光/還原雙重響應(yīng)水凝膠微球的制備及在細(xì)胞三維(3D)培養(yǎng)中的應(yīng)用

王學(xué)斌，薛 源，茆華女，項(xiàng)艷鑫，包春燕

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

隨著藥學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為研究熱點(diǎn)，其可為生物體外的細(xì)胞和組織的生理和病理研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)平臺(tái). 最初，研究者們主要通過(guò)在聚苯乙烯（TCPS）、玻璃及組織等類似物材料表面進(jìn)行二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng). 這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使人們能夠在體外研究細(xì)胞的生理和病理活動(dòng)［1～3］. 隨著研究的不斷深入，2D細(xì)胞培養(yǎng)的局限性也逐漸展現(xiàn)出來(lái). 一方面，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在2D培養(yǎng)生長(zhǎng)環(huán)境中，細(xì)胞的生理狀態(tài)和行為活動(dòng)相比于體內(nèi)三維（3D）生長(zhǎng)的細(xì)胞往往存在很大的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果經(jīng)常不一致［4～8］；另一方面，2D培養(yǎng)由于本身的空間限制，增殖效率低，已經(jīng)無(wú)法滿足當(dāng)今細(xì)胞治療和相關(guān)應(yīng)用研究的大劑量需求.

針對(duì)2D細(xì)胞培養(yǎng)存在的問(wèn)題和局限性，人們開(kāi)始尋求能高度擬合自然細(xì)胞微環(huán)境的3D支架材料進(jìn)行3D細(xì)胞的培養(yǎng)［9～12］. 其中，水凝膠由于其高含水量和可高度擬合細(xì)胞外基質(zhì)（ECMs）的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而成為3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的首選材料［13～16］. 特別是具有高比表面積的水凝膠微球載體，它可以通過(guò)表面修飾模擬3D自然微環(huán)境，是一種高效的適用于細(xì)胞大規(guī)模3D培養(yǎng)的支架材料［17～19］. 為了使培養(yǎng)的細(xì)胞最終實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞移植、組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，除了需要細(xì)胞能在仿生3D微環(huán)境下培養(yǎng)外，還需要細(xì)胞與載體能進(jìn)行可控分離并實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)捕獲. 目前，大部分3D微載體通過(guò)酶消化（胰蛋白酶）的方法分離和捕獲細(xì)胞，但這種方法會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，從而影響捕獲細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用［20］. 為了克服這一缺點(diǎn)，人們開(kāi)始致力于開(kāi)發(fā)對(duì)環(huán)境變化敏感的刺激響應(yīng)水凝膠材料，利用外在溫和刺激調(diào)控細(xì)胞與載體的黏附和分離，從而實(shí)現(xiàn)3D細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)與捕獲. 如溫度敏感的聚（N-異丙基丙烯酰胺）（pNIPAAM）水凝膠已被證明可用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和無(wú)酶捕獲的載體［21，22］. 但這種方法對(duì)于一些溫度敏感的細(xì)胞并不友好，并不能普遍適用. Lee 等［23］利用pH 響應(yīng)的聚氨酯作為基質(zhì)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的無(wú)酶釋放，但是這種低pH（pH=6）的釋放條件也不能普適于所有細(xì)胞，存在細(xì)胞相容性差的潛在問(wèn)題.

