锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)

冀 紅，楊 旭

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

注射用亞錫亞甲基二膦酸鹽無(wú)菌粉末與99Mo-99mTc發(fā)生器配套使用，制備锝[99mTc]亞甲基二膦酸鹽注射液(99mTc-MDP)。99mTc-MDP是目前公認(rèn)的較理想骨顯像劑，通過(guò)化學(xué)吸附與骨骼無(wú)機(jī)成分中的羥基磷灰石結(jié)晶表面結(jié)合，在骨骼內(nèi)沉積的多少受局部血流量和骨骼無(wú)機(jī)鹽代謝及成骨活血程度等因素的影響[1-3]。因此，當(dāng)某些骨骼部位發(fā)生病理性改變時(shí)，如炎癥、腫瘤、骨折等，均可導(dǎo)致血供、代謝的變化，于相應(yīng)部位呈現(xiàn)影像異常，從而對(duì)各種骨骼疾患提供診斷和定位依據(jù)。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(BET)是利用鱟試劑檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判定供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，已十分成熟。2020版《中國(guó)藥典》二部對(duì)99mTc-MDP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出了明確規(guī)定，其中細(xì)菌內(nèi)毒素限值<15 EU/mL[4-6]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法包括凝膠法和光度法。凝膠法通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)進(jìn)行限度檢測(cè)或半定量檢測(cè)內(nèi)毒素，通過(guò)凝膠的堅(jiān)實(shí)程度判斷檢測(cè)結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單、容易掌握的優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果為定性、反應(yīng)過(guò)程不可視、缺乏數(shù)據(jù)完整性。光度法是定量分析方法，光度測(cè)定法分為濁度法與顯色法。濁度法分為動(dòng)態(tài)濁度法與終點(diǎn)濁度法；顯色法分為動(dòng)態(tài)顯色法與終點(diǎn)顯色法。終點(diǎn)顯色法依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出顯色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的吸光度或透光度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測(cè)值所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測(cè)值增加速度的方法。其原理是依據(jù)鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)，使用動(dòng)態(tài)光度儀，利用反應(yīng)時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試品的內(nèi)毒素含量。其優(yōu)點(diǎn)為檢驗(yàn)范圍寬、靈敏度高、檢驗(yàn)結(jié)果直觀準(zhǔn)確，定量的檢測(cè)結(jié)果可用于產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量的趨勢(shì)分析，衡量產(chǎn)品的質(zhì)量水平。凝膠法實(shí)驗(yàn)因操作簡(jiǎn)單易于推廣，在我國(guó)使用比較普遍[7-8]。

目前，隨著對(duì)藥品質(zhì)量的要求越來(lái)越高，對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求也在不斷提高[9]。放射性藥品檢測(cè)有其特殊性，既要防止污染又要及時(shí)準(zhǔn)確完成檢測(cè)工作。準(zhǔn)確分析內(nèi)毒素含量，不僅可以評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，還可以分析產(chǎn)品的質(zhì)量趨勢(shì)，起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用[10-12]。同時(shí)，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所需的鱟試劑為海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶胞的冷凍干燥品。凝膠法不同靈敏度的鱟試劑裝樣量一般為0.1 mg，加樣量是0.1 mL；光度動(dòng)態(tài)法采用微量技術(shù)，加樣量是25 μL。因此，從保護(hù)鱟資源理念出發(fā)，在考量市場(chǎng)鱟試劑供應(yīng)和使用量的同時(shí)，有必要建立準(zhǔn)確、可靠的內(nèi)毒素含量分析方法。本文對(duì)樣品溶解條件、干擾實(shí)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行研究，在相同條件下采用動(dòng)態(tài)顯色法和凝膠法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立99mTc-MDP光度動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)定內(nèi)毒素含量的分析方法。

