生物-化學(xué)法合成黑色素前體5,6-二羥基吲哚

金睿明，穆曉清，徐 巖

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室,無錫 214122；2.江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,宿遷 223800）

對(duì)苯二胺及其衍生物是染發(fā)劑中最常見和最有效的成分［1］，但對(duì)苯二胺具有致癌致畸等不良作用，對(duì)人體健康具有潛在危害［2］. 5，6-二羥基吲哚（5，6-Dihydroxyindole，DHI）的染發(fā)機(jī)理與對(duì)苯二胺相同，可深入毛髓內(nèi)部，染色明顯且不易掉色［3］，同時(shí)還具有低毒高效等優(yōu)點(diǎn). 因此，開發(fā)基于DHI的新型綠色安全染發(fā)劑已成為取代苯胺類染發(fā)劑的發(fā)展趨勢(shì)［4］.

DHI的工業(yè)合成大多采用苯乙腈、苯乙胺及苯甲醛等為原料通過化學(xué)方法合成. 苯乙腈法反應(yīng)步驟多，涉及去甲基、羥基化、硝化及還原等多步反應(yīng)，且反應(yīng)需在110 ℃以上，條件苛刻［5］；而苯乙胺法原料價(jià)格高，收率僅為10%［6］；苯甲醛法原料毒性大，環(huán)境污染嚴(yán)重［7］. 因此，綠色高效合成DHI 極具挑戰(zhàn)性.

科研人員在研究生物體內(nèi)黑色素代謝過程中發(fā)現(xiàn)，DHI是黑色素代謝的重要中間體［8，9］. 在生物體內(nèi)，酪氨酸或L-多巴（L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-Dopa）被酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）氧化為多巴醌（Dopaquinone，DQ），極不穩(wěn)定的DQ 經(jīng)過非酶促環(huán)化快速生成環(huán)多巴（Cyclodopa）和多巴色素（Dopachrome，DC）［10，11］，DC自發(fā)發(fā)生重排脫羧反應(yīng)生成DHI［12］. DHI經(jīng)過酶促或非酶促氧化快速形成吲哚5，6-醌（Indole-5，6-quinone，IQ），并最終通過聚合作用形成大分子黑色素，這種生物體內(nèi)的黑色素合成途徑被稱為Raper-Mason 途徑（Scheme 1）［13］. 目前，利用酪氨酸酶合成黑色素的研究較為廣泛［14～16］. 但由于生物體內(nèi)TYR 和氧的存在，不僅有利于底物酪氨酸和L-Dopa 合成DC，促進(jìn)DHI 的合成，同時(shí)生物催化劑和氧也會(huì)顯著促進(jìn)DHI 的氧化和聚合，導(dǎo)致DHI 在生物體細(xì)胞內(nèi)無法實(shí)現(xiàn)積累，目前利用TYR合成DHI的研究報(bào)道較少.

Scheme 1 Bio?chemical synthesis DHI in the Raper?Mason pathway

對(duì)Raper-Mason途徑關(guān)鍵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其影響因素的研究顯示，生物途徑合成并積累DHI需要解決底物高效轉(zhuǎn)化合成DHI及避免DHI的氧化聚合兩個(gè)關(guān)鍵問題. 研究表明，TYR及氧的存在有利于底物L(fēng)-Dopa 氧化合成中間產(chǎn)物DC，但DHI 酶促聚合與自發(fā)聚合反應(yīng)在速率上存在數(shù)量級(jí)差異［17］，有氧條件有利于DHI的氧化聚合［18］，因此分階段控制生物催化劑的存在及環(huán)境溶解氧濃度是積累DHI的重要影響因子. DHI聚合反應(yīng)的化學(xué)自發(fā)性導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間也成為影響DHI積累的限制因子［19］.

