東北三省2021年水稻審定品種的核心親本遺傳多樣性與秈粳分化

劉 丹，王嘉宇，馮章麗，馮 博，陳溫福

(1 遵義師范學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 貴州遵義 563006；2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110866；3遵義師范學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院, 貴州遵義 563006)

核心親本在品種的更替過(guò)程中起重要的推動(dòng)作用，它們具有使用頻率高、綜合性狀好的特點(diǎn)，利用它們作為親本容易培育出性狀優(yōu)良的新品種。近年來(lái)，隨著種業(yè)保衛(wèi)戰(zhàn)和種子“卡脖子”問(wèn)題的提出，研究核心親本的形成和利用過(guò)程，分析核心親本的遺傳背景已成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，前人已經(jīng)對(duì)馬鈴薯[1]、大豆[2]、甘薯[3]、油菜[4]等農(nóng)作物核心親本的演化和利用開展了相關(guān)研究，但至今為止有關(guān)東北三省粳稻核心親本的系統(tǒng)研究報(bào)道相對(duì)較少。

東北三省是中國(guó)優(yōu)質(zhì)粳稻的主產(chǎn)區(qū)，水稻種植面積占中國(guó)粳稻總面積的50%以上[5]，培育出優(yōu)良粳稻新品種對(duì)保障國(guó)家糧食安全意義重大。盡管相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明[6]，近三年來(lái)，東北三省共審定水稻新品種628個(gè)，品種審定數(shù)量很大，但同質(zhì)現(xiàn)象嚴(yán)重，大部分品種的推廣應(yīng)用率低，缺乏具有突破性的主導(dǎo)新品種。核心親本的遺傳多樣性是影響能否育成突破性品種的關(guān)鍵。遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)[7]，用于選育新品種的潛力就越大。已有的研究表明，東北三省水稻育成品種的血緣關(guān)系比較集中，遺傳基礎(chǔ)狹隘，大部分材料具有相同的遺傳背景[8-11]，但對(duì)相關(guān)的育種核心親本的遺傳多樣性水平還知之甚少。因此，深入分析東北三省水稻育種核心親本的遺傳關(guān)系，有效拓寬東北三省水稻雜交親本的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)于育成突破性新品種已勢(shì)在必行。

開展亞種間雜交，引入秈稻血緣，為拓寬粳稻遺傳背景提供了新途徑。Sun等[12]和高虹等[13]研究認(rèn)為秈稻血緣為中國(guó)粳型超級(jí)稻增產(chǎn)做出了重要貢獻(xiàn)。劉丹等[14]研究結(jié)果表明，15份東北三省育成的粳型超級(jí)稻品種均含有一定的秈型血緣。然而，目前對(duì)秈稻血緣在東北育種核心親本基因組所占比重和利用固定區(qū)域都不明確。因此，量化東北粳稻核心親本的血緣組成，對(duì)于充分發(fā)揮秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)，精準(zhǔn)改良育種核心親本，豐富東北稻區(qū)粳稻遺傳基礎(chǔ)具有重要的參考價(jià)值。目前，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記從DNA水平上進(jìn)行遺傳基礎(chǔ)解析已成為一種重要技術(shù)手段。為了更深入地從分子層面剖析水稻的秈粳遺傳分化，研究者們根據(jù)秈粳稻亞種間的基因組序列差異，開發(fā)出了不同類型的分子標(biāo)記[15-19]，其中InDel分子標(biāo)記屬于共顯性標(biāo)記，具有簡(jiǎn)單、高效、可重復(fù)性好的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于水稻的秈粳分化研究。

本研究通過(guò)對(duì)2021年?yáng)|北三省審定水稻新品種的系譜進(jìn)行分析，確定20份育種材料為核心親本，并利用SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性和秈粳分化進(jìn)行研究，研究結(jié)果旨在為東北地區(qū)粳稻育種的核心親本保護(hù)、選擇和利用提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以從東北三省2021年審定的256個(gè)水稻新品種的系譜分析中篩選出的20份育種核心親本為材料，其中遼寧省核心親本6份，吉林省核心親本5份，黑龍江省核心親本9份，詳細(xì)信息如表1。