1 主要儀器與材料

光度測(cè)定儀：FC/ET型酶標(biāo)分析儀，芬蘭Thermo(賽默飛)；試管恒溫儀：TAL-400，湛江安度斯生物有限公司。

動(dòng)態(tài)顯色法(KCA)鱟試劑：規(guī)格0.01～10 EU/mL，0.35 mL/支，批號(hào)2004070；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：0.02～2.0 EU/mL，批號(hào)1907180；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BET)用水：5 mL/支，內(nèi)毒素<0.003 EU/mL,批號(hào)2103120；凝膠法鱟試劑：規(guī)格0.1 mL/支，靈敏度0.5 EU/mL，批號(hào)2102192；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查微孔反應(yīng)板：批號(hào)191018-594，細(xì)菌內(nèi)毒素含量<0.005 EU/mL，無(wú)熱原空安瓿，移液器，無(wú)熱原吸頭。以上均為湛江安度斯生物科技有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)態(tài)顯色法光度測(cè)定在光度測(cè)定儀器中進(jìn)行，溫度為(37± 1) ℃，反應(yīng)時(shí)間60 min以保證顯色實(shí)驗(yàn)的有效性，預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)以及供試品的干擾實(shí)驗(yàn)，確定99mTc-MDP內(nèi)毒素光度法的檢測(cè)方法；采用凝膠法和光度法檢驗(yàn)同批號(hào)的99mTc-MDP，比較二者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；取不同活度的供試品進(jìn)行光度法檢測(cè)，研究99mTc-MDP放射性對(duì)光度動(dòng)態(tài)顯色法的影響。

2.1 99mTc-MDP制備

在無(wú)菌操作條件下，依高锝[99mTc]酸鈉注射液的放射性濃度，取4 mL注入注射用亞細(xì)亞甲基二膦酸鹽瓶中，充分振搖，使凍干物溶解，靜止5 min，即得。

2.2 99mTc-MDP最大有效稀釋倍數(shù)

供試品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD根據(jù)公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

MVD=CL/λ

(1)

式中：λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度，0.02 EU/mL；C為供試品溶液濃度，按1 mL/mL；L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，《中國(guó)藥典》規(guī)定99mTc-MDP細(xì)菌內(nèi)毒素限值15 EU/mL。根據(jù)公式(1)計(jì)算出MVD=750倍。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn)(動(dòng)態(tài)顯色法)

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或?qū)嶒?yàn)條件有任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線包括梯度不大于10倍的至少三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度，每一濃度內(nèi)毒素溶液(C溶液)至少平行3孔，陰性對(duì)照平行2孔。

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)品制備 光度測(cè)定法專用工作標(biāo)準(zhǔn)品以0.46、0.73、0.75 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，旋渦混合60 s，制備2.0、0.2、0.02 EU/mL細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按使用批次標(biāo)準(zhǔn)品要求進(jìn)行復(fù)溶，附分析證書CoA的指示加水復(fù)溶安瓿內(nèi)白色凍干粉。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn) 將鱟試劑用0.35 mL BET水溶解，輕輕搖勻，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。然后向微孔板里加入25 μL鱟試劑，陰性對(duì)照溶液(D溶液)再加入25 μL BET水，其他微孔加入25 μL內(nèi)毒素溶液，具體按照表1標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)目布板方式加樣。最后，設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)和反應(yīng)項(xiàng)目。把反應(yīng)板放置儀器中，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)60 min。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)目布板

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證在某一濃度下的供試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有沒(méi)有干擾，從而確定檢驗(yàn)供試品的制備方法(檢測(cè)濃度或稀釋倍數(shù))。

根據(jù)《中國(guó)藥典》的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置4個(gè)反應(yīng)項(xiàng)目，每種溶液2個(gè)平行。供試品溶液(A溶液)：用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將99mTc-MDP注射液稀釋為30倍、60倍、90倍的溶液。供試品溶液(B溶液)：用A溶液0.73 mL復(fù)溶標(biāo)示為0.2 EU/mL的工作標(biāo)準(zhǔn)品，得到99mTc-MDP注射液稀釋30倍、60倍、90倍的供試品溶液加入已知內(nèi)毒素濃度0.2 EU/mL。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(C溶液)：方法同2.3.1節(jié)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)椎溶液，即2.0、0.2、0.02 EU/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。陰性對(duì)照(D溶液)：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。按項(xiàng)目布板在微孔板中先加25 μL以上溶液(表2)，順序?yàn)殛幮浴?biāo)準(zhǔn)曲線、供試品溶液、供試品陽(yáng)性溶液；然后加入25 μL鱟試劑。加樣完畢后，反應(yīng)板放置儀器中，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)60 min。供試品當(dāng)日檢驗(yàn)后，將其放置24 h，即經(jīng)過(guò)4個(gè)半衰期后，再檢測(cè)內(nèi)毒素含量，對(duì)比兩次的檢驗(yàn)結(jié)果。

