烘烤期煙葉霉?fàn)€病病原菌Rhizopus oryzae的生態(tài)學(xué)研究

朱自萍，何鵬飛，劉迎龍，趙正龍，吳毅歆，何鵬搏，蔡永占，MUNIR Shahzad，田陽陽，王軍偉，何月秋

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

0 引言

米根霉(Rhizopus oryzae)是一種絲狀真菌，主要產(chǎn)乳酸，長期以來用于生產(chǎn)酶制劑，有機酸和各種發(fā)酵食品[1]。它常見于土壤，腐植物體，也是熱帶果蔬采后主要病原菌之一，不僅引起果實腐爛，影響果實風(fēng)味，還能分泌對人體有毒害作用的麥角類生物堿，對果蔬貯藏具有極大的危害[2]。如引起馬鈴薯塊莖[3]、蘋果[4]、香蕉[5]的果實等軟腐病，輪葉黨參采后根腐病[6]，初烤煙葉的葉片和莖桿[7]發(fā)生腐爛，影響產(chǎn)品質(zhì)量。近年來，云南、四川、貴州、廣西、福建等國內(nèi)部分煙區(qū)烘烤期煙葉霉?fàn)€病頻發(fā)，已成為烘烤損失的主要原因[8-9]。雖有報道烘烤期煙葉霉?fàn)€病病原青霉屬(Pencillium)和曲霉屬(Aspergillus)真菌為優(yōu)勢種群[10]，但國內(nèi)不同煙區(qū)發(fā)現(xiàn)烘烤期煙葉霉?fàn)€病的主要病原菌是米根霉(Rhizopus oryzae)[11-12]。在烤煙房內(nèi)發(fā)病時，葉柄處首先出現(xiàn)水漬狀斑，變褐腐爛，病部縊縮軟化，隨后再由基部沿葉脈向葉片尖端延伸，表面著生大量白色菌絲，后期菌絲體變?yōu)榛液谏?，最終導(dǎo)致葉片大面積發(fā)霉腐爛[11]。然而，關(guān)于烘烤期煙葉霉?fàn)€病的研究報道并不多，病原菌米根霉在田間條件下生存場所、分布規(guī)律，及與烘烤過程中的病情關(guān)系仍不清楚。因此，本研究針對米根霉生態(tài)學(xué)開展調(diào)查和探索性試驗，以期為制訂烘烤期煙葉霉?fàn)€病的防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)條件及其他材料

米根霉Rhi-1(Rhizopus oryzae Rhi-1)由本實驗室保存。馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基用于米根霉的培養(yǎng)，加了10 mg/mL氨芐青霉素和10 mg/mL利福平的PSA用于從土壤中分離根霉菌。

‘云煙87’的葉柄由云南省煙草公司曲靖市公司提供，其莖桿采自玉溪市連年種植的煙區(qū)和第一次種植的煙區(qū)。作物根圍土樣采自云南省玉溪市和安寧市。

1.2 方法

1.2.1 煙草根圍根霉菌分離與致病性鑒定 從土壤樣本中分離根霉菌。在加入氨芐青霉素和利福平的PSA培養(yǎng)基中，以梯度稀釋法，分離根霉菌。在PSA板上純化1次后，接種到裝有50 mL液體PSA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，28℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)3～4天。無菌雙層紗布過濾，血球計數(shù)板測定其孢子液濃度，通過加無菌水將濃度調(diào)至1×105cfu/mL，備用。

用無菌刀具將煙草葉柄切成2.0 cm左右的塊狀組織，置于75%酒精浸泡1 min，無菌水漂洗3次，再用無菌吸水紙吸干表面殘余水分。將消毒后的葉柄移入底部鋪有濕潤無菌濾紙的9.0培養(yǎng)皿，向葉柄切口處滴加50 μL的1×105cfu/mL孢子懸浮液，驗證分離菌株的致病性。接種后，全部培養(yǎng)皿移入37℃恒溫培養(yǎng)箱保濕。2天后觀察葉柄發(fā)病情況，以米根霉Rhi-1和無菌水分別為正對照和負(fù)對照，每個處理含有30份煙草葉柄塊，重復(fù)3次。

