濃香型白酒糟醅細(xì)菌多樣性與窖齡關(guān)聯(lián)度的研究

胡 斌，羅明有，王 松，周瑞平，劉 江，付雨晴，唐代云，劉 超

（1.四川省宜賓市敘府酒業(yè)股份有限公司，四川宜賓 644600；2.宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644600）

生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和研究均表明通常情況下窖齡越長(zhǎng)的窖池，原酒的產(chǎn)質(zhì)量也越好。糟醅作為直接承載釀酒微生物生長(zhǎng)繁殖的載體，對(duì)濃香型白酒的窖內(nèi)發(fā)酵有著非常重要的影響，現(xiàn)有絕大部分研究都是圍繞窖齡與窖泥微生物多樣性的關(guān)系來(lái)進(jìn)行的，對(duì)窖齡與其窖內(nèi)糟醅微生物多樣性之間關(guān)聯(lián)度的研究不足。本次研究以宜賓產(chǎn)區(qū)某知名酒企3 口不同窖齡窖池發(fā)酵前后的糟醅為對(duì)象，深入探究不同窖齡窖池對(duì)發(fā)酵糟醅影響的差異和共性，為指導(dǎo)白酒生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

20 年窖齡窖池混合入窖及出窖糟醅，25 年份窖池混合入窖及出窖糟醅，36年份窖池混合入窖及出窖糟醅，儲(chǔ)存期6 個(gè)月以上的偏高溫大曲（粉碎后）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糟醅樣品的處理及采集

分別選取20 年、25 年、36 年年份窖池中具有代表性且產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的窖池各1 口進(jìn)行跟蹤采樣，選取的20 年份、25 年份、36 年份窖池窖號(hào)分別為5-3-11、3-3-13、2-2-8，按照宜賓產(chǎn)區(qū)五糧濃香型白酒生產(chǎn)工藝進(jìn)行發(fā)酵，所有工藝參數(shù)無(wú)人為差異性調(diào)整（基本保持一致），共計(jì)取樣三個(gè)輪次，第一輪次為2020 年1 月份，分別對(duì)3 口實(shí)驗(yàn)窖池入窖糟醅進(jìn)行采樣，采樣分上中下3 層，每層使用五點(diǎn)取樣法取樣約1 kg 后均勻混合，取其中一部分進(jìn)行理化檢測(cè)，另外一部分放置于-80 ℃超低溫冰箱保存待用；2020 年4 月份分別對(duì)該3 口實(shí)驗(yàn)窖池按相同的采樣和封存方法對(duì)出窖糟醅及入窖糟醅進(jìn)行采樣封存并檢測(cè)，此后依次為2020 年9 月（熱季放假45 d）對(duì)出窖及入窖糟醅進(jìn)行采樣封存檢測(cè)，2020年12 月對(duì)第三輪次的出窖糟醅進(jìn)行采樣封存。按窖齡分別將封存的3 個(gè)輪次的入窖及出窖糟醅混合均勻。

1.2.2 樣品編號(hào)

20年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實(shí)驗(yàn)樣品編號(hào)分別為A1、A2，25 年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實(shí)驗(yàn)樣品編號(hào)分別為B1、B2，36年窖齡窖池混合入窖、出窖糟醅實(shí)驗(yàn)樣品編號(hào)分別為C1、C2。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)

高通量測(cè)序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。糟醅酸、水、淀等理化指標(biāo)參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行檢測(cè)并取平均值分析。無(wú)線溫度傳感器對(duì)窖內(nèi)上中下三層發(fā)酵溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)并取平均值。

2 結(jié)果和分析

2.1 實(shí)驗(yàn)窖池發(fā)酵狀況概述

不同窖齡窖池發(fā)酵溫度及理化指標(biāo)變化（表1）趨勢(shì)基本一致，該變化符合宜賓產(chǎn)區(qū)五糧濃香型白酒生產(chǎn)規(guī)律，判斷該三口實(shí)驗(yàn)窖池均發(fā)酵正常（備注：由于入窖糟醅經(jīng)過(guò)高溫蒸餾，部分還原糖已經(jīng)轉(zhuǎn)化成焦糖等物質(zhì)，不具備參考意義，因此在測(cè)定的時(shí)候不在對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定）。

表1 糟醅在不同年份窖池發(fā)酵前后理化參數(shù)對(duì)比

2.2 不同樣品OTUs、多樣性指數(shù)

將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，在97 %的相似水平下進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，在OTU 聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇豐度最高的序列作為OTU 的代表性序列，共得到入窖細(xì)菌OTUs 數(shù)量1208 個(gè)，共有OTUs 數(shù)量257 個(gè)（圖1）；出窖細(xì)菌OTUs 數(shù)量1049 個(gè)，共有OTUs 數(shù)量32 個(gè)（圖2）。對(duì)比試驗(yàn)糟醅樣品發(fā)酵前后Alpha 多樣性指數(shù)顯示，3 個(gè)試驗(yàn)糟醅在發(fā)酵后細(xì)菌物種多樣性均大幅下降、物種豐度大幅上升，共有細(xì)菌OTUs 數(shù)量減少，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際分析，在發(fā)酵過(guò)程中缺氧、酸性的環(huán)境淘汰了大部分好氧型細(xì)菌，發(fā)酵過(guò)程中厭氧或兼性厭氧型細(xì)菌消耗窖內(nèi)淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖，使得物種豐度大幅上升。不同窖齡出窖糟醅中共有的32 個(gè)細(xì)菌OTUs 可能為生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)菌，可從中選取具有代表性的功能性細(xì)菌進(jìn)行研究。