針對(duì)以上限制因素，本文采用全細(xì)胞催化的方式實(shí)現(xiàn)了不同步驟間生物催化劑的快速去除. 利用N2氣實(shí)現(xiàn)環(huán)境溶解氧濃度的控制，分別構(gòu)建了高溶氧條件下重組酪氨酸酶催化的L-Dopa合成DC生物氧化步驟，以及去除酪氨酸酶限制溶解氧條件下DC合成DHI的化學(xué)還原步驟. 通過優(yōu)化反應(yīng)過程，提高了底物轉(zhuǎn)化率，減少了DHI 的自發(fā)聚合，實(shí)現(xiàn)了DHI 的有效積累，建立了DHI 合成的生物-化學(xué)途徑［20］，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

重組表達(dá)菌株S.cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；葡萄糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris）及咪唑，分析純，上海生工生物工程技術(shù)有限公司；氨芐青霉素及sgDNA，上海索萊寶生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化和膠回收試劑盒，美國(guó)Omega 公司；DNA Marker，蛋白Marker，限制性內(nèi)切酶Xho I，EcoR I和Prime STAR，日本Takara 公司；ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit，南京Vazyme公司；引物合成和質(zhì)粒測(cè)序由無錫天霖生物科技有限公司完成；甲醇，色譜純，上海麥克林生化科技有限公司.

C1000 Touch 型雙48 孔梯度PCR 儀（PCR），美國(guó)BIO-RAD 公司；VCX750 型超聲細(xì)胞破碎儀（Ultrasonic Cell Disrupter System），美國(guó)Sonic公司；Cytation3型酶標(biāo)儀（Microplate Reader），美國(guó)Bio Tek公司；MALDI SYNAPT MS 型超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS），美國(guó)Waters公司；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（HPLC），美國(guó)Agilent公司；Star A型臺(tái)式溶解氧測(cè)量?jī)x（DO），美國(guó)Thermo Fisher 公司；A380 UV-1800 型紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-Vis），翱藝儀器（上海）有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 酪氨酸酶的異源表達(dá) 通過EcoR I，Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切構(gòu)建質(zhì)粒pYX212-TYR，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E. coliJM109進(jìn)行擴(kuò)增，平板劃線于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12 h，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序并驗(yàn)證目的條帶；提取質(zhì)粒. 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法［21］轉(zhuǎn)化進(jìn)S. cerevisiaeBY4741，涂布于省卻培養(yǎng)基（SD）平板中，于30 ℃靜置3 d，待長(zhǎng)出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于50 mL SD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)15 h后，轉(zhuǎn)接于500 mL相同的培養(yǎng)基中在相同條件下培養(yǎng)12 h，以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，收集菌體，待活化.

1.2.2 酪氨酸酶的活化 取適量收集后的菌體，稱重，懸浮于10 倍體積的2 mmol/L CuSO4的Tris-HCl溶液中（Tris-HCl的配制：將50 mL 0.1 mol/L Tris 和29.2 mL 0.1 mol/L鹽酸加水稀釋至100 mL，濃度為50 mmol/L，pH=8.0），于30 ℃靜置1 h，使Cu2+充分配位［22，23］，期間不斷混勻；以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體備用. 用0.1 mol/L EDTA-2Na 重新懸浮菌體，以除去多余的Cu2+，以8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體，備用. 用pH=3.6的醋酸-醋酸鈉緩沖重新懸浮菌體［24，25］，于30 ℃靜置1 h后以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集菌體，并用去離子水清洗.

1.2.3 酶活力測(cè)定 取100 mg活化后的S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR，在30 ℃下使細(xì)胞與1 mL含有0.8 μmolL-Dopa的水溶液反應(yīng)5 min. 酶活單位定義為：在測(cè)定條件下，每分鐘引起OD475增加0.001個(gè)單位為1 U［26～28］.