與熱和pH響應(yīng)相比，光響應(yīng)刺激由于可以遠(yuǎn)程控制、允許時(shí)空可控并具有所需的生物相容性而更具吸引力. 因此，本文提出構(gòu)建一種光/還原雙重響應(yīng)的水凝膠微球載體用于細(xì)胞的3D大規(guī)模培養(yǎng)和無(wú)酶無(wú)損捕獲. 如Scheme 1所示，水凝膠微球主要由甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯（PEGMA，Mw=300）、光/還原雙重響應(yīng)功能單體（M1）和交聯(lián)劑聚乙二醇二丙烯酸酯（AAPEG-AA，Mw=2000）經(jīng)過(guò)W/O型微乳法聚合得到. 通過(guò)光照微球表面醛基的生成實(shí)現(xiàn)細(xì)胞黏附蛋白的固定，從而引導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的黏附、生長(zhǎng)和增殖. 通過(guò)加入還原劑谷胱甘肽（GSH）溫和剪切二硫鍵，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在微球表面的無(wú)損釋放，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模獲取. 該雙重響應(yīng)的微凝膠體系為3D細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和無(wú)酶獲取細(xì)胞提供了有效的方法，也為構(gòu)建新型響應(yīng)型水凝膠并實(shí)現(xiàn)其在生物醫(yī)學(xué)和組織工程等方面的應(yīng)用提供了新思路.

Scheme 1 Schematic presentation of preparation of dual?stimuli responsive hydrogel microsphere(A), the mechanism of photoinduced reaction with protein(B)and the schematic diagram of cell adhesion and release(C)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）和谷胱甘肽（GSH），上海麥克林生化科技有限公司；司班80（Span-80）和石蠟油，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海公司；單體PEGMA，AA-PEG-AA 和HEMA 等有機(jī)試劑，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)有限公司（TCI）；異氰酸酯羅丹明B，上海阿拉丁生化科技有限公司；明膠（Gelatin）和牛血清蛋白（BSA），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），中國(guó)科學(xué)院上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)，其培養(yǎng)方式按照細(xì)胞庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，生物實(shí)驗(yàn)中所用到的細(xì)胞培養(yǎng)試劑均來(lái)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；細(xì)胞活死染色試劑（Calcein-AM/PI）和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8），艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（abcam）. 實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水；實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽緩沖液（PBS）均為0.01 mol/L無(wú)菌PBS（pH=7.2）.

600 MHz 型核磁共振波譜儀（NMR），德國(guó)Bruker 公司；XEVO G2 TOF 型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters 公司；Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀，全反射（ATR）模式，美國(guó)ThermoFisher 公司；S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司；Leica AF6000型激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Leica Microsystems 公司；UV-2550 型紫外-可見(jiàn)光（UV-Vis）分光光度計(jì)，日本Shimadzu 公司；MCO-15AC型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司.

1.2 光-還原雙重響應(yīng)功能單體的合成

參照文獻(xiàn)［24］方法合成M1，并對(duì)其進(jìn)行了核磁共振氫譜、碳譜與質(zhì)譜表征.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：7.75（s，1H），7.11（s，1H），6.61（s，1H），6.29（m，1H），6.20（m，1H），5.67（m，1H），5.53（s，2H），4.60（s，2H），3.99（s，3H），3.72（m，6H），3.64（m，10H），3.57（t，J=4.82 Hz，2H），3.42（t，J=4.74 Hz，2H），2.87（m，5H）.13C NMR（101 MHz，CDCl3），δ：167.71，165.18，156.18，154.21，146.56，139.39，132.01，129.48，125.81，111.40，111.12，72.79，70.28，70.21，70.20，70.02，69.63，68.49，62.80，60.67，56.81，38.40，38.17，37.55，37.39. MS（ESI），C26H40N4O12S2Na+（［M+H］+），m/z計(jì)算值（理論值）：687.1976（687.1983）.

