維生素D受體基因多態(tài)性與兒童難治性腎病的相關(guān)性研究

譚 璐，史瑞明，吳紅艷，黃燕萍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710061)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是兒童期較為常見(jiàn)的慢性免疫性疾病，近年來(lái)發(fā)病率逐年增加，約占同期住院泌尿系統(tǒng)疾病患兒的20%。糖皮質(zhì)激素一直是治療原發(fā)性腎病綜合征公認(rèn)的首選藥物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有近半數(shù)的患兒出現(xiàn)激素依賴(lài)或耐藥，轉(zhuǎn)為難治性腎病，成為臨床極為棘手的問(wèn)題。新型免疫制劑如麥考酚酯、他克莫司、利妥昔單抗等對(duì)難治性腎病有一定的治療效果，但仍有部分患兒病情持續(xù)進(jìn)展，最終進(jìn)入終末期腎病階段。目前已有證據(jù)表明維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)激動(dòng)劑具有獨(dú)立于鈣磷代謝外的腎臟保護(hù)作用，可改善慢性腎臟疾病的緩解率[1]。由于VDR基因單核苷酸多態(tài)性的存在，不同位點(diǎn)發(fā)生基因突變，將導(dǎo)致VDR蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響其生物學(xué)效應(yīng)。目前針對(duì)兒童難治性腎病與VDR基因相關(guān)性研究的報(bào)道較少，本研究擬通過(guò)3個(gè)經(jīng)典VDR受體基因位點(diǎn)Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)，探討VDR基因多態(tài)性與兒童難治性腎病的關(guān)系，為今后藥物治療靶點(diǎn)提供新思路。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究對(duì)象分為病例組和正常對(duì)照組。病例組：選取2019年1月至2019年12月于我院兒科住院的難治性腎病患兒45例，均為漢族，男童34例，女童11例，年齡為5～13歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《諸福堂兒科學(xué)(第八版)》腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)，且對(duì)激素依賴(lài)或耐藥者。排除標(biāo)準(zhǔn)：狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙型肝炎相關(guān)腎炎、鏈球菌感染后腎炎等具有腎病綜合征表現(xiàn)的繼發(fā)性及原發(fā)性腎炎；存在骨代謝基礎(chǔ)疾病者；遺傳代謝性疾病；合并其他自身免疫性疾??；腫瘤性疾病；長(zhǎng)期服用其他影響骨代謝的藥物(糖皮質(zhì)激素除外)；依從性差，不能定期隨訪者。所有入組病例隨訪2年。正常對(duì)照組：選擇我院兒?？崎T(mén)診健康體檢的兒童95例，既往無(wú)泌尿系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌疾病史，均為漢族，男童51例，女童44例，年齡5～10歲。本研究獲我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(XJTU1AF2018LSK-203)，所有入選者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 VDR基因多態(tài)性檢測(cè)

采集所有研究對(duì)象口腔黏膜脫落上皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)洗滌、純化后獲得基因組DNA，檢索NCBI 獲取維生素D 受體基因編號(hào)為Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)位點(diǎn)，行DNA酶切，加入特異性引物，采用TaqMan熒光探針技術(shù)檢測(cè)以上3個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物及探針由安徽中科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及探針見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5min。PCR產(chǎn)物37℃酶切過(guò)夜，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察擴(kuò)增條帶并記錄基因型條帶，由第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行純化測(cè)序驗(yàn)證。

表1 VDR引物名稱(chēng)及序列

1.3其他指標(biāo)測(cè)定

所有研究對(duì)象入組后即采集空腹血，測(cè)定血肌酐、尿素、血清活性維生素D3水平；病例組定期監(jiān)測(cè)尿蛋白、血肌酐、尿素值。上述指標(biāo)測(cè)定由我院檢驗(yàn)科完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(Q1,Q3)]描述，兩組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(n)和百分比(%)描述，組間比較用χ2檢驗(yàn)。計(jì)算樣本基因型頻率，確認(rèn)其符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用Logistic回歸分析法，以患兒是否發(fā)生腎病綜合征為因變量，以年齡、性別、維生素D3水平、肌酐、尿素及VDR基因各位點(diǎn)等位基因?yàn)樽宰兞?，分析各因素?duì)患兒的影響。采用比值比(oddratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組兒童一般臨床資料的比較