表2 干擾實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目布板

2.5 動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)99mTc-MDP

根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇無(wú)干擾的供試品濃度進(jìn)行BET檢查。各反應(yīng)濃度的制備反應(yīng)項(xiàng)目設(shè)置與干擾實(shí)驗(yàn)相同。選擇3批99mTc-MDP不同活度的供試品，進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯色法定量檢測(cè)。采用凝膠法檢驗(yàn)以上3批產(chǎn)品，比較二種檢驗(yàn)方法的結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性實(shí)驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程示于圖1。圖1數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照的吸光度反應(yīng)時(shí)間(TNC)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)-1.000的絕對(duì)值大于0.980。即標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：2.0～0.02 EU/mL，TNC>Tλ，|r|≥0.980，CV<10%(參考值，CV=標(biāo)椎偏差SD/平均值Mean*100%)，標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

3.2 干擾實(shí)驗(yàn)

4批99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)用光度動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)內(nèi)毒素含量的結(jié)果與放置24 h后內(nèi)毒素含量的檢測(cè)結(jié)果列于表3。表3中四組實(shí)驗(yàn)符合以下三個(gè)條件：(1) 系列溶液C的結(jié)果滿足“標(biāo)椎曲線的可靠性實(shí)驗(yàn)”中的要求；(2) 回收率R滿足：50%≤R≤200%；R=(CS-CT)/λm*100% ，CT供試品內(nèi)毒素含量，CS含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品內(nèi)毒素含量，λm為標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)濃度0.2 EU/mL；(3) 陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間λ大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間。

表3 不同批次99mTc-MDP在不同檢測(cè)濃度的回收率

3.3 確定有效稀釋倍數(shù)

99mTc-MDP供試品(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)稀釋30倍(S30)、60倍(S60)、90倍(S90)回收率趨勢(shì)比較示于圖2。均在最大有效稀釋倍數(shù)750內(nèi)，對(duì)內(nèi)毒素檢查光度測(cè)定動(dòng)態(tài)顯色法，無(wú)干擾。確定99mTc-MDP細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可以采用光度動(dòng)態(tài)顯色法。

圖2 不同批次不同稀釋倍數(shù)供試品回收率的比較

依據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)的回收率，四組S30回收率分別是103.30%、96.85%、108.53%、92.57%，回收率R滿足：50%≤R≤200%，對(duì)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有抑制和增強(qiáng)，即無(wú)干擾；符合《中國(guó)藥典》規(guī)定：取本品適量，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水至少稀釋30倍后，依法檢查。供試品30倍的稀釋，步驟少，縮短實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，同時(shí)不影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。所以，通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)，選定光度動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))檢測(cè)99mTc-MDP的內(nèi)毒素含量，并且選擇供試品原液稀釋30倍作為供試品溶液的日常檢測(cè)。

3.4 光度動(dòng)態(tài)顯色法

四批次99mTc-MDP(20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)光度動(dòng)態(tài)法檢測(cè)結(jié)果，稀釋30 倍內(nèi)毒素含量趨勢(shì)示于圖3。供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于《中國(guó)藥典》規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判定供試品符合規(guī)定。供試品99mTc-MDP (20210817-1-1、20210817-1-2、20210818-1-1、20210818-1-2)內(nèi)毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)均<0.600 EU/mL，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

圖3 不同批次99mTc-MDP稀釋30倍后內(nèi)毒素的含量

3.5 99mTc-MDP不同活度的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢查

選取3批99mTc-MDP供試品，批號(hào)為20211206-1-2、20211207-1-1、20211207-1-2初始活度分別為6.48、4.79、3.40 mCi，放置24、48、72 h。3批99mTc-MDP稀釋30倍后的供試品溶液用光度動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)內(nèi)毒素含量，檢測(cè)結(jié)果列于表4。

表4 3批次不同活度99mTc-MDP在不同衰變時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果

3批99mTc-MDP不同活度的供試品，在0、24、48、72 h檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示回收率均在80%～140%之間，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定50%≤R≤200%；供試品內(nèi)毒素含量均<0.600 EU/mL，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的每1 mL含內(nèi)毒素含量<15 EU。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同活度的99mTc-MDP采用光度動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)定(定量檢測(cè))的細(xì)菌內(nèi)毒素含量沒(méi)有差異。放射性藥物99mTc-MDP對(duì)光度動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)定(定量檢測(cè))的細(xì)菌內(nèi)毒素含量無(wú)影響。