1.2.2 根霉菌在田間煙草葉柄和莖桿中的分布 用消毒刀具將田間煙草葉柄自基部向尖部切成4段（各2 cm），分別命名為Fir、Sec、Thr及For，各處理30段，無菌鑷子夾取放入底部鋪有濕潤無菌濾紙的9.0培養(yǎng)皿內(nèi)，最后一同移入37℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。2天后觀察霉?fàn)€病發(fā)生情況并統(tǒng)計各段葉柄的發(fā)病數(shù)量，重復(fù)3次。

仿1.2.1操作將煙葉柄基部切成長度為2 cm的組織，分別按如下處理：(i)不消毒，直接在煙柄切口滴加50 μL米根霉Rhi-1孢子懸浮液；(ii)75%酒精表面消毒1 min，滅菌水清水3次后，不接種孢子懸浮液；(iii)75%酒精表面消毒1 min，滅菌水清水3次后，在煙柄切口處接種50 μL米根霉Rhi-1孢子懸浮液；(iv)煙柄不做任何處理。隨后37℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)。2天后觀察霉?fàn)€病發(fā)生情況并統(tǒng)計各段葉柄的發(fā)病數(shù)量。每個處理含30個煙草葉柄，重復(fù)3次。

取‘云煙87’成株期煙草莖桿35株，自葉柄處截成25小段，距根系最近處的莖節(jié)為第1段，依次排序至第25段；縱剖各節(jié)，用消毒刀挖取含有芽眼的部分莖節(jié)組織（0.5×1.0 cm，含皮層、木質(zhì)部及髓部），直接轉(zhuǎn)移到含有氨芐青霉素和利福平的PSA平板內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，觀察及統(tǒng)計莖節(jié)組織有無米根霉生長情況。

1.2.3 煙草霉?fàn)€病與葉柄含水量測定 仿1.2.1操作制備塊狀葉柄組織（約2 cm）并表面消毒，無菌吸水紙吸干葉柄組織表面殘留水分放入培養(yǎng)皿中，再用37℃烘箱分別烘烤1、2、3、4、5、6、7、8、9及10 h后，稱重(W1)，獲得不同含水量的葉柄組織。每個時間段30個煙柄為1重復(fù)，重復(fù)3次，共900個煙柄。隨后在葉柄組織切口中央接種50 μL米根霉Rhi-1的孢子懸浮液，保鮮膜封住培養(yǎng)皿上口，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2天后，觀察有無米根霉生長，統(tǒng)計發(fā)病情況后放入37℃烘箱烘烤直至恒重，再次稱重(W2)。2次葉柄逐個地分開稱重。將不同含水量分組，統(tǒng)計其與發(fā)病率的關(guān)系。發(fā)病率的計算見公式(1)，按公式(2)計算煙草葉柄含水量，探究含水量與霉?fàn)€病發(fā)病率之間的關(guān)聯(lián)性。

其中0.05為50 μL米根霉孢子懸液。

1.2.4 根霉菌在不同作物根圍土壤中的含量測定 土壤樣品采集。（1）分別從煙草連作煙田和新植煙田（首次種植）的健康和因黑脛病致死的煙草植株根圍采集土壤，及煙草連作毗鄰的種植有生姜或玉米的根圍處取土；（2）在煙草黑脛病發(fā)生嚴(yán)重田塊，分別從距離病死亡的煙株10、20、30、40 cm處；（3）在煙草后茬作物西葫蘆、玉米、苦蕎、花菜、豌豆、蠶豆、芋頭地塊，采集作物根圍土壤。其中在安寧市青龍鎮(zhèn)只采用首次植煙的根圍土（紅壤），包括煙草在內(nèi)作物根圍土均采自新平縣甸鄉(xiāng)朵舍宗村。各作物取3個同類型地塊，每塊地隨機5點取樣，構(gòu)成一個混合樣，1個重復(fù)。土壤采集后，密封袋封存，室溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

土壤中根霉菌含量測定。從密封袋中取出部分土壤樣品，自然風(fēng)干。隨后取5 g土樣加入裝有45 mL無菌水的250 mL三角瓶中，30℃，120 r/min振搖1 h，室溫靜置0.5 h，即為10-1土壤稀釋液。取5 mL上述稀釋液至另一裝入45 mL無菌水的三角瓶內(nèi)，充分振搖，即為10-2稀釋液。如此反復(fù)，制備出10倍梯度系列稀釋液。分別吸取10-1、10-2及10-3稀釋液100 μL轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素和利福平的PSA平板內(nèi)，均勻涂布，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～22 h，最后根據(jù)米根霉菌菌落數(shù)，測算出根霉菌在相應(yīng)土壤中的含量，各處理重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各處理數(shù)據(jù)的差異性，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根圍根霉菌對煙草葉柄的致病性

