基于高通量測(cè)序技術(shù)解析皖北地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)

程 偉，陳雪峰，陳興杰，周 端，楊金玉，薛錫佳，潘天全

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021）

中國(guó)白酒以糧谷為主要原料，經(jīng)蒸煮糊化、攤晾加曲、固態(tài)發(fā)酵、蒸餾分類、存儲(chǔ)勾調(diào)等工序制備而成，酒曲作為糖化發(fā)酵劑，對(duì)白酒的品質(zhì)具有重要影響。微生物類群是決定大曲品質(zhì)的關(guān)鍵因素，大曲培養(yǎng)過程中富集的環(huán)境微生物是白酒釀造微生物的重要來源。大曲微生物菌群中的真菌在釀酒過程的產(chǎn)酒、產(chǎn)酶和產(chǎn)香等方面均具有重要作用。大曲中的霉菌對(duì)酒曲發(fā)酵過程中的糖化力、酯化力等起到重要影響，霉菌的生長(zhǎng)利用曲料中的發(fā)酵底物代謝產(chǎn)生某些影響白酒風(fēng)味的呈香物質(zhì)。大曲菌群在白酒發(fā)酵過程中表現(xiàn)出特異性和周期性的演替特征。因此，對(duì)大曲真菌菌群的研究有利于闡明白酒發(fā)酵生香的機(jī)理，對(duì)明確不同產(chǎn)地的白酒風(fēng)格特點(diǎn)具有重要意義。中國(guó)白酒以流域?yàn)榧~帶形成了不同的聚集產(chǎn)區(qū)，長(zhǎng)江上游產(chǎn)區(qū)和黃淮流域產(chǎn)區(qū)較為著名。皖北地區(qū)屬于中國(guó)白酒黃淮河流域產(chǎn)區(qū)，該產(chǎn)區(qū)以濃香型白酒為主，口感風(fēng)格偏向“綿順柔和”，主要白酒品牌有古井貢酒、金種子酒、文王貢酒等。

傳統(tǒng)的大曲微生物研究主要采用分離培養(yǎng)等方法。高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高，具有分析全面、靈敏、快速等特點(diǎn)，能夠更加客觀地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)性。近年來，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較多研究，張會(huì)敏通過PCA-TA 克隆測(cè)序方法對(duì)古井貢酒高溫大曲和中高溫大曲中的微生物多樣性進(jìn)行研究，確定了兩種大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌種；施思等采用高通量測(cè)序技術(shù)研究大曲在貯藏過程中的微生物多樣性變化，結(jié)果表明，大曲貯存過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化，畢赤酵母屬、根霉菌屬及橫梗霉屬最終成為大曲中的優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)大曲微生物群落特征及差異的研究，有利于加深對(duì)大曲和白酒發(fā)酵機(jī)理的理解，進(jìn)而提高大曲的質(zhì)量調(diào)控水平。

當(dāng)前，關(guān)于大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究逐漸增多，但是針對(duì)皖北地區(qū)濃香型大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少，尤其是關(guān)于曲皮和曲心真菌群落結(jié)構(gòu)的分析及其差異物種的比較還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過高通量測(cè)序分析皖北地區(qū)3 家不同酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行T-test 以比較組間差異物種，該研究為明確皖北地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)提供依據(jù)，對(duì)大曲的微生物組信息擴(kuò)充具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：均為培養(yǎng)成熟剛?cè)霂熨A存的成品曲，分別取自安徽阜陽（FY）、安徽亳州（BZ）和安徽臨泉（LQ）等皖北地區(qū)3 家典型的濃香型白酒釀造生產(chǎn)企業(yè)。

試劑及耗材：氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（分析純），北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國(guó)qiagen公司。

儀器設(shè)備：超低溫冰箱、TGL-20M 高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Gene-Amp@9700 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCPO 儀，美國(guó)ABI公司；MX.S型混勻儀，美國(guó)SCILOGEX公司；QuantiFluor型-ST熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

