miRNA–193a–3p 靶向TGF–β2 基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

鞠寶玲 海艷潔 鄂志野 張紅軍

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院免疫教研室，黑龍江牡丹江 157001；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院腫瘤科，黑龍江牡丹江 157001

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，具有患病率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特點(diǎn)。目前臨床上治療肝癌主要采用手術(shù)切除、輔助化療及靶向治療等，但易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5 年生存率較低。研究表明，非編碼小RNA 分子（microRNA，miRNA）作為癌基因或抑癌基因參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程，因此，探討miRNA 在肝癌中發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，由此開(kāi)發(fā)分子靶向治療位點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌的臨床療效具有重要意義。本研究選取2019 年1 月至2021 年12 月在牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院收治的肝癌患者30 例，分析了目標(biāo)miRNA 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為分子靶向治療位點(diǎn)的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019 年1 月至2021 年12 月在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的肝癌患者30 例，其中男性18 例，女性12 例；患者年齡40～69 歲，平均年齡（55.62 ± 7.93）歲；TNM 分期I期8 例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期12 例；高中分化19 例，低未分化11 例，所有患者術(shù)前均未接受新輔助化療，且臨床資料完整。留取肝癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織（距離肝癌組織邊緣2cm 以上，經(jīng)病理確認(rèn)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)正常組織），手術(shù)取材后立即置于–80℃凍存?zhèn)溆?。本研究?jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理學(xué)審批號(hào)：20210304–50），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌HepG2 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，HepG2 細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM（dulbecco's modification of eagle’s medium，DMEM）完全培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO恒溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至 70%～80%融合度時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。miR–193a–3p mimic 及無(wú)義miRNA（對(duì)照NC 組）、TGF–β2 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒，稀釋至100nmol/L，采用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染6h，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)分組：miR–193a–3p mimic組和對(duì)照NC 組、miR–193a–3p mimic+空質(zhì)粒組和miR–193a–3p mimic+TGF–β2 組。

1.3 miR-193a-3p 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

采用TargetScan（http：//targetscan.org/）和miRDB（http：//mirdb.org/miRDB）靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR–193a–3p 靶基因。構(gòu)建TGF–β2 野生型質(zhì)粒（TGF–β2–wild type，TGF–β2–Wt）和TGF–β2 突變型質(zhì)粒（TGF–β2–mutant，TGF–β2–Mut），將質(zhì)粒與miR–193a–3p mimic 共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，48h 后，分別測(cè)定細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光強(qiáng)度（M1）以及內(nèi)對(duì)照海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度（M2），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以熒光強(qiáng)度（M1）/熒光強(qiáng)度（M2）表示。

1.4 miR-193a-3p 檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real–time quantitative PCR，qRT–PCR）檢測(cè)肝癌組織中miR–193a–3p 水平。Trizol 提取肝癌組織及癌旁正常組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Green 法檢測(cè)miRNAs 的表達(dá)，引物序列如下：miR–193a–3p，上游引物：5′–CGC GAA CTG GCC TAC AAA GTG–3′，下游引物：5′–AGT GCA GGG TCC GAG GTA TT–3′；U6，上游引物：5'–CTC GCT TCG GCA GCA CA–3′，下游引物：5'–AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT–3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min，94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，采用2法計(jì)算。

1.5 HepG2 細(xì)胞活性的檢測(cè)

采用CCK–8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2 細(xì)胞活性。調(diào)整HepG2 細(xì)胞濃度為1×10/L，接種于96 孔板。細(xì)胞施加不同作用因素后培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90μl DMEM 培養(yǎng)液和10μl CCK–8 試劑，充分混勻，培養(yǎng)箱中孵育4h，于酶標(biāo)儀450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。

1.6 HepG2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

細(xì)胞施加不同作用因素后培養(yǎng)48h，以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為10～10/ml，加入5μl的Annexin V–FITC 避光孵育10min，再加入10μl 的碘化丙啶，低溫避光孵育15min，1h 內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2 細(xì)胞凋亡率。

1.7 HepG2 細(xì)胞遷移的檢測(cè)

采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2 細(xì)胞的遷移。實(shí)驗(yàn)前將HepG2 細(xì)胞饑餓24h，收集細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為3×10個(gè)/ml，取300μl細(xì)胞懸液置于Transwell 小室（6.5mm，8.0μm 孔徑，Corning）上室，下室加入750μl 含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)液（去除下室培養(yǎng)液和小室之間氣泡），培養(yǎng)24h。甲醛固定侵襲的細(xì)胞，10%結(jié)晶紫對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)，評(píng)估HepG2 細(xì)胞的遷移能力。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-193a-3p 在肝癌組織中的表達(dá)

qRT–PCR 結(jié)果顯示，肝癌組織中miR–193a–3p 的表達(dá)（0.27±0.03）顯著低于正常肝臟組織（0.69±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01），詳見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌組織中miR-193a-3p 的表達(dá)

2.2 miR-193a-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

與NC 組比較，miR–193a–3p 組細(xì)胞的增殖活性及遷移數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），且以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，詳見(jiàn)表1 和圖2A、B。

圖2 HepG2 細(xì)胞的遷移和凋亡檢測(cè)