從煙草根圍土壤中分離到的根霉主要有米根霉(R.oryzae)和小孢根霉(R.microsporus)。兩者菌落最初白色，后變?yōu)榛液稚蚝诤稚?。菌絲匍匐，菌絲體發(fā)達(dá)，孢子囊黑色。前者菌落疏松，后者菌落稠密，作為2個種的鑒別性特征。挑取土壤中米根霉顯微觀察，它能產(chǎn)生典型球囊狀結(jié)構(gòu)，孢囊孢子無色圓球形，符合根霉菌的既有描述，也與Rhi-1形態(tài)高度相似（圖1A和B），分子鑒定它們亦屬米根霉。在接種的煙草葉柄組織塊上，所有葉柄周身密被白色發(fā)達(dá)氣生菌絲體，切口處尤盛，與對照Rhi-1菌株接種的病征相似（圖1C和D），證明從菌落形態(tài)上判斷煙草根圍土壤中的米根霉是正確的。

圖1 煙草根圍根霉與米根霉Rhi-1的形態(tài)及對煙草葉柄的致病性

2.2 米根霉在田間煙草葉柄和莖節(jié)處的分布規(guī)律

2.2.1 葉柄處 將切段的煙草葉柄塊狀組織置于保濕的培養(yǎng)皿中，直接放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天后檢查發(fā)病情況。自然發(fā)病越靠近莖桿的煙草葉柄發(fā)病越重：距離莖桿最近的第一段(Fir)塊狀葉柄長出根霉的有7.33個(a)，第二段（Sec）3.67個(ab)、第三段(Thr)2.00個(ab)以及距離葉柄基部最遠(yuǎn)的第四段(For)1.67個(b)（括號后的字母表示在P≤0.05水平下差異顯著性，下同），表明米根霉主要在近莖桿的葉柄組織中存活。

為探究米根霉是否來自莖桿，采用75%酒精消毒葉柄后做4個不同處理，結(jié)果（表1）表明，未處理的葉柄發(fā)病率為21.11%；酒精消毒不接米根霉的葉柄未發(fā)?。徊幌窘臃N米根霉的發(fā)病率達(dá)到67.76%；表面消毒后，接種根霉的葉柄發(fā)病數(shù)量最多，平均達(dá)28.33個，占94.44%，其中原因可能與同一環(huán)境內(nèi)的拮抗微生物在表面消毒階段被酒精大量殺滅以及葉柄細(xì)胞抗性相關(guān)酶被酒精鈍化而無法有效地抑制后續(xù)的根霉侵染有關(guān)。

表1 表面消毒和米根霉Rhi-1接種對葉柄霉?fàn)€病發(fā)生的影響

2.2.2 節(jié)間處 基于上述試驗結(jié)果，切取不同類型煙田煙株莖桿葉柄著生處，采用組織分離法研究米根霉在煙株莖桿中的分布。結(jié)果顯示連作煙田中煙桿葉柄著生處的米根霉含量均高于新植煙田，帶米根霉的莖節(jié)組織最高分離記錄來自連作田煙株的第14個葉柄著生組織，為18個（占51.43%），最少為0個（首種煙田煙株第25個葉柄著生組織），表明米根霉在連作煙區(qū)煙株莖桿中的菌量多于新植煙田。無論連作煙田還是新植煙田，米根霉多聚集在煙草莖桿中下部（第1～14節(jié)）葉柄著生處，高于上部莖節(jié)組織（圖2）。

圖2 攜帶根霉數(shù)量與煙草莖節(jié)序數(shù)之間的關(guān)系

2.3 煙草葉柄霉?fàn)€與葉柄組織含水分量的關(guān)系

在煙草葉柄不同含水量的條件下，接種米根霉Rhi-1菌株。結(jié)果表明（圖3），當(dāng)葉柄的含水量在80.00%～89.99%與90.00%～95.74%之間時，霉?fàn)€病發(fā)生較為嚴(yán)重，發(fā)病率分別為57.14%、50.33%，與50.00%～60.99%含水量的42.21%發(fā)病率沒有顯著差異；其中以70.00%～79.99%的處理組病害發(fā)生最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)68.20%，含水量為50.99%以下的各試驗組沒有顯著差異，但煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生率極顯著地下降，當(dāng)含水量低于39.99%時，煙草葉柄完全沒有發(fā)病。