1.3 水凝膠微球的制備

將90 mg（0.7 mmol）HEMA、90 mg（0.3 mmol）PEGMA單體、80 mg（0.2 mmol）AA-PEG-AA交聯(lián)劑以及20 mg（0.03 mmol）M1 加入到1 mL 乙腈/水（體積比為4/1）的混合溶劑中，振蕩混合均勻后，通入N2氣15 min 以除去其中的O2氣；加入濃度為2 mol/L 的APS 水溶液和2 mol/L 的TEMED 水溶液各50 μL，快速渦旋至混合均勻；將混合后的溶液裝入注射器中并勻速滴加至含有1%（體積分?jǐn)?shù)）Span-80的石蠟油（5 mL）中，在300 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌30 min后，將石蠟油乳液倒入100 mL去離子水中并用不同尺寸篩網(wǎng)過(guò)濾，以獲得粒徑在150～250 μm的水凝膠微球. 將篩選后的水凝膠微球在乙腈/水（體積比為1∶1）的混合溶劑中透析至溶液中檢測(cè)不到M1分子的紫外吸收后，將水凝膠微球于PBS中平衡24 h，然后浸入到含10%雙抗（Penicillin/Streptomycin）的PBS溶液中室溫靜置2 h；將水凝膠微球浸泡在含10%FBS和1%P/S的DMEM無(wú)菌培養(yǎng)基中，并于4 ℃下保存?zhèn)溆?，所得雙重響應(yīng)水凝膠微球命名為DRG.

采用相同的方法，在制備過(guò)程中不加入M1，制備不含功能分子M1的水凝膠微球，命名為NRG.

1.4 水凝膠微球表面蛋白的固定

1.4.1 熒光染料標(biāo)記牛血清蛋白（Rho-BSA）的制備 將100 mg（1.5×10-3mmol）BSA 溶于10 mL PBS（pH=7.2，0.01 mol/L）中，于4 ℃攪拌并用氬氣保護(hù)；將7.2 mg（0.013 mmol）異氰酸酯羅丹明B 溶于1 mL DMSO 中并緩慢滴加到上述BSA體系中，于4 ℃攪拌反應(yīng)12 h；將所得混合溶液轉(zhuǎn)移到截留分子量為10000的透析袋中，在水中透析3 d；通過(guò)冷凍干燥得到羅丹明B標(biāo)記的牛血清蛋白（Rho-BSA）.

采用相同的方法，用羅丹明標(biāo)記明膠，制得Rho-gelatin.

1.4.2 DRG表面蛋白的固定 靜置DRG水凝膠微球使其沉降到離心管底部，輕輕吸出上層培養(yǎng)基，加入1 mL Rho-BSA 或Rho-gelatin 溶液（0.5 mg/mL）. 輕輕搖晃使水凝膠微球分散在溶液中并光照2 min（365 nm，10 mW/cm2），靜置3 h后將溶液吸出并加入2 mL異丙醇/去離子水（體積比為1∶4）混合溶劑，放入搖床振蕩以清洗表面物理結(jié)合的蛋白，每小時(shí)更換一次溶液. 清洗3次后用PBS溶液清洗3次，得到的微球儲(chǔ)存在4 ℃的PBS中.

1.5 水凝膠微球表面細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)

水凝膠微球在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前均進(jìn)行滅菌處理并用DMEM培養(yǎng)基平衡72 h.

1.5.1 水凝膠微球的毒性表征 通過(guò)CCK-8法評(píng)價(jià)水凝膠微球?qū)UVEC細(xì)胞的毒性. 按照實(shí)驗(yàn)分組在24孔抗黏附孔板中加入上述制備的500 μL水凝膠微球和1 mL HUVEC 細(xì)胞（5×103Cell）. 在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1，3 和5 d 后，移除培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8 的培養(yǎng)基溶液（體積比為1∶10），培養(yǎng)2 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值（OD值）. 以DMEM培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)下式計(jì)算細(xì)胞與水凝膠微球共培養(yǎng)不同天數(shù)后的存活率（Cell viability，%）：

式中，Aexp和Acontrol分別為細(xì)胞在含有水凝膠微球和純培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間的吸光度值. 實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行6組，取平均值.

