基于蛋白質(zhì)組學(xué)的乳腺癌標(biāo)志物篩選及其應(yīng)用

鄧克瑜 趙莉 高琳 黃靜怡 趙盼 吳偉晴

1.深圳市人民醫(yī)院健康管理中心 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518020；2.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518020

乳腺癌（breast cancer，BCA）是目前造成全球女性死亡的第二大癌癥，自1990 年以來(lái)，在中國(guó)一些城市地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率的增長(zhǎng)速度約是全球發(fā)病率的2倍。至2008 年，中國(guó)有169 452 例浸潤(rùn)性乳腺癌病例和44 908 例相關(guān)死亡病例，占全球病例的12.2%和相關(guān)死亡病例的9.6%。腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的重要特征之一，表現(xiàn)為同一腫瘤內(nèi)存在不同基因型或表型的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度不同，是腫瘤治療的巨大挑戰(zhàn)。基因組的不穩(wěn)定是造成腫瘤異質(zhì)性的主要原因之一。目前乳腺癌治療的主要挑戰(zhàn)是由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性在治療策略的選擇上存在一定的問(wèn)題。生物標(biāo)志物是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標(biāo)，多用于疾病診斷、判斷疾病分期或評(píng)價(jià)新藥或新療法。盡管基因組學(xué)已經(jīng)用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)很長(zhǎng)一段時(shí)間，但是所發(fā)現(xiàn)基因功能的解釋需要在功能網(wǎng)絡(luò)的背景下借助蛋白質(zhì)組學(xué)的力量進(jìn)行。蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物可以提供蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)特性的關(guān)鍵信息，包括功能、轉(zhuǎn)譯后修飾、與其他生物分子的相互作用以及對(duì)環(huán)境因素的反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，與基因組數(shù)據(jù)比較，蛋白水平與基因組中基因的拷貝數(shù)變化之間具有低相關(guān)性，意味著許多基因組變異沒(méi)有或只有部分參與到功能蛋白質(zhì)的翻譯。

因此，本研究通過(guò)以質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)工作流及qRT–PCR 技術(shù)篩選與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的標(biāo)志物，有助于針對(duì)不同亞型患者，建立更有效的乳腺癌診斷手段、預(yù)測(cè)病因及干預(yù)治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 組織標(biāo)本 選取4 組（含癌組織和癌旁組織）乳腺癌患者的組織標(biāo)本，所有患者均為侵襲性導(dǎo)管乳腺癌患者，年齡34～70 歲。經(jīng)手術(shù)切除腫瘤組織，癌旁組織是距離腫瘤組織3～5cm。本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（醫(yī)學(xué)倫理審批號(hào)LL–KY–2020170），并與患者簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 試劑 蛋白提取以及蛋白定量的試劑均購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；色譜分級(jí)、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜分析柱購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；PCR 引物購(gòu)于廣東艾基生物公司；提取總RNA 試劑、qRT–PCR 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 組織蛋白的提取與肽段酶解 通過(guò)SDT[4%SDS，100mmol/L Tris/HCl pH7.6，0.1mol/L DTT]裂解法對(duì)組織中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，利用BCA 法對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行濃度測(cè)定。取適量的蛋白質(zhì)通過(guò)（filter aided proteome preparation，F(xiàn)ASP）方法對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行酶解，利用C18 Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入40μl 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，最后對(duì)肽段定量（A280）。

1.2.2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 每份樣品采用納升流速的HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 進(jìn)行分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以95%的A 液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100μm×2cm，nanoViper C18），經(jīng)過(guò)分析柱（Thermo scientific EASY column，10cm，ID75μm，3μm，C18–A2）分離，流速為300nl/min。樣品經(jīng)色譜分離后用Q–Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用版本號(hào)1.5.3.17 的MaxQuant 軟件進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。

1.2.4 qRT–PCR 檢測(cè) 將經(jīng)液氮速凍后的組織用研磨器磨碎后，利用TRIzol 試劑盒提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用無(wú)酶水將cDNA 稀釋20 倍備用。由廣州艾基生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成引物，用于qRT–PCR，引物序列如下。