1.2.4 分析方法 用HPLC分析L-Dopa和DHI. Diomansil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：L-Dopa 280 nm，DHI 300 nm；柱溫20 ℃；流動(dòng)相A 為1.5%磷酸，流動(dòng)相B為100%甲醇；0 min：V（A）/V（B）=95/5；5 min：V（A）/V（B）=50/50；6～10 min：V（A）/V（B）=50/50；11 min：V（A）/V（B）=50/50；15 min：V（A）/V（B）=95/5.L-Dopa 出峰時(shí)間為6.29 min，DHI 出峰時(shí)間為8.69 min.

檢測(cè)DC在475 nm的極大吸收值. 采用稀釋測(cè)定的方法，通過稀釋將樣品的OD475限制在0.2～1.0之間，最終讀數(shù)為稀釋倍數(shù)與直接測(cè)定值的乘積.

采用LC/MS 分析DHI 低聚物. Zorbax Stable Bond C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相A：V（H2O）/V（MeOH）=95/5，含25 mmol/L NH4OAc；B：V（MeOH）/V（H2O）=95/5，含25 mmol/L NH4OAc；1～10 min：100%A，然后在20 min 內(nèi)逐漸升至100%B. 流速0.3 mL/min. MS 參數(shù)：毛細(xì)管電壓3.5 V，霧化器氣體：45 psi，干燥氣體9 L/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 TYR的異源表達(dá)與酶活測(cè)定

TYR（EC 1.14.18.1）是黑色素生物合成途徑的關(guān)鍵酶［29］，基于絲狀菌酪氨酸酶在宿主細(xì)胞內(nèi)的高穩(wěn)定性與安全性［30］，本文選擇用源于Aspergillus oryzae的酪氨酸酶基因（BAA07149.1）在釀酒酵母S288C 衍生體BY4741 中進(jìn)行異源表達(dá). 以穿梭質(zhì)粒pYX212 為載體，獲得了TYR 異源表達(dá)菌株S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR，實(shí)現(xiàn)了TYR的可溶性表達(dá).

L-Dopa在TYR的作用下氧化生成DQ，DQ具有極高的反應(yīng)活性，會(huì)快速自發(fā)環(huán)化生成DC. 由于在反應(yīng)死時(shí)間內(nèi)難以檢測(cè)到DQ 的生成［17］，F(xiàn)alguera等［16］通過測(cè)定相對(duì)穩(wěn)定的DC 來表征TYR 的活力.在酶促條件下，DC 還原并形成DH 的動(dòng)力學(xué)常數(shù)K達(dá)到5.19×10-2min-1［17］，DC在生物體內(nèi)極不穩(wěn)定，因此利用液相色譜等分析方法很難對(duì)DC 合成途徑進(jìn)行檢測(cè). 由于DC 是黑色素代謝的中間產(chǎn)物，且DC在全波長(zhǎng)范圍內(nèi)在475 nm 處有極大吸收峰，因此研究人員大多采用OD475對(duì)中間產(chǎn)物DC進(jìn)行檢測(cè)［31～34］.本文考察了細(xì)胞S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR催化L-Dopa 的酶活，反應(yīng)液呈現(xiàn)紅色，并隨時(shí)間變化而加深. 對(duì)反應(yīng)液的300～600 nm全波長(zhǎng)掃描顯示DC 在475 nm 處具有極大吸收峰，并隨時(shí)間而增強(qiáng).因此，利用OD475值可以表征DC的生成［35］. 重組細(xì)胞S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR 對(duì)L-Dopa 的 活 力達(dá)到8 U/mg（圖1）.

Fig.1 Full wavelength spectral analysis(a—f) and opticle images(a—f)of reaction mixture cata?lyzed by TYR at 0(a, a)，1(b, b)，2(c, c)，3(d,d)，4(e,e)and 5 min(f,f),respectively