1.5.2 水凝膠微球表面的細(xì)胞黏附行為 將平衡后的無(wú)菌水凝膠微球用1 mL DMEM 培養(yǎng)基分散，使微球濃度大約在20 mg/mL左右，加入到24孔抗黏附孔板中后，加入HUVEC細(xì)胞（2×104Cell/孔）. 輕拍孔板使細(xì)胞均勻分散在水凝膠微球空隙中，隨后，將孔板放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞黏附培養(yǎng). 培養(yǎng)期間每隔6 h用滴管輕輕吹打水凝膠微球，使細(xì)胞均勻生長(zhǎng). 培養(yǎng)增殖不同時(shí)間后，用PBS洗滌培養(yǎng)有細(xì)胞的水凝膠微球，并用Calcein-AM/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞在水凝膠微球表面的黏附生長(zhǎng)情況. 同時(shí)，用CCK-8法測(cè)定OD值來(lái)定量分析細(xì)胞在水凝膠微球表面培養(yǎng)1，3和5 d后的增殖行為.

1.6 水凝膠微球表面細(xì)胞的釋放

1.6.1 GSH 培養(yǎng)基的配制 用不含血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)基配制60 mg/mL 的GSH 溶液，加入10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后待用.

1.6.2 水凝膠微球表面細(xì)胞的釋放 將500 μL 黏附有細(xì)胞的微球用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗后加入1 mL GSH 培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)2 h；通過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器分離水凝膠微球，細(xì)胞通過(guò)離心分離（1000 r/min，5 min）后用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算獲取的細(xì)胞數(shù)量；將部分捕獲的細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，并用CCK-8試劑定量分析捕獲細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠微球的制備與表面光照下蛋白的固定

為了實(shí)現(xiàn)更為有效的細(xì)胞黏附和釋放，水凝膠微球的組分都選取生物相容性好和具有一定抗黏附性能的單體，包括HEMA，PEGMA，AA-PEG-AA 和PEG 功能化修飾的M1. 利用APS/TEMED 氧化還原引發(fā)聚合并采用W/O型微乳法得到水凝膠微球. 為了實(shí)現(xiàn)微球的光刺激響應(yīng)性，M1單體中引入了鄰硝基芐酯光響應(yīng)基團(tuán)，如Scheme 1所示，該基團(tuán)可在365 nm紫外光照射下發(fā)生剪切反應(yīng)，解離一端的PEG分子，自身生成一個(gè)可與氨基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的活性醛基［24］，從而使微球表面實(shí)現(xiàn)黏附蛋白的固定并促進(jìn)細(xì)胞的黏附生長(zhǎng). 為了實(shí)現(xiàn)還原響應(yīng)性，在M1單體中引入還原響應(yīng)的二硫鍵，該二硫鍵可在溫和還原劑GSH的作用下發(fā)生鍵的斷裂，從而通過(guò)在微球表面解離黏附蛋白實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的釋放.

由圖1可見(jiàn)，與不含有M1的水凝膠微球NRG相比，DRG的紅外吸收光譜在1520 cm-1處出現(xiàn)硝基（—NO2）的反伸縮振動(dòng)峰［25］，說(shuō)明通過(guò)APS/TEMED 引發(fā)的自由基聚合，M1 被成功地引入到水凝膠微球中. 經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，凍干的水凝膠微球大小均勻，直徑約為200 μm. 進(jìn)一步放大局部形貌后能夠觀察到水凝膠微球的多孔結(jié)構(gòu)［圖2（A，B）］. 這說(shuō)明通過(guò)W/O型微乳法，水凝膠單體由于水-油兩相的分相以及快速的攪拌可以形成尺寸均勻的乳液，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)原位引發(fā)聚合得到水凝膠微球載體. 為了證明蛋白能夠通過(guò)光照成功地固定于水凝膠微球表面，首先以羅丹明修飾的牛血清蛋白（Rho-BSA）為模型進(jìn)行研究. 由共聚焦顯微鏡照片［圖2（C，D）］可見(jiàn)，通過(guò)365 nm（10 mW/cm2）光源照射水凝膠微球溶液2 min 并在Rho-BSA 溶液（0.5 mg/mL）中靜置3 h，清洗后微球的表面出現(xiàn)明顯的Rho-BSA的熒光包裹層，表明水凝膠微球通過(guò)功能組分M1光生醛基與BSA 胺基偶聯(lián)將Rho-BSA 共價(jià)固定于微球表面.這為后續(xù)進(jìn)行黏附蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ).