取皖北地區(qū)3 家典型濃香型白酒釀造生產(chǎn)企業(yè)的大曲，分別取大曲表層的1～2 cm 作為曲皮樣品（樣品組“-S”，分別命名為FYS、BZS、LQS）、取曲塊中心2～3 cm的區(qū)域作為曲心樣品（樣品組“-I”，分別命名為FYI、BZI、LQI），隨機(jī)設(shè)置3 個(gè)平行樣品。將3 個(gè)平行樣品在無菌條件下等量混合后粉碎，保存于無菌袋中，置于-80 ℃冰箱以備大曲微生物總DNA的提取。

1.2.2 大曲真菌群落的結(jié)構(gòu)分析

大曲微生物總DNA 的提取：利用CTAB 法進(jìn)行改良以提取大曲微生物的總DNA，向離心管中加入200 μL無菌雙蒸水沉淀溶解總DNA，置于-20 ℃?zhèn)溆?，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度。

PCR 的擴(kuò)增與定量：以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇測(cè)序區(qū)域后使用帶Barcode 的特異引物（Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs）和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：ITS1區(qū)引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)。

PCR 產(chǎn)物的純化：使用瓊脂糖凝膠(濃度為2%)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化。采用酶標(biāo)定量并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，回收目的條帶產(chǎn)物。

構(gòu)建文庫與上機(jī)測(cè)試：采用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫，經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。建庫與測(cè)序等實(shí)驗(yàn)部分在蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖

高通量測(cè)序完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和序列優(yōu)化。根據(jù)序列的相似性，將序列相似性大于及等于97%的分歸為同一OTU，將所有序列與Silva 庫（版本SILVA_138.1）進(jìn)行比對(duì)得到序列的分類學(xué)信息。采用R 語言和AI 作圖工具繪制測(cè)序數(shù)據(jù)的稀釋曲線和堆積柱狀圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲真菌多樣性分析

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)、有效性與Alpha多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)皖北地區(qū)3 個(gè)不同產(chǎn)地濃香型大曲的曲皮與曲心分別提取DNA 進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列最大長(zhǎng)度為350 bp，分別得到74391～91030 條真菌有效序列，測(cè)序長(zhǎng)度主要分布在225～269 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長(zhǎng)度接近，表明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果較合理。對(duì)測(cè)序結(jié)果在97%相似度的OTU 水平進(jìn)行Chao 指數(shù)計(jì)算，聚類分析共產(chǎn)生1696 個(gè)OTU 分類。由表1 可以看出，各樣品Coverage ≥0.999，表明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果可以較為真實(shí)地反映各樣品中的真菌多樣性，測(cè)序結(jié)果的有效性較高。

通過單個(gè)樣品的微生物多樣性分析（Alpha 多樣性），可以反映樣品中微生物群落的豐度和多樣性，包括Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chaol 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等4 個(gè)多樣性指數(shù)。通過構(gòu)建稀釋曲線和Shannon 曲線，可以判斷取樣的合理性和測(cè)序量及測(cè)序深度的有效性。Shannon 和Simpson 指數(shù)可以反映樣品中微生物的物種多樣性，由表1 可知，不同產(chǎn)區(qū)濃香型大曲曲皮與曲心中的真菌多樣性指數(shù)均存在明顯差異。Shannon指數(shù)常用來評(píng)價(jià)微生物群落的物種多樣性，對(duì)樣品中的微生物群落物種豐富度更為敏感，指數(shù)越大代表樣品中的微生物多樣性越高，由表1 可知，BZS 的Shannon 指數(shù)最大，表明BZS 中的真菌多樣性最高。Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)常用來表征微生物群落的物種豐富度，Chao1 指數(shù)還常用來估計(jì)物種總數(shù)，指數(shù)越大代表樣品中的微生物群落物種豐富度越高，由表1 可知，BZS 的Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)最高，表明BZS中的真菌群落物種豐富度最高。