1.2 水稻基因組DNA提取

在田間每份參試材料選取一個(gè)單株，于抽穗期取劍葉葉片裝于自封袋，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。取出一片葉去掉葉脈后剪碎，裝于2 mL離心管，加入鋼珠，利用細(xì)胞震蕩破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后采用2% CTAB法提取DNA，操作步驟參照Doyle等[20]。

1.3 分子標(biāo)記選擇及檢測(cè)

試驗(yàn)選取覆蓋水稻12條染色體上的78對(duì)引物進(jìn)行分析，包括來(lái)源沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所的44對(duì)SSR多態(tài)性引物和34對(duì)InDel秈粳特異性引物[16]，引物委托北京六合華大基因合成。PCR擴(kuò)增體系為15 μL，包含DNA(20 ng/L)2 μL，前后引物各2 μL，2×Mix混合體系7.5 μL，ddH2O 1.5 μL。SSR引物PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。InDel引物PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min，4 ℃保存。采用6%聚丙稀酰胺變性凝膠電泳和3%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以“0、1、9”統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失記為“9”，建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣。利用PowerMarker V3.25軟件[21]計(jì)算主要等位位點(diǎn)頻率(Maf)、等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性指數(shù)(H)及多態(tài)性信息含量(PIC)，計(jì)算頻率自舉樹，并利用MEGA7.0.21[22]軟件進(jìn)行NJ聚類分析。利用Structure 2.3.4軟件[23-24]完成參試材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析，將MCMC開始時(shí)的不作數(shù)迭代設(shè)為10 000次，將不作數(shù)迭代后的MCMC迭代設(shè)為100 000次，K值設(shè)置為1～10，每個(gè)K值都獨(dú)立運(yùn)算了10次。根據(jù)Structure的運(yùn)算結(jié)果計(jì)算ΔK值，計(jì)算公式為ΔK= mean[|L''(K)|]/sd[L(K)]，根據(jù)ΔK值確定最可能的K值，數(shù)據(jù)處理和計(jì)算均在Excel2010上進(jìn)行。

以“XX、GG、XG”統(tǒng)計(jì)InDel擴(kuò)增帶型，擴(kuò)增產(chǎn)物帶型以典型秈稻9311和典型粳稻‘日本晴’的帶型為對(duì)照。同一位點(diǎn)上條帶與9311帶型一致的記為“XX”，與‘日本晴’帶型一致的記為“GG”，雜合帶型記為“XG”。參試材料的秈(粳)型基因頻率Fx(Fg)計(jì)算公式為：

其中Mxx為純合秈稻基因型(XX)數(shù)目；Mgg為純合粳稻基因型(GG)數(shù)目；Mxg為秈粳稻雜合基因型(XG)數(shù)目；N為所包括引物對(duì)(位點(diǎn))的數(shù)目[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北三省2021年審定水稻品種的系譜分析

根據(jù)國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心[6](中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.ricedata.cn/variety/)發(fā)布的結(jié)果，東北三省2021年審定水稻品種共256個(gè)，其中遼寧省審定水稻品種16個(gè)，吉林省審定水稻品種69個(gè)，黑龍江省審定水稻品種171個(gè)。對(duì)256份審定材料的系譜進(jìn)行追溯和分析，選擇出20份育種核心親本，由它們育成的品種數(shù)量172個(gè)，占育成品種數(shù)的67%(圖1，A)。選擇出的20份核心親本中，遼寧省核心親本6個(gè)，育成品種8個(gè)，水稻品種核心親本使用占比50.00%(圖1，B)；吉林省核心親本9個(gè)，育成品種44個(gè)，水稻品種核心親本使用占比63.77%(圖1，C)；黑龍江省核心親本14個(gè)，育成品種120個(gè)，水稻品種核心親本使用占比70.18%(圖1，D)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，核心親本‘遼星1’、‘吉粳88’、‘五優(yōu)稻1號(hào)’、‘五優(yōu)稻4號(hào)’、‘遼粳5’、‘龍稻5’和‘吉玉粳’這7個(gè)品種至少在兩省份都得到利用。