2.2 反應(yīng)條件對(duì)S.cerevisiae BY4741/pYX212?TYR催化L-Dopa氧化合成DC的影響

催化劑濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值是影響S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR氧化L-Dopa的重要因素［36］，本文分別探究了這些因素的影響. 圖2結(jié)果表明，OD475值隨著細(xì)胞濃度的升高而增加，當(dāng)細(xì)胞濃度超過50 g/L后，OD475值基本保持不變，因此選擇細(xì)胞濃度為50 g/L. 溫度對(duì)氧化反應(yīng)效率的影響研究表明，S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR 在最適反應(yīng)溫度35 ℃時(shí)，OD475值達(dá)到最大值0.862. pH 值對(duì)氧化反應(yīng)效率的影響大，在最適反應(yīng)pH=6.0時(shí)，OD475最大值提高至3.087. 通過對(duì)以上3個(gè)因素的優(yōu)化，反應(yīng)效率提高了327%.

Fig.2 Optimization of the reaction conditions of oxidation reaction catalyzed by TYR（A）Effect of cell concentration；a.10 g/L；b.30 g/L；c.50 g/L；d.70 g/L；e.90 g/L；（B）effect of temperature；（C）effect of pH value.Reaction condition：10 mmol/L L-Dopa；（A）30 ℃，pH=4.0；（B）pH=4.0，50 g/L；（C）35 ℃，50 g/L

2.3 底物濃度對(duì)S.cerevisiae BY4741/pYX212?TYR催化L-Dopa氧化合成DC的影響

TYR催化分子氧與L-Dopa氧化生成DC是典型的雙底物反應(yīng)［37］，且TYR具有“自殺失活”特性，即TYR都會(huì)經(jīng)歷其生理底物L(fēng)-Dopa誘導(dǎo)的不可逆失活的過程［38，39］，因此底物濃度會(huì)對(duì)反應(yīng)效率產(chǎn)生影響. 圖3 結(jié)果表明，雖然隨著L-Dopa 濃度的增加，OD475值增高，但底物利用效率顯著下降. 較低的轉(zhuǎn)化率會(huì)導(dǎo)致體系中大量L-Dopa 殘余，不僅增加反應(yīng)成本，同時(shí)也不利于下游DHI 的分離純化. 綜合考慮DC 生成與L-Dopa 轉(zhuǎn)化率，確定3 mmol/L 為最佳底物濃度. 在此濃度下，OD475值達(dá)到2.181，L-Dopa的轉(zhuǎn)化率為84.93%，較初始濃度為10 mmol/L 時(shí)的轉(zhuǎn)化率提高209%.

分子氧是L-Dopa 氧化反應(yīng)的底物，厭氧條件會(huì)抑制TYR活性［40］，因此反應(yīng)體系中溶解氧的濃度會(huì)對(duì)氧化反應(yīng)效率產(chǎn)生影響. 研究發(fā)現(xiàn)，S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR催化L-Dopa氧化反應(yīng)前期溶解氧濃度急劇下降，1 min內(nèi)反應(yīng)體系溶解氧從11.7下降到2（圖4），維持一段時(shí)間后，緩慢回升. 通過對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行通氧處理，可使溶解氧濃度維持在較高水平，OD475生成速率提高141%. 在有氧條件下，L-Dopa氧化反應(yīng)產(chǎn)物DC在12 min時(shí)OD475值達(dá)到5.146，底物L(fēng)-Dopa轉(zhuǎn)化率提高到94.75%.

Fig.3 Optimization of the L?Dopa concentration of oxidation reaction catalyzed by TYRReaction conditions：35 ℃，pH=6.0，50 g/L S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR.

Fig.4 Optimization of the DO of oxidation reaction catalyzed by TYR（A）Effect of oxygen on dissolved oxygen；（B）effect of oxygen on OD475；（C）time course under oxygen conditions.Reaction conditions：35 ℃，pH=6.0，50 g/L S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR，3 mmol/L L-Dopa.

2.4 反應(yīng)條件對(duì)多巴色素DC化學(xué)還原生成DHI的影響

Fig.5 Optimization of the reaction conditions of chemical reduction（A）Effect of temperature；（B）effect of pH value.Reaction conditions：（A）pH=6.0；（B）20 ℃.