圖3 葉柄含水量與霉?fàn)€病發(fā)病關(guān)系

2.4 根霉在不同類型作物根圍土中的分布規(guī)律

從連作煙田和新植煙田或其毗鄰田的煙草或其他作物植株根圍取土，稀釋分離米根霉菌的結(jié)果表明（圖4），同塊煙田里健康煙株根圍處米根霉含量明顯少于煙草病株，而顯著高于新植煙田的根圍土中的數(shù)量。因煙草黑脛病而死亡的煙草植株根圍土中米根霉含量最為豐富，達(dá)103CFU/g，高出同一田塊健康煙株2倍，這可能與植株因死亡而喪失抗病能力有關(guān)，也暗示田間煙草病死株是弱寄生根霉菌的良好培養(yǎng)基。種植玉米或生姜的田塊雖與煙田毗鄰，但其根圍處的根霉含量明顯少于煙田煙株，尤以生姜最為明顯。

圖4 田間不同作物根圍土中的根霉數(shù)量

2.5 米根霉與煙草黑脛病病株距離間的關(guān)系

在距離田間表現(xiàn)出典型黑脛病癥狀的煙株10、20、30、40 cm處采集地下20 cm上的土壤，稀釋分離米根霉。米根霉在土壤中分布不均勻，距離煙株越近的土壤含量越多。距離煙株10、20、30、40 cm，米根霉菌量分為433.33 CFU/g(a)、118.52 CFU/g(b)、74.07 CFU/g(b)、111.11 CFU/g(b)，其中距離煙株10 cm處土壤中的含量最高，分別為距煙株20、30、40 cm的3.7倍、5.9倍和3.9倍，但20、30、40 cm間米根霉菌數(shù)量差異未達(dá)顯著水平。

2.6 米根霉在煙田后茬作物根圍土中的數(shù)量

從煙草后茬作物玉米、花菜、豌豆、苦蕎、西葫蘆、芋頭、蠶豆的根圍土中分離米根霉菌的結(jié)果表明（表2），后茬作物對根圍土中米根霉菌有重要影響，其中西葫蘆根圍土內(nèi)的米根霉數(shù)量最高，達(dá)1466.67 CFU/g，與上述試驗中的煙草黑脛病煙株測定結(jié)果（圖4）相近，高于連作田和新植田煙草植株根圍土的米根霉數(shù)量。其次是花菜和苦蕎根圍米根霉菌量達(dá)1055.56 CFU/g和994.44 CFU/g。芋頭根圍(677.78CFU/g)土中的米根霉菌數(shù)量與煙草(662.22 CFU/g)的相當(dāng)，相反，種植玉米、豌豆或蠶豆，其根圍土內(nèi)的米根霉數(shù)量較少，尤以豌豆和蠶豆最為明顯，它們的根圍土中米根霉數(shù)量分別為244.44 CFU/g和33.33 CFU/g。

表2 煙草后茬作物根圍土壤中米根霉菌數(shù)量

3 討論

烘烤期間煙葉霉?fàn)€病是煙葉烘烤過程中一種嚴(yán)重的病害，關(guān)于其病原物有多種認(rèn)識[13]。據(jù)筆者的前期研究，米根霉是煙葉烘烤階段霉?fàn)€病發(fā)生的主要病原[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)米根霉分布在田間煙草葉柄、莖桿與葉片分枝交界處，從田間隨機采集的葉柄自然發(fā)病率為21.11%。值得注意的是，根霉菌在煙草葉柄、煙草莖節(jié)處以及根圍土壤中并非均勻分布，優(yōu)先棲生于靠近莖桿的葉柄、中下部莖節(jié)以及毗鄰主根的根圍土壤。根霉菌偏好在這些位置生活，可能與這些位置特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理生化特點有關(guān)。葉柄基部與莖桿形成一定角度的區(qū)域，水易于滯留，保持濕潤時間長于其他區(qū)域；同時，此部分也是光合作用產(chǎn)物、水和無機礦物質(zhì)運輸分流的重要樞紐，營養(yǎng)物質(zhì)豐富程度較高，這些特點吸引根霉菌定殖，病原菌易著生和萌發(fā)侵入。根系分泌物向外輸送存在滲透效能：越靠近根系，分泌物濃度越高，微生物種類及數(shù)量也越多。PRIKYL等[14]的研究指出，根系分泌物的數(shù)量與微生物存在密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)距離主根40 cm的土壤內(nèi)米根霉數(shù)量明顯低于距離主根10 cm的，表明該病原菌具有寄主營養(yǎng)依賴的特性。