圖1 濃香型入窖糟醅細(xì)菌韋恩圖

圖2 濃香型出窖糟醅細(xì)菌韋恩圖

2.3 Alpha多樣性指數(shù)計(jì)算（表2）

Coverage 指數(shù)為各樣品文庫(kù)的覆蓋率，數(shù)值越高，樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。由表2 可知，所有樣品Coverage 指數(shù)均大于0.99，故本次測(cè)序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。

2.4 Alpha多樣性指數(shù)分析

由表2 可以看出，不同窖齡窖池內(nèi)糟醅發(fā)酵后，細(xì)菌物種多樣性均大幅減少，物種豐度均大幅增加，物種多樣性及物種豐度的整體變化趨勢(shì)基本一致，窖齡與糟醅發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌整體變化趨勢(shì)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

表2 糟醅細(xì)菌的序列數(shù)、OTU數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)

對(duì)比出窖糟醅細(xì)菌多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，36年窖池發(fā)酵糟醅物種多樣性最低，物種豐度最高，窖齡與出窖糟醅細(xì)菌物種多樣性成反比、與細(xì)菌物種豐度成正比。結(jié)合企業(yè)生產(chǎn)實(shí)際分析，窖齡越長(zhǎng)的窖池在細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)上更優(yōu)，能夠篩選掉更多與白酒產(chǎn)質(zhì)量無(wú)關(guān)的細(xì)菌，從而擴(kuò)大有益細(xì)菌的生存空間，進(jìn)一步提高產(chǎn)質(zhì)量。

2.5 基于屬水平的細(xì)菌群落分析

選取在屬水平上相對(duì)豐度前十的細(xì)菌屬制作百分比堆積柱形圖，見(jiàn)圖3，可以直觀地看到樣本優(yōu)勢(shì)菌種的分類及占比情況，有利于發(fā)現(xiàn)濃香型出窖糟醅在屬水平上菌種組成的差異，為車間技改提供一定的理論基礎(chǔ)。

由圖3 可以看出，A2、B2、C2 中乳桿菌屬占比為81.45 %、95.84 %、97.41 %，均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，隨著窖池年份的增加，乳桿菌屬的占比增加。韓興林等的研究表明，在濃香型白酒發(fā)酵后期主要產(chǎn)乳酸和乳酸乙酯，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可以通過(guò)人為調(diào)整窖期的方式達(dá)到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，進(jìn)一步加強(qiáng)人為干預(yù)對(duì)白酒生產(chǎn)的影響。3 個(gè)不同年份窖池出窖糟醅中，除乳桿菌屬外含量最多且共有的細(xì)菌屬為假單胞菌屬，可對(duì)其分離純化后進(jìn)行功能性分析。

圖3 濃香型出窖糟醅細(xì)菌屬水平結(jié)構(gòu)分析

由圖3 可以看出，在20 年窖池糟醅中，檢出了多種25 年及36 年窖池出窖糟醅中未檢出的細(xì)菌菌屬；25 年窖池出窖糟醅中，檢出多種36 年窖池出窖糟醅未檢出的細(xì)菌菌屬；36年窖池出窖糟醅中檢出的細(xì)菌菌屬的種類數(shù)最少。結(jié)果顯示隨著窖齡增長(zhǎng)，窖內(nèi)發(fā)窖糟醅細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)更優(yōu)，與Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)論一致，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可根據(jù)出窖糟醅中檢出的細(xì)菌菌屬種類數(shù)在一定程度上判斷窖池的老熟程度。

3 結(jié)論

3.1 不同窖齡窖池糟醅發(fā)酵后，細(xì)菌物種多樣性大幅下降、物種豐度大幅上升，共有細(xì)菌OTUs 數(shù)量減少，物種多樣性及物種豐度的整體變化趨勢(shì)基本一致，窖齡與其糟醅發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌整體變化趨勢(shì)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

3.2 窖池窖齡與出窖糟醅細(xì)菌物種多樣性成反比、細(xì)菌物種豐度成正比，窖齡越長(zhǎng)的窖池在細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)上更優(yōu)，能夠篩選掉更多與白酒產(chǎn)質(zhì)量無(wú)關(guān)的細(xì)菌，從而擴(kuò)大有益細(xì)菌的生存空間，進(jìn)一步提高產(chǎn)質(zhì)量。

3.3 在不同窖齡的出窖糟醅中，乳桿菌屬均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，隨著窖池年份的增加，乳桿菌屬的占比與窖齡成正相關(guān)增加。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可以通過(guò)人為調(diào)整窖期的方式以達(dá)到控制白酒中乳酸、乳酸乙酯含量的目的，進(jìn)一步加強(qiáng)人為干預(yù)對(duì)白酒生產(chǎn)的影響。

3.4 在不同年份窖池出窖糟醅中，除乳桿菌屬外含量最多且共有的細(xì)菌屬為假單胞菌屬。

3.5 隨著窖齡增長(zhǎng)，窖內(nèi)發(fā)窖糟醅細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)更優(yōu)，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可以根據(jù)出窖糟醅中檢出的細(xì)菌菌屬種類數(shù)在一定程度上判斷窖池的老熟程度，為技術(shù)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論依據(jù)。