Fig.1 FTIR?ATR spectra of M1,hydrogel microspheres DRG and NRG

Fig.2 SEM images of xerogel microspheres by W/O emulsion method(A，B) and confocal microscope images of Rho?BSA immobilized hydrogel microspheres(C,D)

2.2 細(xì)胞在水凝膠微球表面的黏附生長(zhǎng)

作為細(xì)胞培養(yǎng)的載體，細(xì)胞相容性對(duì)于水凝膠微球至關(guān)重要. 因此，在考察細(xì)胞能否在水凝膠微球表面進(jìn)行黏附生長(zhǎng)之前，對(duì)水凝膠微球的細(xì)胞毒性進(jìn)行了詳細(xì)的研究. 為了實(shí)現(xiàn)定量比較，利用CCK-8法［26］對(duì)水凝膠微球進(jìn)行了細(xì)胞共培養(yǎng)和毒性測(cè)試. 選取HUVEC作為細(xì)胞模型. 由圖3可見(jiàn)，細(xì)胞和水凝膠微球共培養(yǎng)1，3 和5 d 后的細(xì)胞存活率均接近甚至超過(guò)100%，證明制備的水凝膠微球具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性.

Fig.3 HUVEC cell viability of hydrogel microsphere after coculturing for 1,3 and 5 d

為了實(shí)現(xiàn)水凝膠表面細(xì)胞的黏附，選取對(duì)細(xì)胞具有黏附促進(jìn)作用的明膠（Gelatin）作為黏附蛋白，通過(guò)鄰硝基芐酯光照偶聯(lián)反應(yīng)共價(jià)固定到水凝膠微球的表面. 為了實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程的可視化，同樣在Gelatin上標(biāo)記了羅丹明熒光染料（Rho-gelatin）. 經(jīng)過(guò)殺菌處理、蛋白固定和清洗后，將微球分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中并等量加入抗黏附孔板中，然后分別加入同等數(shù)量的HUVEC細(xì)胞使其黏附到微球表面進(jìn)行生長(zhǎng). 由圖4（A）～（C）可見(jiàn)，培養(yǎng)1 d后，通過(guò)共聚焦顯微鏡的不同通道觀察，可以明確看到HUVEC細(xì)胞在Rho-gelatin固定的微球表面進(jìn)行了黏附，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的細(xì)胞活死染通道呈現(xiàn)綠色，幾乎沒(méi)看到死細(xì)胞的存在，說(shuō)明光生醛基可以穩(wěn)定地固定黏附蛋白并黏附細(xì)胞，所有操作過(guò)程溫和，細(xì)胞相容性好. CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果［圖4（D）］表明隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量一直保持增加，說(shuō)明細(xì)胞在水凝膠微球表面不僅可以正常黏附，而且可以長(zhǎng)時(shí)間保持足夠的活性，實(shí)現(xiàn)增殖. 為了更好地觀察細(xì)胞在3D水凝膠表面的生長(zhǎng)情況，利用三維共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞在水凝膠微球表面的分布和生長(zhǎng)狀態(tài). 由圖5可見(jiàn)，共培養(yǎng)3 d后，更多的細(xì)胞在水凝膠微球表面黏附生長(zhǎng)，并且細(xì)胞鋪展呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀態(tài). 這些結(jié)果說(shuō)明通過(guò)簡(jiǎn)單的光照和蛋白的固定就可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在3D水凝膠微球載體表面黏附和增殖.

Fig.4 Confocal images of hydrogel microspheres with HUVEC cells adhesion(A—C) and cell proliferation of HUVEC on the Rho?gelatin immobilized microsphers from 1 d to 5 d(D)(A)—(C)The images from fluorescence fields[(A)λex=488 nm;(B)λex=561 nm]and the bright field,respectively.