表1 不同大曲樣品真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.1.2 OTU分布的Venn分析

亳州（BZ）與阜陽（FY）屬于皖北地區(qū)相鄰的地級(jí)市，臨泉縣（LQ）地處阜陽市的南部，隸屬于阜陽市管轄，三地的地理位置相對(duì)臨近。對(duì)皖北不同產(chǎn)地濃香型大曲曲皮與曲心中獲取的真菌OTU 進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，對(duì)不同樣品之間相對(duì)共有及獨(dú)有的OTU 數(shù)進(jìn)行疊加，可進(jìn)一步直觀地比較OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況。由1（a）可知，不同曲皮樣品的共有OTU 為99 個(gè)，占曲皮總OTU 的10.70%，其中，BZS 的OTU 數(shù)最大為388 個(gè)，占曲皮總OTU的41.95%，可知BZS 的真菌多樣性較高。由1（b）可知，不同曲心樣品的共有OTU 為63個(gè)，占曲心總OTU 的8.17%，其中，F(xiàn)YI 的OTU 數(shù)最大為264 個(gè)，占曲心總OTU 的34.20 %，可知FYI 的真菌多樣性較高。由圖1（c）可知，BZS 的OTU 數(shù)為388 個(gè)，明顯高于其他樣品；整體而言曲皮的OTU 數(shù)均高于曲心。

圖1 不同大曲樣品中真菌OTU的差異性對(duì)比

通常情況下，如果序列之間的相似性高于97%，就可以把它定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)一個(gè)不同的16S rRNA 序列，即每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)一個(gè)不同的微生物種。通過OTU 分析，可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。圖2 表示不同大曲樣品曲皮與曲心中的核心真菌共有OTU（Venn 圖），重疊部分的數(shù)字表示不同樣品的共有真菌OTU 數(shù)，非重疊部分的數(shù)字表示各樣品特有真菌OTU數(shù)。由圖2可知，不同大曲樣品曲皮和曲心中的共有核心真菌OTU 數(shù)為51 個(gè)，占曲皮和曲心核心真菌總OTU 數(shù)的6.74 %；BZS 的核心真菌OTU 數(shù)為185 個(gè)，占曲皮和曲心核心真菌總OTU 數(shù)的24.44%，占比在6 個(gè)不同樣品中最高，表明BZS的核心真菌菌群的多樣性最高。

圖2 不同大曲樣品曲皮與曲心中核心真菌共有OTU（Venn圖）

2.2 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 大曲真菌門的分類

將得到的各類OTU 代表序列與Unite 真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU 在不同分類水平的物種分類信息。如圖3（a）不同樣品真菌門水平的相對(duì)豐度柱狀圖所示，BZS、LQS、BZI 和FYI 中子囊菌門（Ascomycota）均為優(yōu)勢(shì)菌門，占比分別為82.45 %、90.95 %、94.77 %和95.54 %；FYS 和LQI中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）均為優(yōu)勢(shì)菌門，F(xiàn)YS 中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）占比分別為34.05 %和64.00 %，LQI 中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）占比分別為53.31 %和44.48%。由圖3（b）可知，F(xiàn)YI 中的子囊菌門（Ascomycota）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，占比為95.54 %。綜上可知，F(xiàn)YS 和LQI 中的優(yōu)勢(shì)菌門明顯區(qū)別于其他樣品，原因還有待于深入研究。

由圖3（a）可知，BZS中的優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門（Ascomycota，82.45 %）、毛霉亞門（Mucoromycota，5.46 %）和子菌門（Basidiomycota，1.39 %），BZI 中的優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門（Ascomycota，94.77 %）和毛霉亞門（Mucoromycota，7.22 %），以上優(yōu)勢(shì)菌門的占比均在1.00 %以上。張會(huì)敏等利用ITS rDNA 克隆文庫法分析古井貢酒大曲（亳州地區(qū)的濃香型大曲）中真核微生物的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，古井貢酒濃香型大曲中的真菌組成可歸為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）等3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，該研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。