兩組兒童在性別構(gòu)成比、年齡分布、活性維生素D3水平間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z/χ2值分別是6.12、-2.33、-6.48，P<0.05)；而血肌酐值和血尿素水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z值分別是-1.06、-0.47，P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)病例組和對(duì)照組的VDR 3個(gè)位點(diǎn)Fok I(rs2228570)、Bsm I(rs1544410)及Apa I(rs7975232)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組樣本人群基因頻率符合遺傳平衡法則(病例組：χ2值分別是5.44、3.59、5.53，對(duì)照組：χ2值分別是0.54、3.96、1.03，P>0.05)。

表2 兩組兒童一般臨床資料的比較[M(Q1,Q3),n(%)]

2.3兩組兒童各位點(diǎn)基因多態(tài)性的比較

病例組和對(duì)照組兒童在rs2228570位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率、rs7975232位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為26.36、26.17、22.17、18.45，P<0.05)；而rs1544410位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為2.76、3.03，P>0.05)，該位點(diǎn)與難治性腎病發(fā)病無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表3。

表3 兩組兒童各位點(diǎn)基因多態(tài)性的比較[n(%)]

2.4 VDR基因多態(tài)性與難治性腎病的相關(guān)性

以難治性腎病為因變量，rs2228570 位點(diǎn)或rs7975232位點(diǎn)分別與年齡、性別、血活性維生素D3水平、血肌酐及血尿素組合作為自變量，其中年齡及性別設(shè)為分類(lèi)變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示rs2228570位點(diǎn)、rs7975232位點(diǎn)、活性維生素D3水平、性別及年齡段與難治性腎病具有相關(guān)性(P<0.05)。活性維生素D3(OR=0.79，95%CI：0.71～0.86)、rs2228570位點(diǎn)(OR=0.23，95%CI：0.11～0.50)是難治性腎病的保護(hù)性因素;rs7975232位點(diǎn)為難治性腎病發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=6.30，95%CI：2.53～15.68)。在rs2228570位點(diǎn)作用下，學(xué)齡兒較少發(fā)生難治性腎病(OR=0.21，95%CI：0.06～0.78)。在rs7975232位點(diǎn)作用下，男童較易發(fā)生難治性腎病(OR=7.09，95%CI：2.17～23.21)，見(jiàn)表4和表5。

表4 rs2228570位點(diǎn)與難治性腎病相關(guān)危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

表5 rs7975232位點(diǎn)與難治性腎病相關(guān)危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 VDR基因多態(tài)性與難治性腎病預(yù)后的關(guān)系

將rs2228570位點(diǎn)進(jìn)一步分為野生型基因(CC)和突變型基因(CT+TT)，rs7975232位點(diǎn)分為野生型基因(CC)和突變型基因(CA+AA)。經(jīng)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療，難治性腎病預(yù)后依隨訪情況分為尿蛋白持續(xù)轉(zhuǎn)陰組和尿蛋白陽(yáng)性組。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，rs2228570位點(diǎn)野生型和突變型基因?qū)δ虻鞍邹D(zhuǎn)陰的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.14，P<0.05)，當(dāng)該位點(diǎn)為野生型基因時(shí)患兒尿蛋白更易轉(zhuǎn)陰；而rs7975232位點(diǎn)不論是野生型還是突變型基因?qū)δ虻鞍子绊懽饔孟喈?dāng)(χ2=1.23，P>0.05)，見(jiàn)表6。因此，rs2228570位點(diǎn)CC基因型與難治性腎病預(yù)后關(guān)系密切。

表6 VDR基因多態(tài)性與難治性腎病預(yù)后的關(guān)系

3討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，某些信號(hào)途徑在難治性腎病發(fā)生中起著非常重要的作用。除傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑治療外，研究者多年來(lái)試圖通過(guò)阻斷或激活某種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)難治性腎病進(jìn)行“靶向治療”。目前研究證實(shí)活性維生素D可通過(guò)與VDR結(jié)合，激活下游通路，從而發(fā)揮保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)膜、抑制免疫與炎癥反應(yīng)等作用，但VDR基因單核苷酸多態(tài)性決定了個(gè)體的預(yù)后[2-3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于兒童難治性腎病與VDR基因多態(tài)性相關(guān)性的研究報(bào)道較少，本文通過(guò)對(duì)3個(gè)經(jīng)典VDR位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，以期為難治性腎病的“靶向治療”提供依據(jù)。