Fig.5 3D Confocal images of HUVEC adhesion on the surface of hydrogel microspheres after coculturing for 3D(A)From top to bottom are the Z-axis overlayed images of fluorescent field(λex=488 nm)and bright field;(B)from left to right are section images of fluorescent field(λex=488 nm)and bright field in Z-axis direction;(C)from top to bottom are the images of fluorescent field(λex=488 nm)and bright field.

2.3 水凝膠微球表面細(xì)胞的釋放

Fig.6 Time?course of cell detachment on hydrogel microspheres upon GSH stimuli with different timeTime/min:(A)0;(B)30;(C)60;(D)90.

細(xì)胞的無(wú)創(chuàng)采集是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療的前提. 在常規(guī)的細(xì)胞分離過(guò)程中一般會(huì)用胰酶來(lái)處理細(xì)胞，但是長(zhǎng)時(shí)間的胰酶處理往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞一些功能的喪失. 因此，細(xì)胞的無(wú)酶釋放備受青睞. 基于M1中二硫鍵的還原響應(yīng)性，我們期望能通過(guò)加入GSH實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無(wú)酶釋放. 當(dāng)細(xì)胞在水凝膠微球表面黏附增殖到一定程度后（3D培養(yǎng)5 d），加入含GSH的培養(yǎng)基對(duì)水凝膠微球進(jìn)行還原處理. 通過(guò)簡(jiǎn)單的倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著GSH孵育時(shí)間的增長(zhǎng)，水凝膠微球表面的細(xì)胞逐漸脫離，并在約90 min實(shí)現(xiàn)完全釋放（圖6 和圖7）. 為了驗(yàn)證釋放過(guò)程的細(xì)胞相容性，將釋放后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，并利用CCK-8評(píng)估了分離后的細(xì)胞活性. 由CCK-8定量細(xì)胞活性圖（圖8）可以看出，分離后的細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)正常的增殖. 這充分說(shuō)明水凝膠微球除了可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的溫和黏附和3D培養(yǎng)外，還可以通過(guò)外加溫和還原劑實(shí)現(xiàn)高效無(wú)酶釋放. 與利用溫敏性實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫附的聚（N-異丙基丙烯酰胺）聚合物材料相比［27］，細(xì)胞在從材料表面脫附的過(guò)程中始終處于37 ℃培養(yǎng)環(huán)境中，避免了溫度變化對(duì)細(xì)胞的潛在損傷，因而在細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域有著更大的實(shí)用潛力.

Fig.7 Time?course of the detachment percentage of adhesive cells on hydrogel microspheres upon GSH stimuliThe initial percentage of adhesive cells was defined as 100%,three independent samples were explored.

Fig.8 Proliferation analysis for the detached cells from hydrogel microspheres

3 結(jié)論

制備了一種光和還原雙重響應(yīng)的子顯微水凝膠微球，并將其用作3D細(xì)胞培養(yǎng)載體從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的黏附、增殖和無(wú)損釋放. 紅外光譜和掃描電子顯微鏡結(jié)果證明了水凝膠微球的成功構(gòu)建，共聚焦顯微鏡觀察證明通過(guò)光照可以實(shí)現(xiàn)蛋白在水凝膠微球表面的共價(jià)固定，從而通過(guò)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞在水凝膠微球表面的黏附. 良好的材料生物相容性和溫和的操作過(guò)程能夠保障黏附后的HUVEC細(xì)胞在微球表面正常鋪展與增殖. 顯微鏡實(shí)時(shí)追蹤觀測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)加入GSH還原劑，水凝膠微球表面黏附的細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)無(wú)酶釋放，并且釋放后的細(xì)胞保持活性. 該水凝膠微球通用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，顯示了在3D大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞方面的應(yīng)用潛力.