由圖3（a）可知，在不同的曲皮樣品中，F(xiàn)YS 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為34.05 %，明顯低于其他2 個(gè)曲皮樣品；FYS 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為64.00 %，明顯高于其他2 個(gè)曲皮樣品。在不同的曲心樣品中，LQI 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為63.3%，明顯低于其他2個(gè)曲心樣品；LQI 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為44.48%，明顯高于其他2 個(gè)曲心樣品。綜上可知，F(xiàn)YS 和LQI 中的優(yōu)勢(shì)菌門區(qū)別于其他樣品，皖北不同產(chǎn)地大曲的曲皮與曲心樣品中真菌群落豐度存在一定的差異，這可能會(huì)導(dǎo)致不同大曲理化指標(biāo)的差異，主要原因可能在于制曲溫度的差異。

圖3 不同大曲樣品中真菌門水平的相對(duì)豐度柱狀圖

2.2.2 大曲真菌屬的分類

如圖4（a）不同樣品組真菌屬水平的相對(duì)豐度柱狀圖所示，曲皮樣品組中總體豐度較高的菌屬有布氏白粉菌屬（BZS，，57.13 %）、根霉屬（FYS，，62.77 %）和子囊菌屬（LQS，，54.18%），曲心樣品組中總體豐度較高的菌屬有踝節(jié)菌屬（BZI，，44.12%）、嗜熱子囊屬（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌屬（LQI，，36.99 %）。綜上可知，皖北地區(qū)不同酒企大曲樣品的曲皮和曲心中的優(yōu)勢(shì)菌屬均不相同。

圖4 不同大曲樣品中真菌屬水平的相對(duì)豐度柱狀圖

制曲培養(yǎng)過程中，曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度；不同培曲溫度對(duì)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活及揮發(fā)性化合物等均產(chǎn)生重要影響；因此，可能導(dǎo)致曲心的嗜熱菌屬結(jié)構(gòu)及其豐度高于曲皮，也可能導(dǎo)致曲皮中的根霉或曲霉等適宜溫度相對(duì)不高的菌屬結(jié)構(gòu)及其豐度高于曲心。由圖4（a）可知，嗜熱子囊屬（）在BZI、FYI 和LQI 等曲心樣品中的占比分別為3.47%、44.89%和2.88%；嗜熱子囊屬（）在LQS 中的占比為22.55 %，明顯高于其他2 個(gè)曲皮樣品（FYS、0.14 %；BZS、0.57 %）。根霉屬（）在BZS、FYS 和LQS 等曲皮樣品中的占比分別為2.01 %、62.77 %和7.01 %；然而，根霉屬（）在LQI中的占比為35.93 %，明顯高于其他2 個(gè)曲心樣品（FYI、1.23 %；BZI、2.95 %），根霉屬（）可以分泌多種水解酶，有利于促進(jìn)原料淀粉的分解利用。同屬于皖北地區(qū)，地理位置接近，氣候差異不明顯，不同曲心與曲皮樣品中嗜熱子囊屬（）和根霉屬（）的差異，可能是由于不同酒企制曲工藝的差異所導(dǎo)致，尤其是培曲溫度及頂溫的差異。

如圖4（b）FY 樣品真菌屬水平的相對(duì)豐度柱狀圖所示，F(xiàn)YS 的優(yōu)勢(shì)菌屬為根霉屬（，62.77 %），F(xiàn)YI 的優(yōu)勢(shì)均屬為嗜熱子囊屬（，44.89%）。結(jié)合圖4（a）可知，酵母菌屬（）在BZS 和LQI 中的占比分別為2.01 %和1.83 %，在其他3 個(gè)樣品中的占比均低于1.00 %；酵母菌屬（）在FYS 中的占比達(dá)到17.10 %，明顯高于其他樣品，這可能是由于制曲工藝的差異所造成的，尤其是添加酵母制品或其他微生物制品用于強(qiáng)化制曲。