按照qRT–PCR 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，條件為：95℃預(yù)變性10min，95 ℃ 35s，62 ℃ 35s，72 ℃ 5min，連續(xù)40 個(gè)循環(huán)，每組均設(shè)置4 個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，分析qRT–PCR 的擴(kuò)增及熔解曲線，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌表達(dá)差異標(biāo)志物的篩選

通過(guò)對(duì)4 組乳腺癌樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中差異表達(dá)上調(diào)的蛋白有263 個(gè)，下調(diào)的蛋白是36 個(gè)。設(shè)置差異倍數(shù)大于2 倍且<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共篩選出NANS、LCP1、ARF1、CCT3、VDAC1、NME1 等23 個(gè)癌組織中特異性表達(dá)的蛋白。且將相關(guān)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因與其癌旁進(jìn)行比較篩選出NANS、LCP1、ARF1、CCT3、VDAC1、NME1、HSP90AA1、RAN、YWHAZ 等在侵襲性乳腺癌癌組織中表達(dá)升高（<0.05）的23個(gè)基因，詳見(jiàn)圖1。為了更準(zhǔn)確地篩選乳腺癌特異性靶向治療的標(biāo)志物，集中在乳腺癌癌組織中蛋白表達(dá)上調(diào)。為了提高差異表達(dá)基因可信度，設(shè)置差異倍數(shù)大于2 倍且<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表2所示，共篩選出23 個(gè)癌組織中特異性表達(dá)的蛋白為YWHAZ、LCP1、CCT3、ERH、STIP1、ARF1、VDAC1、NME1、NANS、HSP90AA1、RAN、CKAP4、PRDX1、TUBB、SNRPD3、HSPA8、NME2、H2AFY、HSPE1、HDGF、SRP9、SFN、PDIA3。

表1 用于腫瘤標(biāo)志物篩選的引物

圖1 乳腺癌癌組織與癌旁組織中差異表達(dá)蛋白

2.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證上述差異的蛋白在侵襲性乳腺導(dǎo)管癌患者中的mRNA 表達(dá)水平

通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer–pku.cn/）篩選表兩種蛋白對(duì)應(yīng)的基因。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)是基于TCGA 癌癥大數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果見(jiàn)圖2所示，與癌旁組織比較，LCP1、ARF1、CCT3、VDAC1、NANS、NME1、HSP90AA1、RAN、YWHAZ、CKAP4、ERH、PRDX1、SFN、TUBB、STIP1、SNRPD3、HSPA8、NME2、H2AFY、HSPE1、HDGF、SRP9 和PDIA3 共23 個(gè)基因在侵襲性乳腺癌癌組織中表達(dá)升高。

圖2 驗(yàn)證侵襲性乳腺導(dǎo)管癌中顯著性差異表達(dá)的基因

2.3 篩選出的差異蛋白與侵襲性乳腺癌患者生存期的相關(guān)性

通過(guò)Kaplan–Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//kmplot.com/analysis）分析，結(jié)果顯示，乳腺癌患者中上述基因表達(dá)越高，乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（relapse–free survival，RFS）越短，見(jiàn)圖3。

圖3 侵襲性乳腺癌差異表達(dá)的蛋白與乳腺癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期相關(guān)性分析

2.4 篩選出的差異基因在乳腺癌中表達(dá)水平驗(yàn)證

采用qRT–PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與各自癌旁組織比較，2 例乳腺癌組織共有14 個(gè)基因：LCP1、CCT3、NANS、NME1、HSP90AA1、RAN、YWHAZ、ERH、PRDX1、STIP1、HSPA8、H2AFY、HSPE1 和PDIA3 表達(dá)升高，見(jiàn)圖4。

圖4 qRT-PCR 方法驗(yàn)證乳腺癌癌組織與癌旁組織中差異基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