2.2 SSR擴(kuò)增多態(tài)性分析

選取的44對(duì)SSR多態(tài)性引物對(duì)20份育種核心親本進(jìn)行擴(kuò)增。共檢測(cè)到130個(gè)等位基因，每個(gè)引物位點(diǎn)擴(kuò)增等位基因(Na)變幅為2～5個(gè)，平均等位基因數(shù)為2.95個(gè)(表2)。主要等位位點(diǎn)頻率(Maf)變幅為0.30～0.95，平均主要等位位點(diǎn)頻率為0.68。基因多樣性指數(shù)(H)變幅為0.10～0.75，平均主要等位位點(diǎn)頻率為0.41。多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.09～0.70，平均主要等位位點(diǎn)頻率為0.36。由此可見，參試材料的遺傳多樣性水平較低，遺傳基礎(chǔ)不夠豐富。此外，引物RM259、RM246、PSM132、RM44以及RM536等位點(diǎn)檢測(cè)到的遺傳多樣性參數(shù)值較大，表明這些位點(diǎn)能夠較好地反映出參試核心親本材料的遺傳多樣性。

表2 SSR多態(tài)性標(biāo)記的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity information of polymorphic SSR markers

2.3 核心親本遺傳多樣性分析

東北三省水稻育種核心親本在44個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性分析(表3)顯示，3個(gè)省份核心親本的等位基因變幅為1.95～2.27，基因多樣性指數(shù)變幅為0.30～0.34，多態(tài)性信息含量變幅為0.25～0.30。其中黑龍江省核心親本的等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量均表現(xiàn)最高，表明東北三省中，黑龍江省核心育種親本的遺傳多樣性最為豐富。

表3 東北三省核心親本遺傳多樣性Table 3 The genetic diversity of core parents in Northeast China

2.4 核心親本聚類分析

利用44對(duì)多態(tài)性SSR分子標(biāo)記的結(jié)果，根據(jù)Nei’s遺傳距離，進(jìn)行NJ聚類分析。20份參試材料可分為3個(gè)類群，其中第Ⅰ類群材料包括4份材料，分別為‘吉玉粳’、‘吉粳88’、‘吉粳83’以及‘長(zhǎng)白19’，均來(lái)自于吉林省。第Ⅱ類群材料包括10份材料，可以再細(xì)劃分為2個(gè)亞類群，其中第Ⅱ-1亞群包括5份材料，來(lái)自于吉林省和黑龍江省，分別為‘長(zhǎng)白9’、‘五優(yōu)稻1號(hào)’、‘龍稻5’、‘五優(yōu)稻4號(hào)’、‘龍粳10’；第Ⅱ-2亞群包括5份材料，均來(lái)自于黑龍江省，分別為‘龍粳31’、‘龍粳21’、‘墾稻10’、‘合江19’以及‘綏粳4’。第Ⅲ類群材料包括6份材料，可以再細(xì)劃分為2個(gè)亞類群，其中第Ⅲ-1亞群包括5份材料，均來(lái)自于遼寧省，分別為‘鐵粳7’、‘遼粳5’、‘沈農(nóng)265’、‘遼粳454’、‘遼星1’；第Ⅲ-2亞群包括1份材料，為來(lái)自于遼寧省的‘鹽豐47’。由此可見，‘鹽豐47’與其他材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且東北三省20份核心親本基本形成了各自獨(dú)立的類群(圖2)。進(jìn)一步對(duì)這20份材料的系譜進(jìn)行分析(圖3)，參試20份材料的血緣均可追溯到最早期的日本水稻材料親本，如‘豐錦’、‘愛(ài)國(guó)’、‘黎明’、‘笹錦’、‘石狩白毛’、‘早生坊主’等。‘合江19’和‘墾稻10’的血緣都有一部分來(lái)自于‘合江12’，它們具有較近的親緣關(guān)系，這與NJ聚類圖結(jié)果相符。

2.5 核心親本遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于Structure2.3.4模型，將群體數(shù)目(K)設(shè)定為1～10，10次重復(fù)，對(duì)參試材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。由圖4可知，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK值為652.17，此處出現(xiàn)最大拐點(diǎn)，由此可以判斷出20份核心親本可以劃分為兩個(gè)穩(wěn)定的類群。