為了實(shí)現(xiàn)DHI的高濃度積累，在DC還原反應(yīng)過程中必須去除催化劑和氧對(duì)DHI氧化聚合的促進(jìn)作用. 實(shí)驗(yàn)中在完成TYR催化氧化步驟后，通過離心方式去除催化劑，同時(shí)通入N2氣保護(hù)消除DC還原反應(yīng)體系中的氧. 在此基礎(chǔ)上，分別考察了不同溫度和pH值對(duì)DC還原反應(yīng)的影響. 圖5結(jié)果表明，高溫雖然有利于OD475值的下降，但同時(shí)也對(duì)DHI 的聚合產(chǎn)生促進(jìn)作用，根據(jù)DHI 的積累濃度選擇20 ℃為反應(yīng)溫度；低pH 條件降低了氧化還原電位［41］，有效抑制了體系中的氧化作用，在pH=3.0 時(shí)，OD475轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值，同時(shí)DHI積累濃度也最大.

2.5 化學(xué)助劑對(duì)多巴色素DC化學(xué)還原生成DHI的影響

化學(xué)助劑能夠促進(jìn)DC向DHI轉(zhuǎn)變，主要包括水溶性有機(jī)溶劑（特別是醇類）及抗氧化劑［42，43］. 本研究考察了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇及不同濃度抗壞血酸鈉對(duì)DC化學(xué)還原生成DHI的影響. 化學(xué)還原反應(yīng)1 h后，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇處理，DHI產(chǎn)率從44.86%提高至75.3%（圖6）；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的抗壞血酸鈉處理可將DHI產(chǎn)率提高到79.4%. 通過疊加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%抗壞血酸鈉的協(xié)同作用，DHI產(chǎn)率進(jìn)一步提升至90.03%.

Fig.6 Optimization of reagent of chemical reductionReaction conditions：pH=3.0，20 ℃.（A）Effects of different v/v of ethanol on chemical reduction；（B）effects of different w/v of C6H7O6Na on chemical reduction；（C）the effect of combined additives on chemical reduction.（C）a. Control；b. 50%（volume fraction）Ethanol；c. 3%（mass fraction）C6H7O6Na；d. 50%（volume fraction）Ethanol+3%（mass fraction）C6H7O6Na.

2.6 反應(yīng)產(chǎn)物的LC/MS鑒定

利用LC/MS 對(duì)反應(yīng)體系中的DHI 及其聚合物進(jìn)行了解析［44］（圖7），m/z150 為單體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果；m/z297 為二聚體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果；m/z443 為三聚體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果；m/z589 為四聚體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果；m/z736 為五聚體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果；m/z883 為六聚體DHI 質(zhì)子化的結(jié)果.研究結(jié)果表明，雖然通過移除氧和催化劑等措施可以減緩DHI 氧化聚合，但DHI 在水相中依然會(huì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng). 在后續(xù)研究中可以通過加快反應(yīng)速率縮短反應(yīng)時(shí)間或添加防聚劑來防止DHI聚合.

Fig.7 Average electrospray mass spectrum of the DHI reaction after chemical reduction

3 結(jié)論

構(gòu)建了TYR 的異源表達(dá)菌株S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR. 分別建立了S. cerevisiaeBY4741/pYX212-TYR催化L-Dopa氧化合成DC步驟和DC化學(xué)還原合成DHI步驟，實(shí)現(xiàn)了DHI的生物-化學(xué)合成途徑. 通過優(yōu)化生物氧化步驟，3 mmol/LL-Dopa在12 min內(nèi)轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.75%；在去除生物催化劑和在氮?dú)獗Ｗo(hù)的基礎(chǔ)上，對(duì)DC化學(xué)還原進(jìn)行優(yōu)化，通過組合添加化學(xué)助劑，DHI產(chǎn)率提升至90.03%. 產(chǎn)物L(fēng)C/MS分析結(jié)果表明，反應(yīng)體系中存在著DHI可溶性低聚物.