3.1維生素D受體各基因位點(diǎn)與難治性腎病的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果顯示，兒童難治性腎病男童較女童發(fā)病率更高(34例vs 11例)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的男女童發(fā)病比例為3.7:1較相符[2]。維生素D受體rs2228570位點(diǎn)存在2個(gè)等位基因C和T，3種基因型CC(野生型)，CT(雜合型)及TT(突變型)；rs7975232位點(diǎn)存在2個(gè)等位基因C和A，3種基因型CC(野生型)，CA(雜合型)及AA(突變型)。難治性腎病組rs2228570位點(diǎn)CC基因型及C等位基因頻率、rs7975232位點(diǎn)AA基因型及A等位基因頻率均顯著高于健康對(duì)照組；rs1544410位點(diǎn)各基因型在病例組與對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示我們r(jià)s2228570位點(diǎn)、rs7975232位點(diǎn)與難治性腎病的發(fā)生密切相關(guān)，而rs1544410位點(diǎn)與難治性腎病發(fā)生可能無(wú)關(guān)。多因素Logistic回歸分析提示rs2228570位點(diǎn)對(duì)學(xué)齡期兒童難治性腎病具有保護(hù)效應(yīng)，在進(jìn)一步的長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)為野生型基因CC的預(yù)后更好，經(jīng)聯(lián)合免疫抑制劑治療，患兒尿蛋白更易轉(zhuǎn)陰。rs7975232位點(diǎn)成為男性患兒進(jìn)展為難治性腎病的高危因素。

3.2 VitD-VDR通路在難治性腎病中的作用機(jī)制

本研究顯示兒童難治性腎病的發(fā)生與VDR基因核苷酸多態(tài)性有密切關(guān)系，但并非所有位點(diǎn)都具有積極的正向作用，rs2228570位點(diǎn)具有保護(hù)效應(yīng)，而 rs7975232位點(diǎn)則具有負(fù)性效應(yīng)。我們推測(cè)這種保護(hù)效應(yīng)可能的機(jī)制為VitD與VDR結(jié)合后可阻斷足細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路激活，從而保護(hù)足細(xì)胞，減輕尿蛋白，延緩慢性腎臟病的病程進(jìn)展[3-6]。外源性活性維生素D的干預(yù)可上調(diào)足細(xì)胞VDR表達(dá)水平，將這種保護(hù)效應(yīng)放大。而 rs7975232位點(diǎn)的突變可能通過(guò)影響VDR mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響腎素血管緊張素系統(tǒng)的活性，但具體發(fā)生機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)[7-8]。有研究者給予腎臟次全切除的雄性大鼠每天口服活性維生素D，16周后發(fā)現(xiàn)大鼠腎小球中結(jié)蛋白、增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)減少，增大的腎小球體積較前恢復(fù)，蛋白尿減輕，證明活性維生素D可減輕炎性和非炎性慢性腎臟病模型的進(jìn)展，有抗增殖和抑制腎臟生長(zhǎng)的作用，其作用的主要靶細(xì)胞是足細(xì)胞和系膜細(xì)胞[9-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)難治性腎病患兒活性維生素D3水平遠(yuǎn)低于正常健康兒童，且Logistic回歸分析提示活性維生素D3是兒童難治性腎病的保護(hù)因素。這給予我們新的治療思路，是否可通過(guò)增加外源性活性維生素D3的攝入量而改善難治性腎病的預(yù)后[12-13]。

本研究?jī)H針對(duì)關(guān)中地域的漢族兒童開(kāi)展，樣本量有限，且VDR基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，不同位點(diǎn)可能出現(xiàn)交互作用而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故存在一定的局限性，還有待今后進(jìn)一步研究，以期為兒童難治性腎病的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。