當(dāng)K=2時(shí)，20份核心親本的遺傳結(jié)構(gòu)和群體組成分析(圖5)顯示，20份參試材料被劃分成A和B兩個(gè)類群，其中A類群包含11份材料，B類群包含9份材料。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，參試材料中，遼寧省育種核心親本均處于A類群，黑龍江省育種核心親本均處于B類群，而吉林省核心親本分布于A類群之中。

2.6 核心親本的秈粳分化

利用34 對(duì) InDel 標(biāo)記計(jì)算參試20份材料的秈型基因頻率(Fx)。由表4可知，盡管20份核心親本遺傳背景均為粳稻類型，但均含有一定的秈型血緣位點(diǎn)。參試材料的秈型基因頻率Fx在0.01～0.19范圍內(nèi)，其中‘龍粳21’的Fx最大為0.19，而‘墾稻10’的Fx值最小為0.01。進(jìn)一步分析東北三省不同核心親本的秈型基因頻率可知，遼寧省、吉林省、黑龍江省核心親本秈型基因頻率Fx平均分別為0.07、0.08、0.05，黑龍江省核心親本的秈型血緣位點(diǎn)低于遼寧省和吉林省。

表4 20份東北水稻核心親本的秈型基因頻率Table 4 Fx of 20 rice core parents in Northeast China

3 討 論

3.1 東北水稻核心親本的更替

水稻品種更替對(duì)于提高產(chǎn)量，保證水稻生產(chǎn)持續(xù)增長(zhǎng)十分必要。中國(guó)水稻育種取得了舉世矚目的成就，水稻發(fā)展先后經(jīng)歷了矮化育種和雜交稻育種兩次技術(shù)革命，育成的水稻品種出現(xiàn)了多次新品種的更新?lián)Q代[25]。程芳艷等[26]對(duì)黑龍江省2010～2014年審定水稻品種的骨干親本進(jìn)行追溯，發(fā)現(xiàn)不同積溫帶常以選育品種最多的親本作為該區(qū)最新的骨干親本，一些早期從日本引進(jìn)的重要親本如‘下北’、‘農(nóng)林11’和‘屜錦’等，已經(jīng)退出歷史舞臺(tái)，而像‘富士光’、‘上育397’和‘空育131’等日本品種，盡管建國(guó)初期在黑龍江省水稻生產(chǎn)和品種選育中具有重要地位，但近年來(lái)利用率不斷減小，取而代之的是自主育成的品種，如由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院五常水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)稻品種‘五優(yōu)稻1號(hào)’，已成為近幾年利用率較高的骨干親本。趙一洲等[25]對(duì)遼寧省水稻骨干親本進(jìn)行分析，研究表明隨著育種時(shí)間的推移，骨干親本不斷發(fā)生更替，新的骨干親本不斷產(chǎn)生，舊的骨干親本不斷淘汰，且親本利用愈加向少數(shù)骨干親本集中。本研究通過(guò)對(duì)東北三省2021年審定的256個(gè)水稻品種進(jìn)行系譜分析，獲得了20份育種核心親本。對(duì)這些育種核心親本的審定時(shí)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)20份材料的審定時(shí)間范圍在1978～2011年，時(shí)間跨度大，核心親本利用和更替周期較長(zhǎng)。20份核心親本中，2000年以來(lái)育成的品種13份，占比65%，表明2000年以來(lái)中國(guó)東北粳稻育種也取得了階段性成就，培育出了一些新的重要核心親本材料。同時(shí)，進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，20份育種核心親本分布情況為遼寧省6個(gè)，吉林省5個(gè)，黑龍江省9個(gè)，且其中的核心親本‘遼星1’、‘吉粳88’、‘五優(yōu)稻1號(hào)’、‘五優(yōu)稻4號(hào)’、‘遼粳5’、‘龍稻5’、‘吉玉粳’這7個(gè)品種至少在兩省中都得到利用，表明優(yōu)良的品種易被多個(gè)育種單位引用作為核心育種親本，與前人研究結(jié)果相符。這可能是導(dǎo)致東北三省現(xiàn)有品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種同質(zhì)性嚴(yán)重的一個(gè)重要原因。此外，在核心親本的利用過(guò)程中，一個(gè)重要問(wèn)題就是如何保護(hù)和鑒別品種的真?zhèn)?，更好地服?wù)于育種。曾曉珊等[27]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了27個(gè)水稻核心親本指紋圖譜，為核心親本的保護(hù)，品種真?zhèn)魏图兌鹊蔫b定提供了可靠依據(jù)，這也為我們下一步工作提供了思路。