表1 兩組細(xì)胞的增殖活性、遷移及凋亡率比較（）

2.3 miR-193a-3p 下游靶標(biāo)的確定

取TargetScan 與miRDB 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因交集，進(jìn)行GO 分析（功能富集分析）和Pathway分析（信號(hào)通路分析），結(jié)果提示：miR–193a–3p 可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子–β（transforming growth factor，TGF–β）、MAPK 信號(hào)通路（mitogen–activated protein kinase，MAPKs）、序列相似家族（family with sequence similarity，F(xiàn)AMs）以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）通路有關(guān)（表2），其中與TGF–β、MAPKs 通路相關(guān)的可能性最大（Pathway分析，<0.0001）。qRT–PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR–193a–3p可顯著抑制TGF–β2 基因的表達(dá)，而對(duì)TGF–βR 和MAPK10 通路中預(yù)測(cè)靶標(biāo)的影響不大（圖3A），提示TGF–β2 可能是miR–193a–3p 的下游靶標(biāo)：熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示：miR–193a–3p 過(guò)表達(dá)可顯著抑制TGF–β2 3’UTR 報(bào)告系統(tǒng)的熒光素酶活性（圖3B）：進(jìn)一步生物信息學(xué)分析顯示，miR–193a–3p與靶基因TGF–β2 的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上高度保守（圖3C）。

表2 miR-193a-3p 靶基因生物信息學(xué)分析

圖3 miR-193a-3p 下游靶基因TGF-β2 的確證分析

2.4 miR-193a-3p/TGF-β2 軸對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

與miR–193a–3p+空質(zhì)粒組比較，miR–193a–3p+TGF–β2 組肝癌細(xì)胞的增殖活性及遷移數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），詳見(jiàn)表3 和圖4A、圖4B。

表3 兩組細(xì)胞的增殖活性、遷移及凋亡率比較（）

圖4 HepG2 細(xì)胞的遷移和凋亡檢測(cè)

3 討論

miRNAs 為19～26 個(gè)核苷酸的短RNA 分子，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的mRNA 表達(dá)或直接抑制其蛋白質(zhì)翻譯，參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡和遷移等生理病理過(guò)程。肝癌因其病灶血供豐富，癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力極強(qiáng)，導(dǎo)致肝癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤，因此，尋找更多肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)臨床肝癌的靶向治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 通過(guò)靶向與腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖有關(guān)的基因或與細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移有關(guān)的基因，參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管生成。如在索拉菲尼耐藥的肝癌細(xì)胞中上調(diào)miRNA–200b，通過(guò)靶向調(diào)控Ras 同源基因家族蛋白A（rhoA protein，RhoA）的表達(dá)，進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR–3188 上調(diào)表達(dá)于肝癌組織，過(guò)度表達(dá)的miR–3188通過(guò)靶向調(diào)控CXCL14調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，有望成為肝癌早期篩查和診斷的分子標(biāo)志物。過(guò)表達(dá)miR–1470 通過(guò)靶向調(diào)控ALX4 基因具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、抑制肝癌細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，30 例肝癌組織中miR–193a–3p的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，且體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示：miR–193a–p mimic 抑制HepG2 細(xì)胞活性和遷移，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR–193a–3p具有顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，miR–193a–3p 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用具有爭(zhēng)議性，其在不同腫瘤中發(fā)揮著“癌基因”或“抑癌基因”的調(diào)節(jié)作用，如miR–193a–3p低表達(dá)于非小細(xì)胞肺癌中，miR–193a–3p 作為腫瘤抑制因子，通過(guò)調(diào)控p53/Slug/L1CAM 途徑抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移進(jìn)展：而在對(duì)胃癌細(xì)胞的研究中顯示，下調(diào)miR–193a–3p 通過(guò)靶向調(diào)控PTEN 基因抑制腫瘤的增殖、遷移和化療耐受效應(yīng)。但有關(guān)miR–193a–3p 與肝癌的研究卻報(bào)道較少，本研究表明，miR–193a–3p 作為腫瘤抑制因子，具有以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡作用，但其潛在的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法提示TGF–β2 是miR–193a–3p 的下游作用靶標(biāo)，文獻(xiàn)復(fù)習(xí)發(fā)現(xiàn)，TGF–β2 通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，抑制ROS 產(chǎn)生，進(jìn)一步誘導(dǎo)上皮–間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。有文獻(xiàn)報(bào)道，RALYL 作為肝癌干細(xì)胞的特異性基因通過(guò)維持TGF–β2 mRNA 的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)功能，因此TGF–β2 是肝癌干細(xì)胞維持生物學(xué)性狀的重要基因。本研究顯示，TGF–β2 過(guò)表達(dá)顯著反轉(zhuǎn)了miR–193a–3p抑制肝癌細(xì)胞的活性和遷移，減少了miR–193a–3p 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的凋亡作用。因此，本研究有充分的理由證實(shí)，miR–193a– 3p在肝癌細(xì)胞發(fā)生、遷移和侵襲中作用，是通過(guò)靶向TGF–β2 基因的表達(dá)而發(fā)揮腫瘤抑制功能。

綜上所述，過(guò)表達(dá)的miR–193a–3p 可通過(guò)靶向調(diào)控TGF–β2 基因的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的活性和遷移，同時(shí)具有顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，因此，本研究為miR–193a–3p 有望成為肝癌靶向治療的潛在分子靶標(biāo)提供新的思路和理論依據(jù)。