高于21日齡和8周齡。結(jié)果可為深入了解動物脂肪細(xì)胞的生成和功能提供參考。