3.2 東北水稻核心親本遺傳多樣性

遺傳多樣性是進(jìn)行品種資源評(píng)價(jià)的重要手段，也是水稻育種親本選育的前提和基礎(chǔ)。趙一洲等[28]對(duì)遼寧省水稻骨干親本遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)骨干親本間表型變化差異較小，親緣關(guān)系較近。李修平等[29]對(duì)寒地水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，認(rèn)為參試寒地水稻種質(zhì)遺傳多樣性較低。齊永文等[30]對(duì)中國(guó)水稻選育品種遺傳多樣性及其近50 年變化趨勢(shì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明在表型、同工酶和SSR 水平上，東北稻區(qū)粳稻品種均表現(xiàn)出較低的多樣性。本研究結(jié)果表明，參試的東北三省2021年審定水稻品種的核心親本遺傳多樣性較低，親緣關(guān)系較近，這一點(diǎn)與前人研究結(jié)果一致。NJ聚類和品種系譜分析表明，東北地區(qū)水稻育種核心親本遺傳基礎(chǔ)狹窄以及這些核心親本的高頻率利用，可能是導(dǎo)致現(xiàn)有育成品種親緣關(guān)系較近的主要原因之一。因此，要擴(kuò)大現(xiàn)有品種的遺傳多樣性水平，根本在于豐富育種核心親本的多樣性水平，創(chuàng)新和挖掘新的優(yōu)良核心種質(zhì)資源。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)東北三省水稻育種核心親本中，以黑龍江省材料的遺傳多樣性略高于吉林和遼寧兩省，這與李紅宇等[8]的研究結(jié)果類似，但與王海澤[31]研究結(jié)果存在差異，分析原因可能與樣本材料的類型和數(shù)量有關(guān)。

3.3 東北水稻核心親本的秈粳分化

自20世紀(jì)50年代楊守仁在遼寧省開展秈粳雜交育種研究以來(lái)，中國(guó)東北稻區(qū)育種家利用秈粳雜交技術(shù)，在粳稻中引入秈稻血緣，拓寬東北粳稻遺傳基礎(chǔ)，培育出理想株型與優(yōu)勢(shì)利用相結(jié)合的超級(jí)稻品種取得了重大突破[32-36]。由于秈稻與粳稻對(duì)溫度、光照的響應(yīng)存在差異，明確秈稻血緣在東北水稻中的含量變化，對(duì)于東北粳稻中秈稻血緣的利用具有重要指導(dǎo)意義。劉丹等[14]研究表明，東北地區(qū)近年來(lái)育成的粳型超級(jí)稻品種均含有一定的秈型血緣，且隨著時(shí)間的推進(jìn)，近現(xiàn)代以來(lái)育成品種的秈型基因頻率逐漸增加。劉迪等[37]研究也指出，20世紀(jì)80年代后秈粳雜交育種實(shí)踐引入的秈稻基因不僅豐富了東北粳稻的遺傳構(gòu)成，而且“適量”秈稻血緣的應(yīng)用對(duì)今后北方粳稻育種有重要作用。本研究結(jié)果表明，東北三省水稻育種核心親本存在秈粳分化，20份參試核心親本均為粳稻類型，但都含有秈型血緣。對(duì)東北三省不同地區(qū)核心親本的秈型基因頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三省核心親本秈型基因頻率Fx大小趨勢(shì)為：吉林省>遼寧省>黑龍江省，這可能與吉林省的特殊地理位置和氣候條件有關(guān)。

綜上所述，核心親本在東北水稻育種工作中發(fā)揮著極其重要的作用。今后，如何更好地拓寬水稻育種核心親本的遺傳背景，挖掘新的核心親本資源，推進(jìn)品種的更替，是擺在我們面前的一項(xiàng)重要工作，也是解決東北水稻種子“卡脖子”技術(shù)難題的關(guān)鍵所在。