2.3 大曲真菌門水平的組間差異

利用Alpha 多樣性指數(shù)組間的差異分析，能夠判別出不同組別間的整體群落結(jié)構(gòu)是否有顯著性的不同，這種不同究竟是由哪些差異物種導(dǎo)致的，就需要組間差異物種分析。為了找出組間具有顯著差異的物種，可以通過T-test、Metastat 和LEfSe等方法尋找標(biāo)記性質(zhì)的物種，即biomarker 從不同層級(jí)的物種豐度出發(fā)，通過常規(guī)的T-test 可以得到差異物種。為尋找真菌門（Phylum）分類水平下不同分組間的差異物種，進(jìn)行曲皮與曲心樣品組間的T-test檢驗(yàn)，找出差異顯著（p值＜0.05）的物種。

如圖5 所示的大曲樣品組中真菌門水平的組間T-test 可知，曲皮和曲心樣品組間豐度差異顯著的物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）；子囊菌門（Ascomycota）在曲皮和曲心樣品組的豐度分別為52.52%和87.41%；毛霉菌門（Mucoromycota）在曲皮和曲心樣品組的豐度分別為41.60%和9.21%。由圖5（b）所示的組間差異置信度展示可知，曲心樣品組差異物種的p值為0.028（p 值＜0.05），曲心樣品組均值差的95 %置信區(qū)間下限為-0.65，區(qū)間上限為-0.05；曲皮樣品組差異物種的p 值為0.048（p 值＜0.05），曲皮樣品組均值差的95%置信區(qū)間下限為0.01，區(qū)間上限為0.64。綜上可知，基于門水平的組間T-test 具有可信度，大曲樣品組間的差異物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。

圖5 不同大曲樣品組真菌門水平的組間T-test

圖5 說明：a 圖中每個(gè)條形分別表示在分組間豐度差異顯著的物種在每個(gè)組中的均值；b 圖中每個(gè)圈的最左端點(diǎn)表示均值差的95 %置信區(qū)間下限，圓圈的最右端點(diǎn)表示均值差95 %置信區(qū)間上限，圓圈的圓心代表的是均值的差，圓圈顏色所代表的組為均值高的組，展示結(jié)果的最右端是對(duì)應(yīng)差異物種的組間顯著性檢驗(yàn)p值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過高通量測(cè)序比較了皖北地區(qū)3 家典型酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)，得到的結(jié)論主要有：（1）不同曲樣的曲皮共有真菌OTU 為43個(gè)，曲心共有真菌OTU 為47 個(gè)，曲皮與曲心共有真菌OTU為51個(gè)；（2）曲皮樣品組中豐度較高的有布氏白粉菌屬（BZS，，57.13 %）、根霉屬（FYS，，62.77 %）和子囊菌屬（LQS，，54.18%），曲心樣品組中豐度較高的有踝節(jié)菌屬（BZI，，44.12 %）、嗜熱子囊屬（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌屬（LQI，，36.99 %）；（3）基于門水平的組間T-test 表明，曲皮和曲心分組間的差異物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。

大曲微生物多樣性研究對(duì)探究不同制曲工藝的微生物差異、解析相關(guān)功能菌株具有重要意義；功能菌株的篩選、純化及強(qiáng)化應(yīng)用，對(duì)提高白酒品質(zhì)、原料利用率和特征風(fēng)味成分含量等具有重要影響，有利于為微生物菌群的強(qiáng)化應(yīng)用提供思路。綜上可知，皖北地區(qū)3 家典型酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)各具特點(diǎn)，差異性可能是由于不同區(qū)域環(huán)境微生物、制曲工藝等造成。該研究為明確皖北地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)提供依據(jù)，對(duì)大曲微生物組的信息擴(kuò)充具有一定參考價(jià)值。