根霉菌是一類弱寄生真菌，田間環(huán)境下難以看到此類真菌引起的病害。究其原因除了腐生性強外，還可能與其侵染活動容易受不良因子如拮抗微生物的影響有關(guān)，如未作表面消毒和做過消毒處理的葉柄，接種米根霉后，前者發(fā)生率(67.76%)顯著地較后者(94.44%)輕，這可能與消毒后清除了葉柄處的其他拮抗微生物的影響，或者酒精處理鈍化了抗性相關(guān)酶的活性有關(guān)。因此，在接種時，應(yīng)該考慮到表面消毒過程對接種結(jié)果的影響，適當(dāng)?shù)乜s短消毒時間。

本研究表明米根霉多聚集在煙草莖桿中下部葉柄，這與李生棟等[15]烤后煙葉霉?fàn)€病發(fā)病率和病情指數(shù)隨煙葉部位的升高而減小相符。根霉菌的弱寄生特性還可在寄主植物煙草成熟衰老（抗病性下降）的中下部莖節(jié)處以及患有煙草黑脛病的煙草植株根圍土壤含量最高，烤房中感染煙草黑脛病的葉片易感染煙葉霉?fàn)€病的現(xiàn)象中得到印證。連作煙田煙草植株根圍土內(nèi)根霉菌含量普遍高于新植煙田，可能與連作煙田內(nèi)煙草病株殘體較多有關(guān)。由此看來，及時清除田間的病株殘體，減少病原物的越冬、越夏場所對烘烤期煙葉霉?fàn)€病可能有所作用。同一地區(qū)相鄰生姜田和玉米地根圍土米根霉數(shù)量顯著低于煙草連作田，煙草采收后種植豆科作物豌豆和蠶豆可有效地抑制根霉菌在煙草根圍環(huán)境中的生存，相反種植西葫蘆、花椰菜、苦蕎則促進(jìn)根霉菌定殖。這可能與后期作物根系分泌物影響到煙株根圍微生物數(shù)量和種類，從而對煙草根圍米根霉數(shù)量造成影響有關(guān)，不同植物根系分泌物的主要成分不同，造成不同植物根系土壤周圍的微生物類群不同[16]。因此，改進(jìn)耕作制度和合理搭配作物可能對減輕烘烤期間煙葉霉?fàn)€病防治具有積極作用。在烤房中，煙草霉?fàn)€病至42℃時仍能發(fā)病，隨著烤房中溫度的升高，烘烤期間煙葉霉?fàn)€病的發(fā)病速度逐漸減慢至停止，但是霉?fàn)€病的病原菌孢子能在44.6℃萌發(fā)，菌絲體在低于70℃下仍能存活[11]，表明烤房中的濕度可能是煙草烘烤期煙葉霉?fàn)€病發(fā)病的限制因子。本研究通過預(yù)先設(shè)置不同含水量的煙葉柄，再接種病菌孢子懸浮液，證明煙葉含水量70.00%～95.74%時霉?fàn)€病發(fā)生嚴(yán)重，最適的濕度范圍在70.00%～79.99%之間，即米根霉發(fā)病的溫度范圍較廣，但在烘烤中后期病情停止發(fā)展的原因是由于煙葉含水量不足所引起?？痉績?nèi)煙葉變黃期溫度為32℃～42℃，定色期43℃～54℃，干筋階段65℃～68℃[17]。變黃期烤房內(nèi)的溫度達(dá)32℃～39℃，相對濕度達(dá)75%～85%時，有利于米根霉繁殖和侵染，是烘烤期間煙葉霉?fàn)€病的主要發(fā)生時期[18]，與本試驗結(jié)果基本相符。

本研究對引起烘烤期間煙草霉?fàn)€病的病原菌米根霉的部分生態(tài)學(xué)進(jìn)行了研究，明確了田間葉柄帶菌，且中下部葉柄帶菌量多于上部葉，煙草連作煙田根圍土中米根霉菌量大于新植煙田，蠶豆和豌豆根圍土中菌量低于西葫蘆、花椰菜根圍土中的菌量，這對煙草霉?fàn)€病防控措施前移將有指導(dǎo)意義。然而，土壤中的病菌如何進(jìn)入煙草植株？有待下一步深入研究。