基于蛋白質(zhì)組學(xué)篩選得到的LCP1、CCT3、NANS、NME1、HSP90AA1、RAN、YWHAZ、ERH、PRDX1、STIP1、HSPA8、H2AFY、HSPE1 和PDIA3 14 個(gè)基因在乳腺癌中表達(dá)升高，其中LCP1 全稱(chēng)為淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白1，是肌動(dòng)蛋白家族的成員。目前相關(guān)的研究表明，LCP1 已在幾種非造血部位的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如結(jié)腸、前列腺和乳腺中，LCP1可以作為胃癌免疫浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物；CCT3 作為CCT 復(fù)合體的一個(gè)重要亞基，作為分子伴侶可協(xié)助多種蛋白的折疊及重折疊過(guò)程，包括與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂有關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白，有研究表明在乳腺癌中CCT3 的表達(dá)量與乳腺癌的增殖和遷移相關(guān)，CCT3 敲低顯著降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，說(shuō)明CCT3 可以作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)；Nagasundaram等研究表明唾液酸的表達(dá)上調(diào)會(huì)影響受體-配體相互作用，且可能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的侵害。此外，在細(xì)胞膜上的唾液酸含量高低可以影響癌癥對(duì)化學(xué)療法和放射療法的治療效果，也就是說(shuō)NANS 通過(guò)調(diào)控唾液酸的含量影響腫瘤的生長(zhǎng)；NME1 基因也稱(chēng)為Nm23–H1 基因，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在多種惡性腫瘤細(xì)胞系及動(dòng)物模型中NME1 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能成負(fù)相關(guān)，作為轉(zhuǎn)移抑制因子可以選擇性地抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，而不損害原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)；HSP90AA1 基因主要編碼Hsp90α，是分子伴侶Hsp90的亞型，目前已有一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道HSP90α 在乳腺癌患者血液中的表達(dá)水平升高，因此可以推測(cè)HSP90AA1 可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用；近年來(lái)，Ran 的表達(dá)上調(diào)已被確定與多種癌癥的發(fā)展有關(guān)。Ran 可能不僅是一個(gè)有用的預(yù)后生物標(biāo)志物，而且還是一個(gè)潛在的抗癌治療靶點(diǎn)；YWHAZ 是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心樞紐蛋白，越來(lái)越多的證據(jù)表明，YWHAZ 在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，并在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲等細(xì)胞活動(dòng)中作為致癌基因發(fā)揮作用；PRDX1（peroxiredoxin 1）作為腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)劑，其通過(guò)消除ROS 參與氧化還原平衡和過(guò)氧化物解毒，PRDX1 在許多癌癥的細(xì)胞增殖、腫瘤促進(jìn)和細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用；有研究發(fā)現(xiàn)，STIP1 的表達(dá)失調(diào)在癌癥的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用；H2AFY 是核心組蛋白H2A 家族的成員之一，目前H2AFY 已被證明參與了乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展；最后 HSPA8、HSPE1 和PDIA3 三個(gè)基因均是編碼的分子伴侶蛋白，其中HSPA8 編碼 HSP70 家族的組成型表達(dá)的同源蛋白，目前的研究顯示其主要在肝癌中顯著上調(diào)進(jìn)而維持肝癌的惡性特征。HSPE1 基因編碼HSP60/HSP10 分子伴侶的HSP10 亞基，有助于線粒體基質(zhì)中的蛋白質(zhì)折疊，有研究表明其參與了肝細(xì)胞早期的癌變過(guò)程。最后PDIA3 可調(diào)節(jié)新合成糖蛋白的折疊，具有異構(gòu)酶和氧化還原活性，參與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控，并與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，將PDIA3 敲低之后可以影響急性髓系白血病的細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程，因此可以將PDIA3 看做是一個(gè)癌癥生物標(biāo)志物。

綜上所述，癌癥生物標(biāo)志物是發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新型癌癥療法的關(guān)鍵，它們也是臨床實(shí)踐中的關(guān)鍵要素，可用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷、預(yù)后及確定治療效果、安全性及復(fù)發(fā)等環(huán)節(jié)。腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正處于不斷發(fā)展變化中。過(guò)去幾年，基于抗體和親合性方法等技術(shù)快速發(fā)展，開(kāi)啟了癌癥早期發(fā)現(xiàn)和個(gè)體化治療策略可用生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)之路。然而，將候選生物標(biāo)志物有效和快速地從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化到臨床，仍然是一種挑戰(zhàn)。克服這些挑戰(zhàn)，需要多學(xué)科協(xié)作，獲取不同領(lǐng)域的支持，采取多組學(xué)方法，這樣轉(zhuǎn)化成功概率才大。