3批99mTc-MDP按《中國(guó)藥典》中的凝膠法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，檢查結(jié)果每1 mL含內(nèi)毒素的量<15 EU，與光度動(dòng)態(tài)顯色法一致。

本實(shí)驗(yàn)研究99mTc-MDP細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，對(duì)于其他放射性示蹤劑如锝[99mTc]甲氧異腈注射液(99mTc-MIBI)、锝[99mTc]焦磷酸鹽注射液(99mTc-PYP)、锝[99mTc]雙半胱氨酸注射液(99mTc-EC)、锝[99mTc]雙半乙酯注射液(99mTc-ECD)、锝[99mTc]噴替酸鹽注射液(99mTc-DTPA)、锝[99mTc]聚合白蛋白注射液(99mTc-MAA)、锝[99mTc]植酸鹽注射液(99mTc-Phy)、锝[99mTc]依替菲寧注射液(99mTc-EHIDA)可以借鑒此方法，進(jìn)行方法驗(yàn)證。每一個(gè)品種藥典有記載其標(biāo)準(zhǔn)及限值，在2020版《中國(guó)藥典》中記載九種锝標(biāo)記藥物，99mTc-MDP、99mTc-MIBI、99mTc-PYP、99mTc-EC、99mTc-DTPA、99mTc-MAA、99mTc-Phy、99mTc-EHIDA、99mTc-ECD，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查要求一致(方法和限值)。不同品種溶液成分不同，其中的某些成分會(huì)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法產(chǎn)生干擾作用，所以需要排除干擾，通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)，確定有效的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行光度法檢驗(yàn)。實(shí)際檢驗(yàn)中，光度法可以一次檢驗(yàn)多個(gè)供試品(一個(gè)微孔板可以最多檢22個(gè)供試品)。為了提高藥品質(zhì)量和用藥安全，依《中國(guó)藥典》的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)化藥品的質(zhì)量控制，緊跟國(guó)際先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。99mTc-MDP定量檢測(cè)方法對(duì)內(nèi)毒素含量?jī)?nèi)控指標(biāo)具有指導(dǎo)意義。通過(guò)建立99mTc-MDP的定量檢測(cè)方法，對(duì)其他放射性示蹤劑的細(xì)菌內(nèi)毒素光度法的檢測(cè)技術(shù)有指導(dǎo)及支持作用。建立準(zhǔn)確、可靠的99mTc-MDP內(nèi)毒素定量分析方法十分必要。

綜上所述，本工作建立的光度動(dòng)態(tài)顯色法鱟實(shí)驗(yàn)靈敏度高，排除干擾的能力強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)操作方便快捷，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。定量的檢測(cè)結(jié)果可用于產(chǎn)品內(nèi)毒素含量的趨勢(shì)分析，有利于產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)追蹤及在超過(guò)指標(biāo)并導(dǎo)致產(chǎn)品不合格前識(shí)別和糾正偏差。當(dāng)產(chǎn)品數(shù)據(jù)出現(xiàn)不穩(wěn)定，雖在檢驗(yàn)合格范圍內(nèi)，但也要追溯產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過(guò)程。光度動(dòng)態(tài)顯色法檢測(cè)的范圍比凝膠法寬泛，使得有干擾的樣品可以有更多的稀釋空間，當(dāng)部分凝膠法無(wú)法排除干擾的樣品時(shí)，可以選擇光度動(dòng)態(tài)法。操作也相對(duì)簡(jiǎn)單，尤其對(duì)于研究性的樣品，更具有優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

按照《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定,99mTc-MDP內(nèi)毒素含量應(yīng)<15 EU/mL。使用FC/ET型酶標(biāo)分析儀，選擇光度動(dòng)態(tài)顯色微量技術(shù)法定量檢測(cè)99mTc-MDP的內(nèi)毒素含量，快捷、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，符合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完整性的要求。放射性藥物99mTc-MDP對(duì)光度動(dòng)態(tài)顯色法測(cè)定的細(xì)菌內(nèi)毒素含量無(wú)影響。新建立的99mTc-MDP光度動(dòng)態(tài)顯色法可以定量檢測(cè)內(nèi)毒素含量，是一種準(zhǔn)確、可靠的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。